Precipitazione delle proteine con solfato di ammonio: La chiave per salare

La precipitazione con sale può essere uno strumento molto potente per purificare le proteine per precipitazione. Il solfato di ammonio è di solito il sale di scelta poiché è economico, molto solubile in acqua, ed è in grado di diventare molto più idratato (interagisce con più molecole d’acqua) di quasi tutti gli altri solventi ionici. In pratica, il solfato di ammonio viene aggiunto direttamente come solido o aggiunto come soluzione (di solito) satura per precipitare le proteine desiderate.

A basse concentrazioni di sale (<0.15M) l’aggiunta di più sale in generale tende ad aumentare la solubilità delle proteine in quanto gli ioni proteggono le molecole proteiche dalle cariche di altre molecole; questa tendenza è definita ‘salting-in’. A un certo punto la forza ionica diventa troppo alta e comincia ad avere un effetto negativo sulla solubilità delle proteine, chiamata “salting-out”. Questo accade perché il sale disciolto compete con le proteine per le scarse molecole d’acqua, aumentando la tensione superficiale dell’acqua e quindi inducendo le proteine a ripiegarsi più strettamente. La riduzione dell’area superficiale delle proteine significa meno interazioni proteina-acqua che permette più interazioni idrofobiche tra le molecole proteiche, causando l’aggregazione e successivamente la precipitazione.

Le proteine in soluzione possono anche essere frazionate poiché precipitano in funzione della concentrazione di sale. In questo modo è possibile purificare proteine specifiche aggiungendo una quantità specifica di solfato di ammonio per far precipitare le proteine non desiderate, recuperando il surnatante, e poi aggiungendo un po’ più di solfato di ammonio per far precipitare le proteine desiderate e poi salvare quel pellet di proteine precipitate. Poiché la precipitazione salina influisce solo sulla solubilità delle proteine e non le denatura, la frazione recuperata può essere conservata nella soluzione salina per lunghi periodi di tempo senza doversi preoccupare della contaminazione batterica poiché l’alto contenuto di sale inibisce qualsiasi crescita microbica o attività proteasica.

Perché la precipitazione del solfato di ammonio riduce solo la solubilità delle proteine e non le denatura, le proteine possono essere concentrate rimuovendo la soluzione di solfato di ammonio rimanente, quindi il pellet di proteine può essere risolubilizzato in tamponi standard o in una concentrazione inferiore di solfato di ammonio. La cromatografia per interazione idrofobica o la cromatografia per filtrazione su gel possono quindi essere utilizzate per purificare ulteriormente la soluzione proteica. Solfato di ammonio può essere utilizzato anche per guidare alcune proteine dispiegato da denaturanti come urea indietro al loro corretto conformazioni native aumentando gradualmente la concentrazione di solfato di ammonio.

Ci sono alcune pratiche migliori che dovrebbero essere considerati quando si lavora con solfato di ammonio come:

• Utilizzare un mortaio e pestello per rompere i grumi e altrimenti macinare il solfato di ammonio per facilitare l’aggiunta e dissoluzione.
• Aggiungere solo una piccola quantità di solfato di ammonio alla volta, attendere che si dissolva e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
• Utilizzare un tampone come 50 mM HEPES o Tris per ridurre al minimo la natura acidificante del solfato di ammonio.
• Utilizzare solfato di ammonio di grado analitico poiché i gradi inferiori presentano tipicamente una contaminazione da metalli pesanti.

Il processo di precipitazione del sale presenta alcuni svantaggi. La salatura delle proteine richiede una conoscenza preliminare della solubilità della proteina. Inoltre, qualsiasi contaminante presente nel campione iniziale può essere ancora presente nella frazione contenente la proteina di interesse; questo processo concentra la proteina ma non la purifica. Inoltre, potrebbe essere necessario rimuovere il sale dal campione proteico e quindi sarà necessario un ulteriore trattamento sotto forma di dialisi o cromatografia.

Postini del blog correlati

• Quali tecniche di precipitazione delle proteine vengono utilizzate per la concentrazione e la pulizia?
• Tecniche di estrazione e precipitazione delle proteine vegetali