Precipitazione PEG: Uno strumento potente per la purificazione degli anticorpi monoclonali

Il metodo di cattura del pellet ha dimostrato di avere un impatto significativo sulla purezza del prodotto ridisciolto. La fase di precipitazione è facilmente scalabile e si adatta a un processo a valle completamente monouso.

Percivia LLC

Sono in corso sforzi per identificare alternative alla cromatografia a letto imballato per ridurre i tempi e i costi di trattamento dei flussi di prodotti ad alto titolo. Anche se molti sforzi si concentrano sugli adsorbitori a membrana che sostituiscono direttamente le colonne della stessa chimica o di chimica simile, alcune vecchie tecnologie stanno cominciando a guadagnare terreno nella produzione di proteine ricombinanti. Un’alternativa attraente alla cromatografia è la precipitazione, che è stata usata nell’industria delle proteine plasmatiche per molti anni.1 Un semplice metodo di precipitazione comporta la titolazione del fluido di processo al punto isoelettrico della proteina che deve essere precipitata.2 Anche i sali liotropici, come il solfato di ammonio, hanno una lunga storia di utilizzo nei processi di precipitazione.3 Gli acidi grassi a catena corta, come l’acido caprilico, sono ben noti per la loro capacità di precipitare il DNA e le proteine della cellula ospite (HCP).4 Anche le specie polioniche sono utili precipitanti per catturare un prodotto di interesse o per rimuovere le proteine contaminanti.5,6

Il polietilenglicole (PEG) è stato utilizzato per la precipitazione del prodotto e delle impurità.7,8 Può anche essere combinato con la precipitazione isoelettrica per migliorare l’efficienza della separazione.9,10 Dopo la precipitazione, la centrifugazione o la filtrazione possono essere utilizzate per eseguire la separazione solido-liquido.11 Anche se la centrifugazione è un metodo consolidato per ottenere questa separazione, il lavaggio del pellet del prodotto per rimuovere le impurità potrebbe essere problematico, e non è adatto a un processo monouso. La filtrazione – a flusso normale o tangenziale – richiede più sviluppo, ma il lavaggio del pellet è più semplice ed è facilmente adattabile a un processo monouso.

Nel presente lavoro, è stata sviluppata una fase di precipitazione del prodotto utilizzando il PEG per recuperare un anticorpo monoclonale (MAb) dai mezzi di coltura cellulare PER.C6 chiarificati. Le condizioni di precipitazione appropriate sono state identificate attraverso l’uso di disegni sperimentali fattoriali completi. Sono state valutate due fasi di filtrazione per la cattura e il lavaggio del prodotto precipitato, e il metodo superiore è stato scalato di 10 volte. Il processo di precipitazione totale ha portato a rendimenti di circa il 90% e a una riduzione dell’HCP di 1 LRV senza un aumento significativo del livello aggregato del MAb ridisciogliuto. Infine, è stato studiato l’impatto della fase di precipitazione sulla successiva fase di cattura a scambio cationico (CEX).

Materiali e metodi Reagenti

Sali di grado USP, Tween 20, acido cloridrico, acido acetico e idrossido di sodio sono stati acquistati da JT Baker (Phillipsburg, NJ). Il PEG era di grado reagente e acquistato da JT Baker o EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Tutti i tamponi sono stati preparati utilizzando acqua di grado MilliQ (Millipore, Billerica, MA) e sono stati filtrati da 0,22-µm prima dell’uso.

Feedstock

Un MAb umano (IgG1, pI = 8.3, 150 kDa) è stato prodotto da Percivia, LLC usando una linea cellulare PER.C6. Le cellule PER.C6 sono cellule retiniche embrionali umane immortalizzate dal gene adenovirus E1, come descritto nel brevetto USA 5,994,128.12 Le cellule sono state coltivate in un processo standard fed-batch o nel processo XD, entrambi utilizzando mezzi chimicamente definiti.13,14 I mezzi fed-batch sono stati chiarificati mediante sedimentazione e filtrazione di profondità, mentre i mezzi XD sono stati chiarificati con il metodo ECS (enhanced cell settling) seguito da filtrazione di profondità.15 Durante l’ECS, è stata utilizzata la resina Silica-PEI per migliorare la sedimentazione delle cellule e ridurre il DNA e l’HCP.

Ottimizzazione delle condizioni di precipitazione

Le condizioni utilizzate per precipitare il MAb-PEG peso molecolare, la concentrazione di PEG, e il pH-sono stati ottimizzati da disegni sperimentali fattoriali completi utilizzando Minitab software (State College, PA). Il pH dei mezzi chiarificati XD è stato regolato al livello desiderato con 2-M Tris in una provetta conica da 15 ml. Il PEG è stato aggiunto come soluzione stock al 40% (w/w) alla concentrazione finale desiderata. La provetta è stata poi centrifugata a 1.000g e il surnatante decantato. Infine, il pellet è stato ridisciogliuto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

Cattura del pellet per filtrazione di profondità o microfiltrazione

La filtrazione di profondità è stata eseguita con vari gradi di mezzi filtranti. Millistak+HC D0HC, C0HC e X0HC sono stati acquistati da Millipore Corp. (Billerica, MA), e ZetaPlus 60SP02A è stato acquistato da Cuno (Meriden, CT). La precipitazione è stata effettuata utilizzando una soluzione stock di PEG-3350 al 40% (w/w) e i mezzi precipitati sono stati caricati con un flusso di alimentazione di 50 L/m2 /h fino a quando tutto il materiale è stato caricato o la pressione di transmembrana (TMP) era di 15 psid. I filtri sono stati poi lavati con 20-30 L/m2 di 20 mM Tris pH 8.5 + 14.4% (w/w) PEG-3350. Dopo il lavaggio, 80 L/m2 di buffer resolubilization è stato fatto passare attraverso i filtri a 100 L/m2 /h, e il permeato è stato ricircolato attraverso il dispositivo a 600 L/m2 /h fino a quando il A280 del pool permeato era stabile indicando completa dissoluzione MAb. Infine, qualsiasi prodotto trattenuto è stato recuperato con un risciacquo del buffer da 20 L/m2 e lo spurgo dell’aria del modulo del filtro. In alcuni test, il mezzo filtrante è stato successivamente lavato con 85-mM acetato pH 5.3 seguito da 1-M NaCl. I dati di pressione e flusso sono stati raccolti utilizzando un sistema personalizzato progettato da ARC Technology Services (Nashua, NH).

La microfiltrazione è stata eseguita con una membrana a fibra cava da 0,22 µm della GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). Il PEG-3350 è stato aggiunto come soluzione stock al 40% (w/w) per l’esperimento su piccola scala e in polvere per il lavoro di scale-up. Il flusso di alimentazione era di 710 L/m2 /h e il retentato e il permeato erano senza restrizioni. Il precipitato è stato prima concentrato da 10 a 14 volte e poi lavato con tre volumi di diafiltrazione di 20 mM Tris pH 8.5 più 14.4% (w/w) PEG-3350. Infine, il precipitato è stato ridisciogliuto in 85 mM acetato di sodio pH 5.3 o 20 mM Tris più 50 mM NaCl pH 7.5. Pressione, flusso e dati di conducibilità sono stati raccolti utilizzando un sistema da banco Slice 200 (Sartorius, Gottingen, Germania) per i test su piccola scala e un sistema SciPro (SciLog, Middleton, WI) per l’esperimento di scale-up.

Cromatografia a scambio cationico

Toyopearl GigaCap S-650 è stato procurato da Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) nel formato Toyoscreen 5-mL. Questa resina è stato precedentemente dimostrato come un passo ad alta capacità di cattura per MAbs.16 La colonna è stata equilibrata con 74-mM acetato di sodio pH 5,3 e caricato a 90-95 mg-MAb / mL-resina utilizzando mezzi chiarificati o chiarificati e PEG-trattato materiale, ciascuno regolato allo stesso pH e conducibilità come il buffer di equilibrio. La colonna è stata poi lavata con il tampone di equilibrio e l’anticorpo è stato eluito con 50 mM di acetato di sodio pH 5.3 più 90 mM NaCl.

Tecniche analitiche

La concentrazione di MAb nei campioni contenenti media è stata determinata mediante HPLC analitico Protein A (Applied Biosystems, Foster City, CA). I livelli di aggregati sono stati misurati mediante cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) utilizzando una colonna TSKgel G3000SWXL della Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), con rilevazione dei picchi mediante assorbanza UV a 280 nm. I livelli di HCP sono stati quantificati da un ELISA specifico PER.C6 della Cygnus Technologies (Southport, NC). La SDS-PAGE è stata eseguita con NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels e la colorazione è stata fatta con SimplyBlue SafeStain, entrambi della Invitrogen (Carlsbad, CA).

Risultati e condizioni di discussione Precipitazione

Per entrambi i pesi molecolari di PEG, 3.350 e 6.000 Da, la concentrazione di PEG era il fattore dominante nel recupero e la purezza del MAb ridisciogliuto. La precipitazione con PEG-3350 ha portato al più alto recupero (Figura 1). Tuttavia, il recupero più elevato è venuto a scapito di un maggiore carico di HCP nel MAb ridisciogliuto. Nel caso di MAb aggregati, i livelli non erano significativamente diversi dal materiale di partenza, ma va notato che il particolare MAb usato in questo lavoro non è incline a formare aggregati. Il miglioramento della riduzione di HCP con l’uso di PEG-6000 è stato compensato dalla riduzione della resa del prodotto. La condizione finale selezionata era 14% (w/v) PEG-3350 (equivalente al 14,4% w/w) e pH 8,5.

Figura 1

Cattura del pellet per filtrazione in profondità

Nel primo esperimento, i media ECS-clarificati XD sono stati precipitati e il pellet è stato catturato per filtrazione in profondità con media X0HC. Nessun aumento sostanziale della pressione transmembrana (TMP) è stato osservato durante il caricamento di 361 g-MAb/m2 (dati non mostrati). Dopo il lavaggio, la risolubilizzazione del pellet immobilizzato è stata fatta con 85 mM acetato pH 5.3. Anche dopo la ricircolazione per 2 ore, l’anticorpo non era completamente ridissolto, quindi 0,1% v/v Tween 20 è stato aggiunto al buffer di risoluzione. Dopo altri 30 minuti di risolubilizzazione, il MAb era completamente sciolto.

Tabella 1. Resa e rimozione delle impurità per l’operazione di precipitazione PEG utilizzando la filtrazione di profondità con X0HC per recuperare il prodotto

I dati del bilancio di massa sono riassunti nella tabella 1. La riduzione di HCP è stata inferiore a quella dell’esperimento precedente (Figura 1), dove solo 5.000 ppm di HCP erano presenti nel pool finale rispetto alle 8.300 ppm di questo esperimento. Alcuni filtri di profondità, tuttavia, sono noti per avere caratteristiche idrofobiche e di scambio anionico (AEX) adsorbente.17 Il mezzo precipitato è stato caricato ad un pH relativamente alto (8,5) e bassa conducibilità (<10 mS/cm), che può aver indotto il legame delle proteine acide su una matrice AEX. Inoltre, in presenza di PEG, è stato dimostrato che la capacità di legare le proteine delle matrici a scambio ionico aumenta.18,19 Pertanto, è probabile che alcuni degli HCP rimasti in soluzione dopo la precipitazione si siano legati al mezzo filtrante di profondità e siano eluiti nel prodotto durante la risolubilizzazione. Questa ipotesi è supportata anche dalla differenza nel contenuto di HCP del surnatante di precipitazione e del flow-through del filtro di profondità (9.900 contro 240 mg) che indica la rimozione degli HCP dalla soluzione da parte del filtro di profondità. Dopo l’immobilizzazione dell’anticorpo sul filtro di profondità, è stato ridisciogliuto a un pH significativamente più basso (5,3) con conseguente eluizione dell’HCP legato e riduzione della purezza del prodotto finale. Questo fenomeno potrebbe essere mitigato utilizzando mezzi di filtraggio di profondità meno adsorbenti, come i filtri Millistak+HC D0HC/C0HC e ZetaPlus SP come il 60SP02A, o ridisciogliendo il prodotto in un tampone a basso sale e a pH più alto, come il Tris 20-mM a pH 7,5.

Figura 2

Queste strategie sono state testate caricando i media precipitati su filtri D0HC, C0HC, X0HC e 60SP02A. Tutti i filtri sono stati lavati in modo identico con il buffer PEG/Tris, ma la risolubilizzazione è stata fatta con 20 mM Tris pH 7.5 più Tween 20 per i filtri Millipore e 85 mM acetato pH 5.3 più Tween 20 per il filtro Cuno. I filtri Millipore sono stati anche strippati con un tampone a basso pH (85 mM acetato pH 5.3) e alto sale (1 M NaCl) dopo che il prodotto è stato recuperato per determinare se eventuali HCP legati potevano essere eluiti. La figura 2 mostra che c’era un sostanziale intasamento di tutti i filtri testati. Poiché i mezzi di alimentazione non sono stati chiariti con il metodo ECS, che ha dimostrato di ridurre significativamente i livelli di DNA nei raccolti XD, ci può essere più DNA presente, che precipita in alte concentrazioni di PEG.20 Il maggiore contenuto di DNA nel precipitato può aver ridotto le capacità del filtro, ma questo non è stato studiato. La tabella 2 mostra che ciascuno degli esperimenti ha portato a una migliore riduzione di HCP (84-88% contro 46%), e anche se il carico di HCP di partenza era più alto (49.000 ppm contro 13.000 ppm), i pool di MAb ridisciogliuti avevano generalmente un contenuto di HCP inferiore (6.000-7.800 ppm contro 8.300 ppm). L’uso di filtri a basso assorbimento e la ridissoluzione in un tampone a pH più elevato sembrano risolvere il problema degli HCP che eluiscono dal supporto del filtro di profondità. La SDS-PAGE delle frazioni della striscia ha rivelato che sia gli HCP che il prodotto erano legati ai filtri, compresi i filtri D0HC e C0HC meno adsorbenti, e ha confermato che i mezzi X0HC erano più adsorbenti dei mezzi D0HC e C0HC (Figura 3).

Tabella 2. Rendimento e rimozione delle impurità per l’operazione di precipitazione PEG utilizzando la filtrazione di profondità con vari mezzi filtranti per recuperare il prodotto

Cattura di pellet tramite microfiltrazione

Anche se il carico di HCP del MAb ridisciogliato è stato ridotto utilizzando un buffer con un pH più alto e mezzi filtranti di profondità meno adsorbenti, le capacità dei filtri di profondità erano basse per i mezzi di alimentazione (<400 g-MAb/m2 ). La microfiltrazione (filtrazione a flusso tangenziale, MF TFF) è stata testata allo scopo di migliorare la capacità con l’ulteriore vantaggio di poter utilizzare qualsiasi tampone per la risolubilizzazione a causa della caratteristica di basso legame della fibra cava. Le prestazioni idrauliche della concentrazione MF TFF e del lavaggio del precipitato fed-batch sono mostrate nella Figura 4. Il flusso permeato era di circa 100 L/m2 /h e il TMP era tra 1.0 e 2.5 psid per l’intera operazione. Il carico di massa di 475 g-MAb/m2 era migliore di quello ottenuto in qualsiasi operazione di filtrazione in profondità. Il recupero del prodotto e la riduzione di HCP erano entrambi intorno al 90%, leggermente meglio di quello ottenuto nella filtrazione in profondità (tabella 3).

Figura 3

La risolubilizzazione è stata molto più semplice e veloce della filtrazione di profondità; piuttosto che far ricircolare il buffer attraverso il dispositivo, il buffer è stato pompato attraverso l’interno dei lumi nel recipiente del retentato con il permeato chiuso e lasciato mescolare per circa 60 minuti. Questo è stato sufficiente per ridissolvere l’anticorpo e non sono stati necessari eccipienti. A causa della difficoltà di risolubilizzazione con la filtrazione di profondità, il prodotto è stato ridisciogliuto a o vicino alla concentrazione nei media di alimentazione. Il pool finale dal processo MF TFF era quasi due volte più concentrato del materiale di partenza.

Figura 4

Perché il retentato e il permeato erano aperti alla pressione atmosferica, era necessaria una strumentazione minima: una pompa a flusso incrociato, un sensore di pressione e una pompa di trasferimento per la diafiltrazione. La combinazione di alta capacità, alto recupero e clearance HCP, e la semplicità operativa rendono MF TFF un’opzione preferibile per la cattura del pellet rispetto alla filtrazione di profondità. La fase di precipitazione e MF TFF è stata scalata di 10 volte fino a un dispositivo a fibra cava di 0,12 m2, e le prestazioni sono state paragonabili alla piccola scala (Tabella 4).

Tabella 3. Rendimento e rimozione delle impurità per l’operazione di precipitazione con PEG utilizzando la microfiltrazione per recuperare il prodotto su scala di banco

Cromatografia a scambio cationico

La cromatografia a scambio cationico (CEX) ad alta capacità è stata valutata con i mangimi pretrattati con o senza precipitazione con PEG. La fase di precipitazione non ha avuto alcun impatto significativo sulla resa della fase o sulla riduzione percentuale di HCP, ma l’eluato risultante dal materiale di carico precipitato aveva sette volte meno HCP (tabella 5).

Tabella 4. Rendimento e rimozione delle impurità per l’operazione di precipitazione PEG utilizzando la microfiltrazione per recuperare il prodotto su scala pilota

Conclusioni

La precipitazione è stata a lungo utilizzata nell’industria delle proteine del plasma per purificare le proteine su larga scala. La tecnica è stata adattata qui alla purificazione iniziale di MAb da mezzi chiarificati fed-batch e XD in modo scalabile. Due fasi di filtrazione monouso sono state sviluppate per catturare e lavare il prodotto precipitato, eliminando la necessità di centrifugazione. È stato dimostrato che l’operazione di precipitazione non ha influenzato negativamente la resa della fase di cattura del CEX, e ha ridotto il contenuto di HCP dell’eluato di un fattore sette.

Tabella 5. Resa e rimozione HCP per GigaCap S-650 caricato con anticorpo precipitato (+PEG) e non precipitato (âPEG)

La capacità di ridurre il carico di impurità così a monte nel treno di purificazione è fondamentale per troncare il processo a valle o sostituire la cromatografia tradizionale con altre tecnologie monouso. Un carico di impurità più basso può migliorare la capacità di carico degli adsorbitori a membrana flow-through ed eventualmente dei filtri antivirus, che sono generalmente elementi molto costosi in un processo.

Un ulteriore vantaggio è la capacità di ridissolvere l’anticorpo in un tampone che facilita la successiva operazione dell’unità. Per esempio, i mezzi di coltura cellulare richiedono tipicamente un’ampia titolazione e diluizione o un passo UF-DF per preparare la cromatografia di cattura con uno scambiatore di cationi. Qui, l’anticorpo precipitato può essere disciolto nel tampone di equilibratura ad alta concentrazione, accorciando così il tempo di lavorazione. Questo può essere importante per i prodotti che non tollerano una lunga esposizione a condizioni di basso pH/conduttività. Nel caso di questo particolare anticorpo, i mezzi chiarificati richiedono una diluizione più che doppia per essere caricati su una colonna CEX, mentre il MAb ridisciolto potrebbe essere caricato direttamente a quasi due volte la concentrazione dei mezzi non regolati. Si tratta di una riduzione di almeno quattro volte del volume di carico, che può comportare un notevole risparmio di tempo per le moderne resine CEX ad alta capacità.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare le scienze proteiche e analitiche di Percivia per il supporto del saggio in questo lavoro e il gruppo di sviluppo del processo a monte di Percivia per la fornitura dei mezzi di coltura cellulare.

Nota sui marchi

PER.C6 è un marchio registrato di Crucell Holland BV Corporation; XD è un marchio registrato di DSM NV; ed ECS è un marchio registrato di DSM NV. Tutti gli altri nomi di marchi sono marchi di fabbrica dei rispettivi proprietari.

MICHAEL KUCZEWSKI è scienziato I, EMILY SCHIRMER, PhD, è scienziato II, BLANCA LAIN, PhD, è scienziato senior e GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, è direttore senior, tutti nello sviluppo dei processi downstream, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

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