Ratto albino
Nei ratti albini adulti (Ortín-Martínez et al., 2015; Salinas-Navarro et al., 2010; Schnebelen et al., 2009; Valiente-Soriano et al., 2015b) così come nei topi albini adulti (Cuenca et al., 2010; Salinas-Navarro et al, 2009c) e pigmentati (Valiente-Soriano et al., 2015a) topi, OHT ha portato entro le prime 2 settimane nella perdita di circa l’80% della popolazione RGC identificati nella sinistra (laserato) retine con i traccianti retrogradi FG o OHSt applicato a entrambi SCi 1 settimana prima del trattamento degli animali. Queste retine hanno mostrato aree che erano quasi prive di RGC etichettate retrogradamente e hanno adottato la forma di settori a forma di torta con la loro base situata sulla periferia retinica e il loro apice verso il disco ottico; queste aree erano più frequenti nelle retine dorsali e variavano in dimensioni da un piccolo settore a uno o più quadranti retinici. Al contrario, le retine di destra (controllo non laserato) hanno mostrato una normale distribuzione di RGC (etichettate retrogradamente o immunocolorate con Brn3a) con densità più elevate nella striscia visiva, lungo l’asse nasotemporale nella retina dorsale, con un picco nel quadrante superotemporale, come precedentemente descritto (Nadal-Nicolás et al, 2009, 2012, 2014, 2015; Ortín-Martínez et al., 2010, 2014; Salinas-Navarro et al., 2009a,b). La costruzione di mappe di isodensità ha permesso l’esame dettagliato della distribuzione topologica di RGC superstiti in queste retine OHT (Figg. 2-4, 6, e 8). Abbiamo trovato variabilità nella gravità del danno retinico, e questo è in accordo con i rapporti precedenti da questo (Vidal-Sanz et al., 2012) e altri (Fu e Sretavan, 2010; Levkovitch-Verbin et al., 2002) laboratori. Inoltre, la variabilità nel grado di degenerazione è stata riportata anche in un modello di topo pigmentato ereditario di glaucoma sperimentale, i topi DBA/2J (Filippopoulos et al., 2006; Howell et al., 2007; Jakobs et al., 2005; Pérez de Lara et al., 2014; Schlamp et al., 2006; Soto et al., 2008). Oltre a questa perdita settoriale, le mappe di isodensità hanno rivelato anche una perdita diffusa, anche all’interno delle aree retiniche che mostravano RGC superstiti. Questa quantità di degenerazione retinica si è basata sulla quantificazione delle RGC etichettate con traccianti retrogradi applicati alla SCi 1 settimana prima del trattamento degli animali. Quando la popolazione sopravvissuta di RGC è stata identificata con destrano tetrametilrhodamine (DTMR), un tracciante che quando viene applicato al moncone oculare del ON orbitalmente transected diffonde passivamente verso i somata delle cellule, o con immunostaining Brn3a, c’era una chiara discrepanza tra il numero di RGC tracciato e il numero di DTMR + RGCs o Brn3a + RGCs nelle stesse retine. Il numero di Brn3a+RGCs era significativamente maggiore di quello delle RGC tracciate nei primi periodi dopo la LP ma non a intervalli di sopravvivenza di 5 settimane o più, indicando che nei primi periodi di tempo dopo l’OHT una grande popolazione di RGCs superstiti aveva perso il loro trasporto assonale retrogrado attivo (Agudo-Barriuso et al, 2013a; Vidal-Sanz et al., 2012); tale alterazione è stata precedentemente osservata in seguito ad altri tipi di lesioni retiniche o ON (Lafuente López-Herrera et al., 2002; McKerracher et al., 1990). Tuttavia, tra 1 e 5 settimane dopo la LP, il numero di Brn3a + RGCs diminuito significativamente, indicando che la perdita RGC era progressiva tra 1 e 5 settimane dopo LP.
Figura 2. L’ipertensione oculare induce la perdita di cellule gangliari retiniche ortotopiche e spostate. Mappe di tre retine rappresentative (uno per riga) che mostrano la distribuzione di retrogradamente tracciato ortotopico (oRGCs) (A, C, E) e spostato (dRGCs) (A′, C′, E′), e di Brn3a + oRGCs (B, D, F) o Brn3a + dRGCs (B′, D′, F′) in un ratto naïve (prima riga) o in ratti sperimentali (seconda e terza riga) 3 settimane dopo fotocauterizzazione laser dei vasi limbari e episclerale per indurre l’ipertensione oculare. L’isodensità (C-F) e loro vicini corrispondenti (C′-F′) mappe mostrano una perdita topologica parallela tra oRGCs e dRGCs (FG tracciato e Brn3a +), che è coerente con una compressione assonale prodotta a livello della testa del nervo ottico. Nella parte inferiore di ogni mappa è mostrato il numero di RGCs o dRGCs rappresentato. Colore (diverse tonalità di grigio nella versione di stampa) scala per le mappe di isodensità in (B) in basso a destra, per le mappe vicine in (A′). RE, occhio destro; LE, occhio sinistro; D, dorsale; V, ventrale; N, nasale; T, temporale. Barra della scala in (A) = 1 mm.
Figura 3. La perdita dopo OHT è selettiva per RGCs nel GCL. Mappe di isodensità da una retina rappresentativa sperimentale 15 giorni dopo la fotocauterizzazione laser delle vene perilimari ed episclerali, immunoreagite per Brn3a (A) e colorate con DAPI nello strato delle cellule gangliari (B). La mappa di isodensità Brn3a mostra un tipico settore retinico a forma di torta privo di RGCs in una retina sperimentale 15 giorni dopo la LP indotta OHT. La stessa retina mostra un gran numero di nuclei colorati con DAPI nelle aree prive di Brn3a + RGCs come si riflette nella mappa isodensità DAPI (B). In basso di ogni mappa: numero di cellule contate in quella retina. Densità colore (diverse tonalità di grigio nella versione di stampa) scala in A e B in basso a destra varia da 0 (viola (nero nella versione di stampa)) a ≥ 3500 RGCs/mm2 o ≥ 5000 DAPI + nuclei (rosso (grigio nella versione di stampa)), rispettivamente. (C-E) micrografie di potenza superiore dal riquadro in A, B mostrando Brn3 + RGC (C), calretinina + neuroni (D), e DAPI + nuclei (E) per illustrare che nei settori retinici con un numero ridotto di Brn3a + RGC c’erano un gran numero di DAPI + nuclei (E) molti dei quali sono spostati cellule amacrine (calretinina + neuroni, D) nella GCL. LE, occhio sinistro; D, dorsale; V, ventrale; N, nasale; T, temporale. Barra della scala per (A) e (B) = 1 mm. Barra della scala per (C-D) = 50 μm.
Figura 4. Aspetto normale dei vasi retinici nelle retine ipertese oculari. (A, A′) retina naïve etichettato retrogradamente con fluorogold (FG) applicato ad entrambi i collicoli superiori 1 settimana prima della lavorazione degli animali e la sua mappa corrispondente isodensità. (B) I vasi retinici immunostained con anticorpi RECA1 in un bianco e nero ricostruzione retinica wholemount. (C, D) Dettagli della retina (A), preso dal dorsotemporale (C) e inferotemporale (D) quadrante mostrando FG + RGCs (bianco), Brn3a + RGCs (rosso (nero nella versione di stampa)), e RECA1 + vasi (verde (grigio nella versione di stampa)). Nella retina naïve, c’è il trasporto assonale retrogrado competente (RAT) e i vasi retinici immunostained appaiono normali. Due settimane dopo la fotocauterizzazione laser dei vasi perilimbali ed episclerali, una retina oculare ipertesa mostra la tipica perdita del RAT nella retina dorsale lungo un ampio settore che va da 8 a 5 o ‘clock (E-E′). I vasi retinici, nella rappresentazione in bianco e nero (F), appaiono normali e morfologicamente simili alla retina naïve di controllo. Questi sono anche osservati nell’ingrandimento preso da una zona senza RAT (G) o con RAT (H). D, dorsale; V, ventrale; T, temporale; N, nasale.