Sequenziamento del bisolfito

Il sequenziamento del bisolfito applica metodi di sequenziamento di routine sul DNA genomico trattato con bisolfito per determinare lo stato di metilazione ai dinucleotidi CpG. Altre strategie non di sequenziamento sono anche impiegate per interrogare la metilazione in loci specifici o a livello di genoma. Tutte le strategie presuppongono che la conversione indotta dal bisolfito delle citosine non metilate in uracile sia completa, e questo serve come base di tutte le tecniche successive. Idealmente, il metodo usato dovrebbe determinare lo stato di metilazione separatamente per ogni allele. I metodi alternativi al sequenziamento con bisolfito includono l’analisi di restrizione con bisolfito combinato e l’immunoprecipitazione del DNA metilato (MeDIP).

Le metodologie per analizzare il DNA trattato con bisolfito sono in continuo sviluppo. Per riassumere queste metodologie in rapida evoluzione, sono stati scritti numerosi articoli di revisione.

Le metodologie possono essere generalmente suddivise in strategie basate sulla PCR metilazione-specifica (MSP) (Figura 4), e strategie che impiegano la reazione a catena della polimerasi (PCR) eseguita in condizioni non metilazione-specifiche (Figura 3). I metodi basati sui microarray utilizzano anche la PCR basata su condizioni non specifiche per la metilazione.

Metodi basati sulla PCR non specifica per la metilazioneModifica

Figura 3: Metodi di analisi della metilazione del DNA non basati sulla PCR specifica per la metilazione. Dopo la conversione del bisolfito, il DNA genomico viene amplificato con una PCR che non discrimina tra sequenze metilate e non metilate. I numerosi metodi disponibili sono quindi utilizzati per fare la discriminazione basata sui cambiamenti all’interno dell’amplicone come risultato della conversione del bisolfito.

Sequenziamento direttoModifica

Il primo metodo riportato di analisi di metilazione utilizzando il DNA trattato con bisolfito ha utilizzato la PCR e il sequenziamento standard del DNA dideossinucleotide per determinare direttamente i nucleotidi resistenti alla conversione del bisolfito. I primer sono progettati per essere filamento-specifici così come bisolfito-specifici (cioè, primer contenenti citosine non-CpG tali da non essere complementari al DNA non trattato con bisolfito), fiancheggiando (ma non coinvolgendo) il sito di metilazione di interesse. Pertanto, amplificherà sia le sequenze metilate che quelle non metilate, in contrasto con la PCR metilazione-specifica. Tutti i siti di citosine non metilate vengono visualizzati come timine nella sequenza amplificata risultante del filamento senso, e come adenine nel filamento antisenso amplificato. Incorporando adattatori per il sequenziamento ad alta velocità nei primer della PCR, i prodotti della PCR possono essere sequenziati con un sequenziamento parallelo massiccio. In alternativa, e con grande dispendio di lavoro, il prodotto della PCR può essere clonato e sequenziato. I metodi di PCR annidati possono essere utilizzati per migliorare il prodotto per il sequenziamento.

Tutte le successive tecniche di analisi della metilazione del DNA utilizzando il DNA trattato con bisolfito si basa su questa relazione di Frommer et al. (Figura 2). Anche se la maggior parte delle altre modalità non sono vere e proprie tecniche basate sul sequenziamento, il termine “sequenziamento bisolfito” è spesso usato per descrivere bisolfito-conversione tecniche di analisi di metilazione del DNA in generale.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing è stato utilizzato anche per analizzare il DNA trattato con bisolfito senza utilizzare metilazione-specifica PCR. Dopo l’amplificazione PCR della regione di interesse, il pirosequenziamento viene utilizzato per determinare la sequenza convertita in bisolfito di specifici siti CpG nella regione. Il rapporto di C-to-T nei singoli siti può essere determinato quantitativamente in base alla quantità di incorporazione di C e T durante l’estensione della sequenza. La principale limitazione di questo metodo è il costo della tecnologia. Tuttavia, il pirosequenziamento consente bene l’estensione a metodi di screening ad alta produttività.

Un ulteriore miglioramento di questa tecnica è stato recentemente descritto da Wong et al., che utilizza primer allele-specifici che incorporano polimorfismi a singolo nucleotide nella sequenza del primer di sequenziamento, permettendo così l’analisi separata degli alleli materni e paterni. Questa tecnica è di particolare utilità per l’analisi dell’imprinting genomico.

Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA)Edit

Questo metodo è basato sull’analisi del polimorfismo di conformazione a singolo filamento (SSCA) metodo sviluppato per l’analisi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP). SSCA differenzia tra frammenti di DNA a singolo filamento di dimensioni identiche ma con sequenza distinta, basandosi sulla migrazione differenziale nell’elettroforesi non denaturante. In MS-SSCA, questo viene utilizzato per distinguere tra bisolfito-trattato, PCR-amplificato regioni contenenti i siti CpG di interesse. Sebbene SSCA manchi di sensibilità quando è presente solo una differenza di un singolo nucleotide, il trattamento con bisolfito effettua frequentemente un certo numero di conversioni C-to-T nella maggior parte delle regioni di interesse, e la sensibilità risultante si avvicina al 100%. MS-SSCA fornisce anche un’analisi semi-quantitativa del grado di metilazione del DNA basata sul rapporto delle intensità di banda. Tuttavia, questo metodo è progettato per valutare tutti i siti CpG come un intero nella regione di interesse piuttosto che singoli siti di metilazione.

Analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM)Edit

Un ulteriore metodo per differenziare il DNA bisolfito convertito da quello non convertito è utilizzando l’analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM), una tecnica quantitativa basata su PCR inizialmente progettato per distinguere SNPs. Gli ampliconi della PCR sono analizzati direttamente dalla rampa di temperatura e dalla conseguente liberazione di un colorante fluorescente intercalante durante la fusione. Il grado di metilazione, rappresentato dal contenuto C-to-T nell’amplicone, determina la rapidità della fusione e il conseguente rilascio del colorante. Questo metodo permette la quantificazione diretta in una singola provetta, ma valuta la metilazione nella regione amplificata nel suo complesso piuttosto che in specifici siti CpG.

Methylation-sensitive primer single-nucleotide estensione (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE impiega il metodo di estensione primer inizialmente progettato per l’analisi di polimorfismi a singolo nucleotide. Il DNA viene convertito in bisolfito, e i primer bisolfito-specifici vengono annebbiati alla sequenza fino alla coppia di basi immediatamente prima del CpG di interesse. Al primer viene permesso di estendere una coppia di basi nella C (o T) usando dideossinucleotidi terminanti la DNA polimerasi, e il rapporto tra C e T viene determinato quantitativamente.

Per determinare questo rapporto C:T possono essere usati diversi metodi. All’inizio, la MS-SnuPE si basava su ddNTP radioattivi come reporter dell’estensione del primer. Possono essere utilizzati anche metodi basati sulla fluorescenza o il pirosequenziamento. Tuttavia, l’analisi di spettrometria di massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight) per differenziare tra i due prodotti polimorfici di estensione del primer può essere utilizzata, in sostanza, sulla base del saggio GOOD progettato per la genotipizzazione SNP. La cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa a coppia di ioni (IP-RP-HPLC) è stata utilizzata anche per distinguere i prodotti di estensione del primer.

Scissione base-specifica/MALDI-TOFEdit

Un metodo recentemente descritto da Ehrich et al. sfrutta ulteriormente le conversioni bisolfite aggiungendo un passo di scissione base-specifica per migliorare le informazioni ottenute dai cambiamenti nucleotidici. Utilizzando prima la trascrizione in vitro della regione di interesse in RNA (con l’aggiunta di un sito promotore di RNA polimerasi al primer PCR nell’amplificazione iniziale), RNasi A può essere utilizzato per tagliare il trascritto RNA in base-specifici siti. Poiché la RNasi A scinde l’RNA specificamente ai ribonucleotidi di citosina e uracile, la base-specificità si ottiene aggiungendo dTTP resistente alla scissione quando si desidera la scissione specifica per la citosina (C-specifica), e incorporando dCTP quando si desidera la scissione specifica per l’uracile (U-specifica). I frammenti scissi possono poi essere analizzati con MALDI-TOF. Bisolfito risultati di trattamento sia l’introduzione / rimozione di siti di scissione da C-to-U conversioni o spostamento in massa frammento da G-to-A conversioni nel filamento amplificato inversa. La scissione C-specifica taglierà specificamente tutti i siti CpG metilati. Analizzando le dimensioni dei frammenti risultanti, è possibile determinare il modello specifico di metilazione del DNA dei siti CpG all’interno della regione, piuttosto che determinare il grado di metilazione della regione nel suo complesso. Questo metodo ha dimostrato l’efficacia per lo screening ad alta produttività, consentendo l’interrogazione di numerosi siti CpG in più tessuti in un modo efficiente in termini di costi.

Methylation-specific PCR (MSP)Edit

Figura 4: Methylation-specific PCR è un metodo sensibile per amplificare in modo discriminante e rilevare una regione metilata di interesse utilizzando primer metilato-specifici su DNA genomico convertito con bisolfito. Tali primer si anneriscono solo alle sequenze che sono metilate, e quindi contenenti 5-metilcitosine che sono resistenti alla conversione da bisolfito. In modo alternativo, possono essere utilizzati primer specifici non metilati.

Questo metodo alternativo di analisi della metilazione utilizza anche il DNA trattato con bisolfito ma evita la necessità di sequenziare l’area di interesse. Invece, le coppie di primer sono progettate per essere “metilato-specifiche” includendo sequenze che completano solo le 5-metilcitosine non convertite, o, al contrario, “non metilato-specifiche”, completando le timine convertite dalle citosine non metilate. La metilazione è determinata dalla capacità del primer specifico di ottenere l’amplificazione. Questo metodo è particolarmente utile per interrogare le isole CpG con possibile alta densità di metilazione, poiché un numero maggiore di coppie CpG nel primer aumenta la specificità del test. Posizionare la coppia CpG all’estremità 3′ del primer migliora anche la sensibilità. Il rapporto iniziale utilizzando MSP ha descritto una sensibilità sufficiente per rilevare la metilazione dello 0,1% degli alleli. In generale, MSP e i suoi protocolli correlati sono considerati i più sensibili quando si interroga lo stato di metilazione in un locus specifico.

Il metodo MethyLight è basato su MSP, ma fornisce un’analisi quantitativa utilizzando la PCR quantitativa. Vengono utilizzati primer specifici per il metilato e una sonda reporter a fluorescenza specifica per il metilato che si annerisce alla regione amplificata. In modo alternativo, i primer o la sonda possono essere progettati senza specificità di metilazione se è necessaria una discriminazione tra le coppie CpG all’interno delle sequenze coinvolte. La quantificazione è fatta in riferimento ad un DNA di riferimento metilato. Una modifica a questo protocollo per aumentare la specificità della PCR per successo bisolfito-convertito DNA (ConLight-MSP) utilizza una sonda supplementare per bisolfito-unconvertito DNA per quantificare questa amplificazione non specifica.

Ulteriore metodologia utilizzando MSP-amplificato DNA analizza i prodotti utilizzando analisi della curva di fusione (Mc-MSP). Questo metodo amplifica il DNA convertito in bisolfito con primer specifici per il metilato e non specifici per il metilato, e determina il rapporto quantitativo dei due prodotti confrontando i picchi differenziali generati in un’analisi della curva di fusione. Un metodo di analisi di fusione ad alta risoluzione che utilizza sia la PCR quantitativa che l’analisi di fusione è stato introdotto, in particolare, per la rilevazione sensibile della metilazione di basso livello

Metodi basati su microarrayEdit

I metodi basati su microarray sono una logica estensione delle tecnologie disponibili per analizzare il DNA trattato con bisolfito per consentire l’analisi della metilazione su tutto il genoma. I microarray oligonucleotidici sono progettati utilizzando coppie di sonde di ibridazione oligonucleotidiche che prendono di mira i siti CpG di interesse. Uno è complementare alla sequenza inalterata metilata, e l’altro è complementare alla sequenza non metilata convertita C-to-U. Le sonde sono anche bisolfito-specifiche per evitare di legarsi al DNA convertito in modo incompleto dal bisolfito. L’Illumina Methylation Assay è uno di questi test che applica la tecnologia di sequenziamento del bisolfito a livello di microarray per generare dati di metilazione su tutto il genoma.