Studio comparativo dell’effetto della baicalina e dei suoi analoghi naturali sui neuroni con privazione di ossigeno e glucosio che coinvolge la reazione immunitaria innata di TLR2/TNF𝛼

Abstract

Questo lavoro è quello di studiare la baicalina e i suoi tre analoghi, baicalina, wogonoside e wogonin, sull’effetto protettivo del neurone dalla privazione di ossigeno-glucosio (OGD) e sull’espressione del recettore toll-like 2 (TLR2) nel danno OGD. I risultati hanno mostrato che la baicalina e i suoi tre analoghi hanno protetto i neuroni dai danni dell’OGD e hanno abbassato il livello proteico di TLR2. L’acido D-Glucopiranosiduronico sul sito 7 della struttura ha giocato un ruolo centrale nella citotossicità di questi analoghi flavonoidi. Il gruppo metossile sul carbonio 8 della struttura aveva la relazione con l’espressione della proteina TLR2, così come l’anti-infiammazione. Inoltre, abbiamo rilevato la caspasi3 e la capacità di antiossidazione, per indagare l’effetto dei quattro analoghi sull’apoptosi cellulare e la competenza totale di antiossidazione nel modello OGD.

1. Introduzione

Scutellariae radix, una medicina cinese, ha vari effetti farmacologici come antibatterico, antivirus, antinfiammatorio, antiossidazione, e antistupro in clinica. Il suo ingrediente attivo è un tipo di flavoni, composto da baicalina, baicaleina, wogonin, e wogoniside brevemente (Figura 1) . È stato riportato che Scutellariae radix protegge i neuroni dal danno di ischemia e riperfusione. La baicalina, il componente principale dei flavoni, è stato confermato con la neuroprotezione del danno da ischemia e riperfusione e l’azione sul sistema nervoso centrale. Recentemente, la baicaleina è stata studiata con un promettente effetto di neuroazione su più siti. Tuttavia, nessun rapporto ha presentato l’effetto della baicalina e l’espressione di TLR2 sui neuroni. Alcune ricerche hanno riportato che la wogonina e il wogonoside hanno agito sui neuroni. La baicalina e la baicaleina sono state studiate come antiossidanti; in alcuni modelli la baicaleina è stata anche più forte della baicalina nel ridurre diversi redivivi liberi. Confrontandoli, la baicaleina e la baicalina hanno attenuato significativamente il danno cellulare indotto dal perossido di idrogeno, mentre la wogonina e il wogonoside hanno agito più debolmente. Si suggerisce che ci devono essere altri meccanismi di wogonin e wogonoside sulla neuroprotezione.

Figura 1

Strutture chimiche di baicalin e dei suoi analoghi naturali, baicalein, wogonoside e wogonin.

Come l’antinfiammatorio della baicalina e della baicaleina è stato confermato, le ricerche sulla risposta immunitaria innata sono state studiate nella riperfusione dell’ischemia cerebrale e hanno presentato la ragione in parte perché l’antinfiammatorio della baicalina e della baicaleina era uno dei saggi principali per la protezione del cervello dal danno da ischemia riperfusione. Diversi recettori sono stati indicati come i bersagli chiave del danno da riperfusione ischemica nella glia, come i toll like receptors (TLRs) e i NODs (nucleotide-binding oligomerisation domain). Il nostro precedente esperimento ha dimostrato che la baicalina ha attenuato l’espressione di NOD2 e TNFα nei neuroni con danno da ischemia e riperfusione in vivo e in vitro. Wogonoside è stato segnalato con l’inibizione dell’angiogenesi indotta dal lipopolisaccaride attraverso la trasduzione del segnale del toll-like receptor 4 (TLR4). Tuttavia, TLR2 non è stato studiato dalla baicalina e dai suoi analoghi naturali.

Sulla base delle informazioni precedentemente menzionate, abbiamo studiato il comportamento di regolazione della baicalina e dei suoi analoghi attraverso un tipo di cellula neuronale PC12 al fine di esplorare i possibili obiettivi della baicalina e dei suoi analoghi nelle reazioni immunitarie innate durante la privazione di ossigeno e glucosio (OGD) e le relazioni tra la struttura chimica e gli effetti della baicalina e dei suoi analoghi naturali. Poiché TLR2 è uno dei recettori iniziali nell’immunità innata e l’attivazione infiammatoria, così come il TNFα, possono essere inibiti dalla baicalina nelle cellule polmonari, l’espressione proteica di TLR2 e TNFα sono stati testati per scoprire il ruolo della baicalina e dei suoi analoghi in questi modelli di lesioni nervose. Nel frattempo, la caspasi3 è un noto indice di apoptosi, e diversi studi hanno riportato che alcuni flavoni potrebbero indurre l’apoptosi delle cellule infiammatorie, quindi abbiamo rilevato l’espressione della proteina caspasi3. Inoltre, l’effetto dei quattro analoghi sulla capacità totale di antiossidazione delle cellule nel modello OGD è stato anche rilevato in questo documento, che ha ulteriormente confrontato l’intera competenza di questi flavoni.

2. Materiali e metodi

2.1. Prodotti chimici e materiali

Baicalina (purezza 98%) è stata presentata dal Dr. Lujun Zhang, Laboratorio di Scienze Farmaceutiche, Tsinghua University. Il wogonoside (purezza 98%) è stato presentato dal Dr. Xiuwei Yang, Scuola di Scienze Farmaceutiche, Università di Pechino. La baicaleina e la wogonina, tutte con purezza del 98% (numero di lotto 111595-200604 e 111514-200403), sono state acquistate dal China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. L’acqua deionizzata è stata usata per tutto l’esperimento. Altri solventi organici e reagenti erano di grado analitico-reagente. Il tampone PBS con pH7.4 è stato preparato nel nostro laboratorio. Le cellule PC12 sono state fornite dalla Banca delle cellule dell’Istituto di medicina fondamentale, Accademia cinese delle scienze mediche (Pechino, Cina). Il siero fetale bovino (FBS) e il terreno RPMI 1640 sono stati acquistati da GIBCO. Gli anticorpi anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-actina sono stati acquistati dalla Santa Cruz Company (USA). L’anticorpo secondario è stato acquistato dalla Zhongshan Company (Pechino, Cina). Il kit di rilevamento della capacità di antiossidazione totale (T-AOC) è stato acquistato dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina).

2.2. Cultura cellulare

Le cellule PC12 sono state regolate a circa 1 × 106 cellule/mL con 2 mL inoculate in ogni pozzetto di piastre a 6 pozzetti (Costar) in RPMI 1640 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 5% di siero di cavallo e penicillina/streptomicina (100 U/mL ciascuno). Le cellule sono state coltivate in un incubatore umidificato (5% CO2) (Sanyo, Giappone) a 37°C e lasciate attaccare per almeno 48 h.

2.3. Dosaggi di citotossicità in vitro

I dosaggi sicuri della baicalina e dei suoi tre analoghi alle cellule sono stati valutati mediante il test MTT (metiltiazolo tetrazolio) in vitro. Dopo 24 ore di incubazione delle cellule in piastre a 96 pozzetti, la baicalina e i suoi analoghi sono stati aggiunti con il dosaggio da 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 ore dopo l’aggiunta dei composti, il terreno di coltura nelle piastre a 96 pozzetti è stato incubato con MTT (5 mg/mL, 200 μL per pozzetto) a 37°C per 4 ore. Poi il terreno è stato accuratamente aspirato e sono stati aggiunti 200 μL di dimetilsulfossido (DMSO) per pozzetto per dissolvere i prodotti blu formazan. I valori di assorbanza a 490 nm sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre (modello 550, Bio-Rad, USA). I risultati dell’assorbanza dei pozzetti sono stati espressi come cellule vive. La concentrazione di citotossicità del 50% (CC50) è stata calcolata .

2.4. Cellule per la privazione di ossigeno-glucosio

Per la privazione di ossigeno-glucosio (OGD), abbiamo sostituito il terreno di crescita con terreno di coltura senza glucosio (2 mL per pozzetto) e messo le piastre in un incubatore (YCP-30Q, Changsha, Cina) pieno di 95% N2/5% CO2 a 37°C per 120 min. Poi le cellule sono state rimesse nel normale mezzo di alimentazione e incubate in condizioni normali a 37°C (Sanyo, Giappone) per il tempo specifico per gli esperimenti successivi. Le colture cellulari di controllo non private di ossigeno e glucosio sono state incubate in condizioni normali nel mezzo con glucosio.

Per l’effetto protettivo dei composti dal danno OGD, il saggio di vita cellulare è stato effettuato come precedentemente descritto. Dopo 24 ore di incubazione delle cellule in piastre a 96 pozzetti, la baicalina e i suoi analoghi sono stati aggiunti con i dosaggi da 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 ore dopo l’aggiunta dei composti, il terreno di coltura nelle piastre a 96 pozzetti è stato incubato con MTT (5 mg/mL, 200 μL per pozzetto) a 37°C per 4 ore. Il terreno è stato accuratamente aspirato, e 200 μL di DMSO per pozzetto sono stati aggiunti per dissolvere i prodotti blu formazan. I valori di assorbanza a 490 nm sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre. I risultati dell’assorbanza dei pozzetti sono stati espressi come cellule vive. La concentrazione efficace del 50% (EC50) è stata calcolata. In combinazione con la citotossicità (CC50) dei composti, gli indici di sicurezza (SI) sono stati calcolati da EC50/CC50.

Per lo studio TLR2/TNFα e caspasi3, la concentrazione minima di sicurezza della baicalina e dei suoi analoghi è stata ordinata come 10 μg/mL. Questi composti (10 μg/mL) sono stati aggiunti quando il mezzo di coltura è stato scambiato con una soluzione di glucosio e le cellule sono state coltivate in condizioni normali. Le cellule sono state prelevate per l’esperimento della proteina al tempo di riperfusione specifico (0,5, 1, 3, 6 h) dopo l’aggiunta della baicalina e dei suoi analoghi. Nel controllo, il mezzo è stato usato come veicolo e le cellule sono state prelevate al tempo di riperfusione di 6 h.

2.5. Preparazione dei campioni

Due gruppi senza farmaci sono stati impiegati come controllo. Un gruppo di cellule è stato seminato nel mezzo di crescita normale durante tutto il processo sperimentale senza privazione di ossigeno-glucosio. Il secondo gruppo è stato seminato nel mezzo con processo di privazione di ossigeno-glucosio come modello di controllo. Ad ogni punto temporale, il campione di cellule è stato preparato come nella descrizione precedente. Il mezzo è stato prelevato da ogni pozzetto, e le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo (pH 7.4) e utilizzate con 100 μL RIPA per raccogliere le proteine totali per il Western blotting.

2.6. Western Blot

Il test Western blot per l’espressione proteica di β-actina, TLR2, TNFα, e Caspase3 è stato referenziato con minima modifica come segue: i campioni caricati nel gel (10%), è stato eseguito fino al marcatore (acquistato da Fermentas Republic of Lithuania) ed è andato alla fine del gel. Il trasferimento dovrebbe essere semidry per 60 min a 12 volt e 280 mA. Poi la membrana è stata bloccata con il 10% di latte in PBST (1 × PBS + 0,1% Tween20) per 60 min agitando lentamente a temperatura ambiente. La membrana è stata messa in 1 mL di PBST con anticorpo in una diluizione 1 : 1000, incubata per 60 min a temperatura ambiente sull’agitatore, e lavata per 3 volte usando PBST dopo l’incubazione dell’anticorpo primario. Dopo di che, la membrana è stata incubata per 60 minuti in PBST con l’anticorpo secondario con la concentrazione 1 : 3000. La membrana è stata lavata 3 volte con PBST alla fine.

2.7. Rilevamento della capacità di antiossidazione totale

Il principio di questo esperimento era di rilevare il cambiamento di colore in seguito alla riduzione di Fe3+ a Fe2+ da parte dei componenti riducenti nei campioni. I componenti riducenti potrebbero includere le molecole enzimatiche e nonenzimatiche come la vitamina E, antiossidante solubile nei lipidi, e la vitamina C, antiossidante solubile in acqua, la bilirubina e l’acido urico. Poi la densità ottica è stata misurata a 520 nm con un lettore di micropiastre. Il campione di cellule è stato preparato come nella descrizione precedente e prelevato al tempo di riperfusione specifico (6 ore) dopo l’aggiunta della baicalina e dei suoi analoghi. Il mezzo è stato prelevato da ogni pozzetto e le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo (pH 7.4). Queste cellule nella piastra sono state risolte con PBS (1 mL/pozzetto) mediante ripetuto congelamento e scongelamento. Il surnatante è stato raccolto per il test T-AOC dopo la centrifuga 12 000 rpm/min.

2.8. Analisi dei dati

Tutti i valori sono stati espressi come media ± S.D. I dati sono stati analizzati statisticamente mediante ANOVA. I confronti Newman-Keuls sono stati utilizzati per determinare l’origine delle differenze significative dove appropriato. I valori P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Il software di CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) è stato impiegato per il calcolo di CC50 e EC50.

3. Risultati

3.1. Profilo di crescita delle cellule

Le cellule sono state seminate nelle piastre del mezzo con 10% FBS per 48 ore. Non sarebbero state usate per gli esperimenti fino a quando non fossero cresciute bene e attaccate l’una all’altra strettamente nel piatto delle piastre multiwell.

3.2. Test MTT di citotossicità

Per esaminare la citotossicità e determinare i dosaggi sicuri della baicalina e dei suoi analoghi, il test MTT è stato condotto su cellule PC12 in vitro. Sulla base degli esperimenti, 10 μg/mL di baicalina e wogonoside è stata la massima concentrazione di sicurezza sulle cellule PC12 normali, e 1 μg/mL di baicaleina e wogonin è stata la massima concentrazione di sicurezza sulle cellule PC12 normali (Figura 2).

(a)

(b)

(a)
(b)

Nelle cellule PC12 trattate con privazione di ossigeno-glucosio, solo meno del 40% delle cellule sono sopravvissute rispetto al controllo normale (𝑃<0.05). Rispetto al controllo modello, la concentrazione minima efficace (MEC) di baicalina e wogonin era di 10 μg/mL, mentre la MEC di entrambi wogonoside e baicalein era la stessa a 1 μg/mL. La massima concentrazione efficace (MAXEC) di baicalina e wogonina era la stessa a 1 mg/mL, il che implica la stessa sicurezza. La MAXEC del wogonoside era di 1 mg/mL, ma la MAXEC della baicaleina era solo a 10 μg/mL. È stato suggerito che la baicaleina fosse più citotossica di quella del wogonoside. Tutti questi composti non sono stati mostrati in maniera concentrazione-dipendente in modo distinto (Figura 3).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

La CC50 della baicalina (188,4 μg/mL o 0,422 mmol/L) ha mostrato grandi differenze dagli altri tre composti. La baicaleina ha mostrato una maggiore tossicità cellulare con CC50 8,9 μg/mL (pari a 0,0329 mmol/L). Wogonin e wogonoside hanno mostrato una tossicità simile a CC50 10.6 μg/mL (pari a 0.0373 mmol/L) e 13.7 μg/mL (pari a 0.0298 mmol/L), rispettivamente. Tuttavia, la baicaleina è stata più efficace nella protezione delle cellule dai danni dell’OGD. Il minimo dosaggio efficace della baicaleina era di 1 μg/mL (pari a 0,0037 mmol/L). L’EC50 della baicalina era di 1,2 μg/mL (pari a 0,0027 mmol/L), e l’EC50 di Wogonin e wogonoside era 4.3 μg/mL (pari a 0,0151 mmol/L) e 7,4 μg/mL (pari a 0,0161 mmol/L). Confrontando tra la tossicità e l’effetto, gli indici di sicurezza dei quattro composti erano 156 (baicalina), 8,89 (baicaleina), 2,47 (wogonin), e 1,85 (wogonoside), rispettivamente (Tabella 1).

3.3. Effetto sulle espressioni di TLR2, TNFα, e Caspasi3

Ferito da OGD, le proteine di TLR2 e TNFα nelle cellule sono state espresse distintamente, il che significa che OGD ha stimolato la reazione immunitaria innata, causando l’infiammazione. La proteina caspasi3 nel modello OGD è stata upregolata in un certo grado, ma non c’era un valore statistico significativo (Figura 4). La baicalina ha attenuato l’espressione proteica di TLR2 e TNFα 3 ore dopo la somministrazione. Quando la baicalina ha avuto effetto per 0,5 ore, l’espressione di TLR2 ha mostrato un significato statistico non importa se confrontata con il normale o confrontata con il modello (𝑃<0,05), e l’espressione di TLR2 di 1 ora è aumentata (rispetto al normale, 𝑃<0,05); tuttavia, la sua espressione di 3 ore o 6 ore non ha mostrato alcuna differenza evidente rispetto al normale (rispetto al modello, 𝑃<0,05). L’espressione di TNFα di 0,5 h era ancora superiore al controllo (𝑃<0,05), e le sue espressioni di 1 h, 3 h, e 6 h erano ovviamente downregolate, il che mostrava una differenza significativa dal livello del modello (𝑃<0,05). La baicalina non ha apparentemente influenzato l’espressione della proteina caspasi3, come mostrato nella Figura 4(a).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 4

Effetto dei quattro analoghi sull’espressione delle proteine di TLR2, TNFα, e caspasi3 in cellule PC12 con privazione di ossigeno-glucosio (OGD). Il livello proteico è stato misurato tramite Western blot. Modello significa trattamento con privazione di ossigeno-glucosio. 0.5, 1, 3, e 6 h significano il tempo del processo di riperfusione dopo OGD. (a) sta per effetto baicalina; (b) sta per effetto wogonoside; (c) sta per effetto baicalein; (d) sta per effetto wogonin. La baicalina, il wogonoside e la wogonina sono stati usati in una concentrazione di 10 μg/mL, e la baicaleina è stata usata in una concentrazione di 1 μg/mL. *𝑃<0,05 rispetto al controllo normale. #𝑃<0.05 rispetto al gruppo modello. I dati sono stati presentati come media ± SD da tre esperimenti indipendenti.

Dopo l’aggiunta di wogonoside (10 μg/mL), TLR2 e TNFα sono stati apparentemente downregolati. L’espressione di TLR2 era molto più bassa di quella del modello, anche del livello normale (𝑃<0,05). Di conseguenza, l’espressione di TNFα è stata inibita dal wogonoside apparentemente da 0,5 h dopo la sua somministrazione fino al punto di tempo di 6 h (𝑃<0,05). Il wogonoside inoltre non ha mostrato effetti evidenti sull’espressione della caspasi3 (Figura 4(b)).

Dopo la somministrazione di baicaleina, TLR2 è stato ancora significativamente upregolato 0,5 h e 1 h dopo l’aggiunta di baicaleina (𝑃<0,05), ed è diminuito fino al normale a 3 h e 6 h. Rispetto al modello, TNFα è stato upregolato a 0,5 h e diminuito gradualmente dopo. Come TLR2, è stato espresso fino al normale a 3 ore e 6 ore (Figura 4(c)).

Nel gruppo wogonin, i due fattori sono diminuiti apparentemente. TLR2 è diminuito al normale dopo 0,5 h dell’aggiunta di wogonin (rispetto al modello, 𝑃<0,05), ed è rimasto ad un livello inferiore durante il corso dell’esperimento. Nei punti di tempo 0,5 h e 1 h, TNFα è stato espresso più del normale (𝑃<0,05) ma meno del modello (𝑃<0,05), e a 3 h e 6 h, è arrivato vicino al livello normale come l’espressione di TLR2 (Figura 4(d)).

Similmente ai gruppi baicalina e wogonoside, l’espressione della caspasi3 non ha mostrato cambiamenti significativi nei gruppi baicaleina e wogonina (Figure 4(c) e 4(d)).

3.4. Utilizzando il kit T-AOC, abbiamo trovato che la competenza antiossidazione delle cellule normali era di circa 2,5 U/mg, e una delle cellule trattate con privazione di ossigeno-glucosio era molto inferiore a 0,5 U/mg. Nel gruppo della baicalina, il valore di rilevazione era di 1,8 U/mL, mostrando una differenza significativa sia rispetto al normale che rispetto al modello OGD. Nei gruppi wogonoside, baicalein e wogonin, i valori erano rispettivamente 1,6, 0,8 e 0,6 U/mg, che hanno tutti mostrato una differenza significativa rispetto al normale o al modello (Figura 5).

Figura 5

Effetto della baicalina e dei suoi tre analoghi sulla competenza antiossidazione totale delle cellule PC12 trattate con privazione di ossigeno-glucosio. Modello significa trattamento con privazione di ossigeno-glucosio. La baicalina, il wogonoside e la wogonina sono stati usati in una concentrazione di 10 μg/mL, la baicaleina è stata usata in una concentrazione di 1 μg/mL. **𝑃<0,01 rispetto al controllo normale. ##𝑃<0,01 rispetto al gruppo modello. $$𝑃<0.01 rispetto ai gruppi baicalina e wogonoside. I dati sono stati presentati come media ± S.D. da otto esperimenti indipendenti.

4. Discussioni

La baicalina è un composto glicosilato derivato dalla baicaleina, e ha un gruppo funzionale di acido D-glucopiranosiduronico sul sito 7 della baicaleina (Figura 1), in modo da esibire una maggiore funzione biologica. La struttura di base della baicalina consiste di benzopirano con tre gruppi idrossilici nel sito 5, 6 e 7 e un gruppo fenile dall’altra parte del benzopirano (sito 2). La baicalina ha anche una struttura enolica sull’anello del benzopirano per mantenere la coniugazione. Le due differenze tra la baicalina e la wogonina risiedono nel gruppo metossile sul carbonio 8 della wogonina e nel gruppo idrossile sul carbonio 6 della baicaleina. La costituzione di tre gruppi idrossilici nella baicalina può spiegare i caratteri più idrofili. Inoltre, il wogonoside è una forma glicosilata della wogonina con acido D-glucopiranosiduronico sul carbonio 7. Tutti e quattro i composti condividono uno scheletro di carbonio simile con una struttura benzopiran e anche un gruppo idrossile sul carbonio 5; la baicaleina e la baicalina hanno gruppi idrossili sul carbonio 6, mentre la wogonina e il wogonoside non ne hanno; la baicaleina e la wogonina hanno gruppi idrossilici sul carbonio 7, mentre il wogonoside e la baicalina sono entrambi glicosilati sul gruppo idrossilico al sito 7; infine, la wogonina e il wogonoside hanno gruppi metossilici sul carbonio 8, ma la baicaleina e la baicalina non hanno i gruppi funzionali.

In base al risultato della citotossicità e della neuroprotezione, l’acido D-glucopiranosiduronico sul sito 7 era importante per ridurre la citotossicità, in cui la baicalina era meno citotossica della baicaleina e il wogonoside era meno citotossico della wogonina. Il gruppo metossile sul carbonio 8 e il gruppo idrossile sul carbonio 6 erano il fattore principale che influenzava l’effetto neuroprotettivo, per cui l’EC50 della baicalina e della baicaleina era inferiore a quello del wogonoside e della wogonina (Figura 1 e Tabella 1) dopo la loro somministrazione.

In questo studio, abbiamo trovato che TLR2 era altamente espresso durante il danno da privazione di ossigeno e glucosio (OGD) nelle cellule PC12, il che suggeriva che il recettore era attivato nei neuroni danneggiati (Figura 4). TLR2 è stato identificato come un mediatore chiave delle risposte immunitarie e delle reazioni infiammatorie, e ha mediato le risposte proinfiammatorie attraverso l’attivazione del TNFα . Il recettore è stato significativamente up-regolato rispetto al livello normale, indicando che si è unito al danno neuronale indotto da OGD.

Dalla letteratura di ricerca, TLR2 nel sistema nervoso centrale (CNS) è realizzato come la fonte diretta del segnale dannoso e un importante obiettivo terapeutico potenziale. Nei nostri risultati, le espressioni di TLR2 e TNFα sono diminuite apparentemente poche ore dopo aver aggiunto i composti. Nello stesso profilo, le espressioni di TLR2 e TNFα con wogonin e wogonoside erano più inibite di quelle con baicalin e baicalein. L’inibizione dell’espressione è iniziata da 0,5 ore dopo la somministrazione di wogonin e wogonoside; tuttavia l’inibizione dell’espressione di TLR2 e TNFα è apparsa più tardi, 3 ore dopo la somministrazione di baicalin e baicalein. Pertanto, la wogonina e il wogonoside sono stati realizzati per avere la preferenza con TLR2. Combinati con le loro strutture chimiche, tutti i risultati implicavano che il gruppo metossile sul carbonio 8 nella struttura è l’ipotesi del farmacoforo dell’effetto dell’inibizione di TLR2, relativo all’inibizione dell’infiammazione.

Condizionando la sovrapressione su TLR2 e TNFα da questi analoghi, abbiamo rilevato la caspasi3 per confermare se esisteva apoptosi con l’aggiunta degli analoghi. Rispetto al normale, l’espressione della proteina caspasi3 nel modello OGD è effettivamente aumentata in una certa misura, ma non ha mostrato alcuna differenza statistica. Con la somministrazione dei quattro analoghi, il livello della proteina caspasi3 non ha mostrato alcun cambiamento evidente, anche se ha mostrato la tendenza a diminuire al punto temporale di 6 ore e vicino al controllo normale (confrontando con il normale o il modello, 𝑃>0.05). I risultati di cui sopra hanno suggerito che le cellule PC12 ferite nel modello OGD non avevano apoptosi apparente, e anche i quattro analoghi non potevano indurre l’apoptosi nelle cellule PC12 ferite. Secondo la letteratura, la baicalina ha attenuato il danno da ischemia cerebrale globale da riperfusione nei gerbilli attraverso vie antiossidative e antiapoptotiche, e la baicaleina e la wogonina potrebbero entrambe indurre l’apoptosi nelle cellule tumorali pancreatiche umane e nelle cellule leucemiche HL-60. Pertanto, i nostri risultati di apoptosi da questi composti devono essere studiati ulteriormente.

Riferimento al rilevamento T-AOC, abbiamo trovato che la sequenza di capacità di antiossidazione totale era baicalina e wogonoside > baicaleina e wogonin, indicando che una forma glicosilata sul sito 2 di baicalina e wogonoside ha svolto un ruolo chiave nell’antiossidazione complessiva.

Presi insieme, la baicalina e i suoi tre analoghi hanno presentato in modo completo la protezione delle cellule neuronali dal danno OGD e l’inibizione dell’espressione TLR2 e TNFα (il fattore a valle), suggerendo la possibilità di questi composti utilizzati nella terapia dell’ictus prendendo di mira TLR2, uno dei principali meccanismi del danno cerebrale. C’è una relazione struttura-attività tra loro con la sicurezza, l’efficacia e la specificità del targeting farmacologico di TLR2. Questa è la prima volta che studiamo la baicalina e i suoi analoghi naturali sui bersagli molecolari di TLR2 e TNFα, così come T-AOC. Tutto ciò avrà un beneficio nell’elucidazione e nello sviluppo di nuovi farmaci.

Contributo degli autori

I primi due autori hanno contribuito in modo uguale.

Riconoscimenti

L’autore ringrazia tutti i membri del suo laboratorio. Lo studio è stato sostenuto in parte dalla National Natural Science Foundation della Cina (30801523, 81073092), il National S&T Major Special Project for New Drug R&D della Cina (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, e 2011ZX09101-002-11), e Fondazione speciale per il laboratorio della Tsinghua University (LF 20103579).