Suscettibilità agli antibiotici dei batteri indicatori Escherichia coli ed Enterococchi spp. isolati dalle anatre nel comune di Morogoro, Tanzania

Metodi

Area di studio e campionamento delle anatre

Questo studio trasversale è stato condotto nel comune di Morogoro tra novembre 2014 e marzo 2015 dove 100 anatre Muscovy (Carina moschata) sono state campionate da 26 allevamenti da cortile. Le anatre in studio sono state selezionate a caso da ogni stormo, dove è stato campionato il 5-10% delle dimensioni dello stormo. Gli uccelli campionati includevano 86 femmine e 14 maschi. Prima del campionamento, sono state raccolte informazioni di base sulla gestione, l’alimentazione, l’uso e lo smaltimento degli antibiotici inutilizzati utilizzando un questionario (file aggiuntivo 1). Le anatre selezionate sono state immobilizzate manualmente e un tampone di cotone sterile è stato inserito nella cloaca per raccogliere materiale fecale. I campioni sono stati conservati in una scatola fredda con un pacchetto di ghiaccio e trasportati al laboratorio della Sokoine University of Agriculture per l’analisi. Per coerenza, due ricercatori, dopo essere stati addestrati dai tecnologi di laboratorio sul campionamento del tampone dai volatili, hanno effettuato il campionamento su tutte le 100 anatre.

Isolamento e identificazione di E. coli e Enterococchi spp.

I campioni fecali sono stati piastrati su agar MacConkey (Oxoid, Basingstoke, UK) e incubati per 24 ore in condizioni aerobiche per l’isolamento di E. coli. Le colonie sospette sono state ulteriormente identificate in base alla morfologia coloniale, alla colorazione di Gram e ai test biochimici. Per l’isolamento di Enterococchi spp. i campioni sono stati piastrati su Slanetz-Bartley agar (Oxoid, Basingstoke, UK) e incubati per 48 ore in condizioni aerobiche e identificati in base alla morfologia coloniale e ai test biochimici. Durante l’isolamento e l’identificazione, E. coli ATCC25922 e Enterococcus faecium ATCC 2912 sono stati inclusi come ceppi di controllo.

Suscettibilità agli antibiotici

Tutti gli isolati di E. coli ed Enterococchi sono stati testati per la suscettibilità agli antibiotici utilizzando il metodo della diffusione su disco e interpretati secondo il CLSI. Il test di suscettibilità antimicrobica è stato eseguito su alcuni antibiotici comunemente usati in medicina umana in Tanzania. Sono stati testati quattro antibiotici per E. coli alle concentrazioni indicate: ampicillina 10 µg, cefotaxime 30 µg, trimetoprim-sulfametossina 25 µg e tetraciclina 30 µg. Gli enterococchi sono stati testati contro ampicillina 10 µg, eritromicina 15 µg, rifampicina 5 µg, tetraciclina 30 µg e trimetoprim-sulfametossina 25 µg. Tutti i dischi antibiotici erano della Oxoid, Basingstoke, UK.

Considerazioni etiche

Il permesso di condurre questo studio è stato concesso dall’ufficiale comunale del bestiame di Morogoro e l’approvazione etica per lo studio è stata data dai comitati etici dell’Università di Agricoltura di Sokoine, Tanzania. Il consenso verbale è stato ottenuto da ciascuno degli allevatori prima del campionamento.

Risultati

Su 100 campioni fecali messi in coltura, il 91% aveva E. coli di cui 64 (70,3%) hanno mostrato resistenza a diversi antibiotici testati (Tabella 1). Le resistenze multiple agli antibiotici mostrate da E. coli erano: 28 (30.8%) isolati a quattro antibiotici, 35 (38.5%) a tre antibiotici, 13 (14.3%) a due antibiotici, 11 (12.1%) isolati a un antibiotico. Enterococcus è stato isolato da tutti i campioni e il 42% ha mostrato resistenza a diversi antibiotici testati. Il 5% degli isolati di Enterococcus erano resistenti a tutti gli antibiotici, il 13% a quattro antibiotici, il 21% a tre antibiotici, il 26% a due antibiotici e il 28% a un antibiotico testato. I risultati sulla gestione delle anatre e il loro possibile accesso ai residui di antibiotici sono riassunti nella tabella 2. Dei 26 allevatori intervistati, il 92,3% ha gestito le anatre in modo estensivo, accedendo a luoghi di scarico. Nessuna somministrazione di farmaci veterinari è stata riportata alle anatre, ma gli intervistati hanno riferito di trattare altri animali utilizzando tetracicline/ossitetracicline.

Discussione

Lo studio attuale ha trovato che il tasso di isolamento di E. coli era del 91% mentre tutte le anatre ospitavano Enterococchi e gli isolati avevano alti tassi di resistenza multi-antibiotica. Questo studio ha fatto luce sul fatto che i batteri indicatori delle anatre libere in Tanzania possono essere utilizzati negli studi sulla resistenza agli antibiotici. Questo suggerisce che il problema della resistenza agli antibiotici è diffuso anche ai batteri isolati da animali che non ricevono terapia antibiotica. Questo ha un impatto sulla salute pubblica, dato che le anatre si procurano il mangime intorno alle zone di casa e spargono i loro escrementi fecali dappertutto e i batteri resistenti possono trovare la loro strada nella catena alimentare e colpire gli esseri umani o il gene resistente può essere trasferito a batteri patogeni. In Nigeria, è stata riportata una bassa prevalenza dell’8,6%, probabilmente dovuta all’uso di diversi antibiotici come l’ofloxacina, l’acido nalidixico e la gentamicina. L’alta prevalenza di resistenza agli antibiotici osservata durante questo studio probabilmente le anatre sono costantemente esposte a residui di antibiotici da scarichi animali e umani a causa degli ampi usi. Gli studi dimostrano che gli antibiotici utilizzati negli animali da reddito sono scarsamente assorbiti nell’intestino e il composto madre viene escreto nelle feci. Questo è supportato da diversi studi che hanno riportato alti livelli di residui di antibiotici nelle acque reflue e nei rifiuti animali. Pertanto, la flora normale in anatre spazzino sono costantemente esposti a residui di antibiotici che li fa sviluppare resistenza come è stato osservato durante questo studio.

La resistenza E. coli a ampicillina era il più alto (81%) rispetto ad altri antibiotici utilizzati nello studio simile al rapporto precedente in Slovacchia dove la resistenza registrata era 87,8%. In generale, gli studi mostrano che il 60-70% degli isolati di E. coli hanno sviluppato resistenza contro l’ampicillina. Questo può essere causato dall’uso eccessivo di ampicillina nella pratica umana, i cui residui sono potenziali fonti di contaminazione ambientale dove le anatre si nutrono di mangime. Nel caso della sulfametossina, la resistenza registrata è stata del 76% come precedentemente registrato da Van Tuat. La resistenza antibatterica mostrata dalla tetraciclina in questo studio era del 59% mentre in Slovacchia era del 37,5% e quella della Nigeria era del 75%. È interessante notare che E. coli ha anche mostrato resistenza antibatterica alla cefotaxima al 63%, un antibiotico non comunemente usato nel trattamento degli animali in Tanzania. Le anatre possono accedere ai residui di cefotaxima nelle discariche dove si trovano feci umane e resti di farmaci smaltiti (tabella 2). Tuttavia, un’alta resistenza alla cefotaxima è stata osservata con batteri isolati da diverse strutture sanitarie fognarie.

Nello studio sono state osservate anche resistenze multiple di E. coli a più di un antibiotico. I risultati erano troppo alti rispetto allo studio condotto in Vietnam dove la resistenza multipla agli antibiotici di E. coli era del 16,7% a quattro antibiotici, a tre antibiotici del 20% e a due antibiotici del 23,3%. Questo verificarsi di resistenza multipla farmaci suggerito che il bestiame ha svolto un ruolo come serbatoi di batteri resistenti per la contaminazione ambientale. E ‘stato trovato che le popolazioni batteriche isolate dall’intestino di animali esposti ad antibiotici sono stati trovati per essere cinque volte più probabilità di essere resistente a qualsiasi dato antibiotico. I batteri non resistenti acquisiscono normalmente i plasmidi extra-cromosomici di resistenza agli antibiotici (R-plasmidi) da quelli resistenti quando sono in stretto contatto. La resistenza osservata può essere contribuita dall’uso irrazionale di antibiotici che scarica una quantità sostanziale di residui nell’ambiente. Altri fattori che causano lo sviluppo della resistenza potrebbero essere la facile disponibilità e l’uso dilagante di antibiotici ad ampio spettro nel trattamento presuntivo delle infezioni anche nelle strutture sanitarie. La mancanza di applicazione dei regolamenti sull’uso degli antibiotici come parte dei programmi di controllo delle infezioni potrebbe aver influenzato il modello dei risultati di resistenza in misura considerevole.

Enterococchi spp. sono commensali naturali dell’intestino umano e animale. Tutte le anatre dello studio avevano Enterococchi spp. nel loro contenuto intestinale che hanno mostrato un tasso di resistenza del 42% ai diversi antibiotici testati. Tuttavia, i risultati di questo studio hanno mostrato un’alta resistenza a rifampicina (62%), ampicillina (62%) e tetraciclina (42%). La resistenza a più farmaci è stata anche osservata in più del 65% degli isolati. Come detto in precedenza, la resistenza osservata dei batteri ai diversi antibiotici testati in assenza di usi dei farmaci nelle anatre potrebbe essere dovuta ai residui scaricati nell’ambiente in cui le anatre si nutrono possono essere facilmente esposti agli antibiotici e ad altri batteri resistenti. Quando i batteri resistenti sono in contatto con quelli non resistenti, lo scambio di materiale genetico può avvenire e il gene resistente può essere acquisito. Altrove, alcuni studi hanno riportato che gli Enterococchi spp. isolati dalle anatre hanno mostrato resistenza ai macrolidi e agli antibiotici lincosamici. Tuttavia, Enterococchi spp. è intrinsecamente resistente a diversi gruppi di antibiotici tra cui cefalosporine e aminoglicosidi. Inoltre, molti ceppi ospitano elementi genetici trasmissibili per la resistenza acquisita a vari antibiotici come la tetraciclina. Altri studi di resistenza agli antibiotici in Enterococchi spp. isolati da anatre sono stati effettuati utilizzando l’antibiotico vancomicina. Ulteriori studi di suscettibilità di Enterococchi spp. alla vancomicina sono suggeriti in futuro poiché l’antibiotico è oggi un farmaco comune nella medicina umana in Tanzania.

Lo studio del questionario supporta ulteriormente l’osservazione di laboratorio sull’alto tasso di resistenza mostrato da E. coli e Enterococcus spp. Indipendentemente dal non uso di farmaci veterinari nei duschi, il sistema estensivo di gestione dello scavenging li espone all’ambiente con residui di antibiotici e altri batteri provenienti da animali ed esseri umani, che hanno assunto antibiotici. Questo è supportato dai risultati che le resistenze osservate erano agli antibiotici che sono comunemente usati negli esseri umani e negli animali (Tabella 2). I batteri resistenti sono stati isolati da una varietà di fonti tra cui lo scarico delle acque reflue e l’ambiente. I resti e i contenitori dei farmaci sono stati smaltiti in modo casuale negli ambienti domestici circostanti che possono esporre le anatre all’antibiotico. Pertanto, il sistema di gestione intensiva delle anatre può aiutare a ridurre al minimo l’esposizione non necessaria degli uccelli ai residui di antibiotici.

Conclusione

Generalmente, la resistenza agli antibiotici mostrata da E. coli e Enterococcus spp. in questo studio era alta. Questo dimostra il ruolo giocato dal bestiame e dai polli che sono costantemente sotto antibiotici come potenziali fonti primarie di geni di resistenza agli antibiotici per i batteri isolati dalle anatre. L’isolamento di E. coli ed Enterococcus spp. resistenti agli antibiotici dalle anatre serve come potenziali portatori di ceppi resistenti agli antibiotici per gli esseri umani e rappresenta un serio problema per la salute pubblica.

Limitazioni

Questo studio ha utilizzato solo 100 campioni di anatre raccolti dal comune di Morogoro che limita la generalizzazione dei risultati da utilizzare come rappresentativi sullo stato di resistenza antimicrobica con E. coli ed Enterococcus spp. nelle anatre in Tanzania. Anche i numeri di antibiotici testati erano pochi. Il test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri con il metodo della diffusione su disco può essere inferiore ai metodi di microdiluizione in brodo. Inoltre, lo studio non ha determinato i genotipi di resistenza in E. coli e Enterococcus spp. che erano resistenti a diversi tipi di antibiotici. Tuttavia, la presenza di altri animali sul posto dove è stato fatto il campionamento delle anatre agisce come fattori di confusione sui tassi di resistenza osservati nei batteri isolati dalle anatre.