Tecnologia del DNA ramificato (bDNA)

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Introduzione

Il test del DNA ramificato (bDNA) fornisce uno strumento unico e potente per una quantificazione affidabile delle molecole di acido nucleico. Fondamentalmente diverso dai metodi di amplificazione del target come la PCR, il test bDNA misura direttamente le molecole di acido nucleico a livelli fisiologici aumentando il segnale del reporter, piuttosto che replicare le sequenze target come mezzo di rilevamento, e quindi evita gli errori inerenti all’estrazione e all’amplificazione delle sequenze target. Il saggio bDNA impiega un’amplificazione lineare del segnale utilizzando sonde oligonucleotidiche sintetiche e molecole di bDNA, e può misurare in modo accurato e preciso tra circa 500 e 10.000.000 di molecole. I nuovi progressi nella tecnologia bDNA includono l’aggiunta di molecole preamplificatrici e l’incorporazione di nuovi nucleotidi, isoC e isoG, nelle sequenze di sonde oligonucleotidiche per migliorare ulteriormente il segnale e ridurre il rumore causato dall’ibridazione aspecifica dei componenti del test bDNA. Questi miglioramenti hanno esteso il limite di rilevamento quantitativo del test bDNA fino a 50 molecole.

Storia della tecnologia bDNA

Ben adatto all’uso di routine in un ambiente clinico o di ricerca, il test bDNA è stato applicato con successo in una serie di aree, compresa la prognosi e il monitoraggio dei pazienti con malattie virali. Fornendo un mezzo affidabile per la quantificazione diretta della carica virale nei campioni clinici, i test bDNA sono stati sviluppati per misurare il DNA del virus dell’epatite B, l’RNA del virus dell’epatite C, l’RNA del virus dell’immunodeficienza umana tipo 1 e il DNA del citomegalovirus. Con la progettazione personalizzata di sonde oligonucleotidiche, le potenziali applicazioni del saggio bDNA vanno ben oltre la quantificazione dell’acido nucleico virale. Creando sonde oligonucleotidiche per sequenze specifiche di molecole di acido nucleico bersaglio, il test bDNA è stato adattato a un’ampia varietà di applicazioni. Per esempio, i ricercatori hanno progettato sonde per il test bDNA per misurare i livelli di mRNA cellulare. Questo ha dimostrato di essere un approccio fruttuoso per una serie di applicazioni di ricerca, tra cui il monitoraggio dei cambiamenti nei livelli di mRNA delle citochine in popolazioni di pazienti sani e immunocompromessi, lo studio dei modelli di splicing dell’insulina e la valutazione dell’induzione del gene dello stress per applicazioni di tossicologia molecolare. Data la sua versatilità, facilità d’uso e alto livello di prestazioni, il saggio bDNA sta rapidamente diventando il metodo di scelta per la quantificazione degli acidi nucleici

Outline

Il saggio bDNA utilizza un formato micropiastra a 96 pozzetti e si basa su una serie di reazioni di ibridazione specifiche e sulla rilevazione chemiluminescente delle sonde ibridate. Attaccate alla superficie di ogni micropozzetto ci sono sonde di “cattura” che contengono una specifica sequenza nucleotidica. Queste sonde di cattura si legano a un sottoinsieme di “sonde target” che sono legate a specifiche sequenze nucleotidiche nella molecola di acido nucleico target. Questa serie di ibridazioni ancorano la molecola di acido nucleico target alla superficie del micropozzetto. Il rilevamento dell’acido nucleico bersaglio e l’amplificazione del segnale sono realizzati attraverso un’altra serie di ibridazioni.

Un secondo sottoinsieme di sonde bersaglio collega la molecola di acido nucleico bersaglio alle molecole amplificatrici di bDNA. Con l’aggiunta di molecole preamplificatrici per fornire un ulteriore strato di miglioramento tra le sonde target e le molecole amplificatrici di bDNA, è possibile ottenere un’amplificazione del segnale ancora maggiore. Ogni molecola amplificatrice di bDNA è stata progettata per contenere 15 bracci, ognuno dei quali contiene tre siti di legame per “sonde etichetta” coniugate con fosfatasi alcalina. Un segnale chemiluminescente viene generato all’introduzione di un substrato dioxetane che viene attivato dalla fosfatasi alcalina. Questo segnale è facilmente quantificabile contando il numero di fotoni emessi in un luminometro. Il dosaggio del bDNA è intrinsecamente quantitativo poiché il numero di fotoni emessi è direttamente correlato alla quantità di acido nucleico target nel campione.

Materiali

Apparecchiatura – Riscaldatore per piastre Chiron dotato di supporto per micropozzetti 8×12 – Luminometro Chiron per la lettura delle piastre

Reagenti per il giorno 1

  • Micropozzetti modificati con oligonucleotidemicropozzetti modificati
  • Diluente per la lisi
  • Reagente per la lisi (proteinasi K)
  • Sonde target per la cattura
  • Sonde target per l’etichetta
  • Scampioni
  • Standard e controlli (opzionale)

Reagenti per il giorno 2

Procedura

Giorno 1

  1. Preparare il reagente di lavoro del campione combinando:
  • 6 ml diluente di lisi
  • 600 ml reagente di lisi
  • 32 ml 500 fm/ml sonde target per la cattura (20 fm/200 ml finale)
  • 96 ml500 fm/ml sonde target per l’etichetta (60 fm/200 ml finale)

Nota: Le concentrazioni effettive delle sonde target variano a seconda della molecola di acido nucleico target.

  1. Per i campioni di plasma o siero, pipettare 150 ml di reagente di lavoro del campione e 50 ml di siero o plasma in micropozzetti modificati con oligonucleotidi in duplicato. Per campioni di cellule o tessuti, preparare ed estrarre pellet di RNA nel reagente di lavoro del campione come descritto e pipettare 200 ml di ciascun estratto di RNA in micropozzetti duplicati modificati con oligonucleotidi.
  2. Se si desidera, è possibile includere controlli positivi e negativi ai fini della specificità. I controlli devono essere trattati nello stesso modo descritto per i campioni nella fase 2 (sopra) ed eseguiti in duplicato.
  3. Se lo si desidera, gli standard possono essere inclusi per la quantificazione assoluta. Pipettare 150 ml di reagente di lavoro campione e 50 ml del membro appropriato della curva standard in micropozzetti modificati con oligonucleotidi in duplicato.
  4. Sigillare i micropozzetti con pellicola Mylar e incubare i micropozzetti per una notte a 53°C nel riscaldatore per piastre Chiron. (Nota: La temperatura dipenderà dalla temperatura ottimale definita per il test specifico.)

Giorno 2

  1. Togliere la piastra dal riscaldatore per piastre Chiron e lasciare riposare 10 minuti a temperatura ambiente. Mentre la piastra si raffredda, preparare la soluzione dell’amplificatore diluendo il concentrato dell’amplificatore a 200 fm/ml nel diluente per etichette. La concentrazione finale dovrebbe essere 10 fm/50 ml.
  2. Lavare i micropozzetti due volte con il lavaggio A, quindi pipettare 50 ml di amplificatore diluito in ogni pozzetto. Incubare i micropozzetti per 30 minuti a 53°C nel riscaldatore per piastre Chiron.
  3. Togliere la piastra dal riscaldatore per piastre Chiron e lasciarla riposare 10 minuti a temperatura ambiente. Mentre la piastra si raffredda, preparare la soluzione di lavoro dell’etichetta diluendo la sonda dell’etichetta a 500 fm/ml nel diluente dell’etichetta. La concentrazione finale dovrebbe essere di 20 fm/50 ml.
  4. Lavare i micropozzetti due volte con il lavaggio A, poi pipettare 50 ml della soluzione di lavoro Label in ogni pozzetto. Incubare i micropozzetti per 15 minuti a 53°C nel riscaldatore per piastre Chiron.
  5. Togliere la piastra dal riscaldatore per piastre Chiron e lasciarla 10 minuti a temperatura ambiente. Durante questo tempo, preparare la soluzione substrato composta da 99,7% v/v LumiphosPlus e 0,3% v/v 10% SDS (per esempio: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
  6. Lavare i micropozzetti due volte con il lavaggio A e poi tre volte con il lavaggio B. Aggiungere 50 ml della soluzione substrato in ogni pozzetto.
  7. Misurare la chemiluminescenza nel luminometro a lettura di piastra. (Questo include l’incubazione dei micropozzetti per 30 minuti a 37°C prima della misurazione per raggiungere la cinetica dello stato stazionario).

Troubleshooting

  • I pozzetti modificati con oligonucleotidi devono essere maneggiati con cura. Non spezzare le strisce di pozzetti in segmenti. Sigillare saldamente i pozzetti con un nuovo sigillante per piastre per evitare l’evaporazione durante l’incubazione. Quando si rimuove il sigillante per piastre dopo le incubazioni, fare attenzione a non tirare i pozzetti fuori dal supporto per micropozzetti.
  • Tutti i campioni, gli standard e i controlli devono essere analizzati in duplicato per una quantificazione ottimale. Vuotare i campioni lipemici o torbidi in quanto questi possono dare risultati inconcludenti.
  • Per risultati ottimali, tutti i reagenti devono essere portati alla temperatura indicata nella procedura di dosaggio prima dell’uso. Aggiungere il reagente ai micropozzetti toccando con la punta della pipetta la parete vicino al punto medio del pozzetto, sopra la superficie del fluido nel pozzetto.

Applicazione

La quantificazione virale o il test della carica virale è diventato parte della gestione di routine dei pazienti con infezione da HIV-1 o da virus dell’epatite C (HCV). Attualmente ci sono diverse tecnologie molecolari disponibili per l’uso nel laboratorio clinico. Di queste, solo i test del DNA ramificato (bDNA) sono approvati dalla FDA per i test della carica virale di HIV-1 e HCV. Questa tecnologia di amplificazione del segnale è costruita su una serie di reazioni di ibridazione che sono altamente suscettibili di automazione completa e quindi riducono la quantità di lavoro necessaria per eseguire questo tipo di analisi.

I saggi diagnostici molecolari che utilizzano la tecnologia bDNA per il rilevamento di molecole bersaglio dell’acido nucleico sono strumenti sensibili, specifici e affidabili nella diagnosi di infezioni virali e batteriche e per il monitoraggio della progressione della malattia nel corso della terapia. I test bDNA si sono evoluti dalle fasi di sviluppo nel laboratorio di ricerca ai saggi quantitativi approvati dalla US Food and Drug Administration con preziose applicazioni cliniche. I test bDNA sono meno laboriosi di molte procedure basate sulle molecole perché sono altamente adatti all’automazione totale. Usando il bDNA, non è richiesta l’amplificazione di una sequenza target e, quindi, la contaminazione incrociata tra campioni replicati a causa di ampliconi eccessivi o di carryover è meno probabile nei saggi bDNA. Inoltre, poiché il bDNA è una tecnologia di amplificazione del segnale, il test è in grado di quantificare con meno di 0,5 log o 3 volte la variabilità per il suo intero intervallo dinamico.

la tecnologia bDNA si è dimostrata versatile perché sono stati sviluppati metodi per il rilevamento di infezioni da una vasta gamma di microrganismi, tra cui il parassita Trypanosoma

brucei, il citomegalovirus, i batteri Staphylococcus sensibili agli antibiotici e resistenti agli antibiotici, il papillomavirus umano e il virus dell’epatite B. Tuttavia, gli sforzi più recenti si sono concentrati sullo sviluppo di saggi bDNA per la quantificazione dell’HIV-1 e del virus dell’epatite C (HCV) RNA, portando all’applicazione di routine dei metodi bDNA nel laboratorio di diagnostica molecolare clinica. Nel descrivere il progresso dei metodi bDNA, questa revisione sottolinea i test bDNA per HIV-1 e HCV.

Saggi bDNA HIV-1 di prima generazione

Sono stati sviluppati test bDNA accurati e riproducibili di prima generazione per il rilevamento di HIV-1 RNA e HCV RNA nel plasma umano (Quantiplex HIV-1 o HCV RNA 1.0, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 In uno dei primi rapporti sul test Quantiplex bDNA, non è stata osservata alcuna reattività su campioni di plasma di donatori sieronegativi utilizzando il test bDNA di prima generazione

, indicando un’eccellente specificità.9 Risultati positivi nel test bDNA sono stati osservati nell’83% dei campioni di 348 pazienti che erano sieropositivi per l’HIV-1.9 Il range dinamico per la quantificazione utilizzando il test Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 si estendeva da 104 (limite inferiore di rilevazione) a più di 106 copie/mL di HIV RNA.9,11 Cambiamenti nella carica virale da 2 a 3 volte erano statisticamente significativi usando il test bDNA, indicando che il test Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 era altamente accurato e riproducibile.11 In confronto, erano necessari cambiamenti nella carica virale di almeno 3,7-5,8 volte prima che i risultati fossero statisticamente significativi usando le prime versioni del test RT-PCR.11 Pertanto, il bDNA è diventato il metodo di scelta per la maggior parte degli studi clinici che valutano il test della carica virale e l’efficacia clinica dei nuovi inibitori della trascrittasi inversa e della proteasi dell’HIV-1.

La sensibilità del metodo di rilevamento del bDNA è stata migliorata nel test HIV-1 di seconda generazione (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay, Bayer) modificando il design delle sonde di cattura e di destinazione e aggiungendo oligonucleotidi preamplificatori. Il design migliorato delle sonde di cattura e di destinazione ha permesso un aumento della rigorosità dell’ibridazione, diminuendo così il background del test. I preamplificatori aumentano notevolmente l’intensità del segnale perché ogni molecola di preamplificatore ha regioni multiple per l’ibridazione con molte molecole di bDNA. Inoltre, ogni molecola di bDNA ha sequenze multiple e ripetute per l’ibridazione di sonde marcate AP. Il segnale in uscita utilizzando il test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 ha mostrato linearità da circa 500 copie/mL a 1,6 × 106 copie/mL (il range dinamico dichiarato era da 500 a 8 × 105 copie/mL). La sensibilità del test HIV-1 bDNA di seconda generazione è stata aumentata di 20 volte rispetto al test di prima generazione (i limiti inferiori di rilevamento erano rispettivamente 500 copie/mL e 10 × 104 copie/mL). In un’ampia analisi della precisione, sono stati confrontati i risultati dei test iniziali e i risultati dei retest nel test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0. Il test HIV-1 RNA 2.0 è risultato altamente riproducibile.14 Su 174 campioni con carichi virali superiori a 5.000 copie/mL, il 96% presentava differenze inferiori a 0,3 log10 nel numero di copie tra i risultati iniziali e i risultati di retest. Su 69 campioni con carichi virali compresi tra 500 e 5.000 copie/mL, l’86% presentava differenze inferiori a 0,3 log10 tra i risultati iniziali e quelli successivi. Tuttavia, tra 5.339 pazienti che sono stati sottoposti a test clinici di routine durante un intervallo di 1 anno, carichi virali inferiori a 500 copie/mL sono stati osservati nel 41,6% dei campioni.

Quindi, un test bDNA con una maggiore sensibilità (cioè, limite inferiore di rilevazione di <500 copie/mL) era necessario per una parte sostanziale dei pazienti.

Le caratteristiche di prestazione del test Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 e di un test RT-PCR (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) sono state confrontate utilizzando diluizioni di campioni standard che avevano numeri di copie del virus HIV-1 noti. Quando le diluizioni degli stessi standard sono state testate nei 2 test, i numeri di copie di HIV-1 sono stati generalmente più alti dal test RT-PCR che dal test bDNA. Per esempio, gli intervalli dei numeri di copie di RNA erano da 900 a 7,68 × 105 copie/mL nel test bDNA e da 3.360 a 1,88 × 106 copie/mL nel test RT-PCR. Entrambi i test erano lineari per gli intervalli dinamici dichiarati.

Il confronto delle pendenze del numero di copie di HIV-1 rispetto alle linee di regressione dell’uscita del segnale ha suggerito che il test bDNA aveva meno errore sistematico proporzionale. La variabilità tra le corse, utilizzando un campione standard con 1.650 copie/ml di HIV-1, era inferiore nel test bDNA rispetto al test RT-PCR; i coefficienti di variazione per i test bDNA e RT-PCR erano rispettivamente del 24,3% e del 34,3%, indicando che il test bDNA era leggermente più preciso a questo numero di copie di HIV-1 RNA. Rispetto all’uso dello standard di 1.650 copie/mL, i coefficienti di variazione tra le corse erano più alti per un campione contenente 165 copie di HIV-1 RNA/mL (44,0% e 42.7% per i test bDNA e RT-PCR, rispettivamente). I risultati del test sono stati simili quando un numero uguale di copie di HIV-1 è stato confrontato tra i sottotipi di HIV da A a F usando il test bDNA. Tuttavia, con questa versione di RT-PCR, i sottotipi A, E e F sono stati rilevati in modo meno efficiente rispetto ai sottotipi B, C e D. Le differenze tra il test bDNA di seconda generazione e il test Amplicor Monitor RT-PCR per la quantificazione dell’HIV-1 indicavano che era necessaria una coerenza nel metodo di analisi per ogni singolo paziente durante la diagnosi e il trattamento.

Saggi HCV bDNA

Mentre continuava a sviluppare un test HIV-1 bDNA di terza generazione migliore, la Bayer ha riconosciuto la necessità di sviluppare un test della carica virale dell’HCV con un’utilità clinica emergente simile a quella del test HIV-1. Per il rilevamento dell’HCV, il test bDNA di prima generazione (Quantiplex HCV RNA 1.0 assay, Bayer) aveva un range di quantificazione dinamica nel plasma umano da 3,5 × 105 a 1,2 × 108 copie/mL di HCV RNA. I genotipi da 1 a 6 sono stati rilevati utilizzando questo test, sebbene la sensibilità fosse inferiore per i genotipi 2 e 3 (67% di tasso di rilevamento: segnale positivo per 60 degli 89 campioni di siero noti per contenere i genotipi 2 o 3 dell’HCV) rispetto al genotipo 1 (97% di tasso di rilevamento: segnale positivo per 67 dei 69 campioni di siero noti per contenere il genotipo 1 dell’HCV). Un confronto tra il test Quantiplex HCV RNA 1.0 e un test RT-PCR sviluppato da un laboratorio di ricerca per l’HCV ha mostrato una maggiore sensibilità nel test RT-PCR, che aveva un limite inferiore di rilevamento di 2,5 × 104 copie/mL di HCV RNA. Tuttavia, il test HCV bDNA aveva una maggiore riproducibilità e richiedeva meno tempo del test RT-PCR per HCV sviluppato in laboratorio.

Per migliorare il tasso di rilevamento dei genotipi 2 e 3 dell’HCV, è stato sviluppato un test di seconda generazione (Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer).15 Il principale cambiamento di progettazione nel test HCV RNA di seconda generazione è stato l’utilizzo di sonde per sequenze nel genoma dell’HCV che erano più altamente conservate tra i genotipi. Queste regioni conservate erano le sequenze non tradotte 5′ e le sequenze nel gene centrale del genoma dell’HCV. Il risultato delle modifiche alle sonde di cattura e di destinazione è stato quello di ridurre drasticamente la variazione del tasso di rilevamento tra i genotipi dell’HCV nel test di seconda generazione. Ognuno dei 6 genotipi dell’HCV ha avuto un alto tasso di rilevamento, e c’è stato un netto miglioramento nel rilevamento dei genotipi 2 e 3 dell’HCV (rilevamento del 93% contro il 67% dei campioni noti per contenere i genotipi 2 o 3 dell’HCV nei test HCV 2.0 e HCV 1.0, rispettivamente). Inoltre, la sensibilità del test bDNA di seconda generazione è stata leggermente migliorata rispetto al test HCV 1.0 (i limiti inferiori di quantificazione erano 2,0 × 105 contro 3,5 × 105).

Saggi bDNA di terza generazione per HIV-1 e HCV

Nei test bDNA di prima e seconda generazione, l’ibridazione aspecifica delle sonde oligonucleotidiche alle sequenze non bersaglio ha limitato la sensibilità del test. Il miglioramento tecnologico critico nel test bDNA di terza generazione (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) è stato quello di utilizzare basi non naturali, 5′-metil-2′-deossiisoguanosina (isoG) e 5′-metil-2′-isodeossicitidina (isoC), nella sintesi di tutte le sonde nel sistema bDNA, ad eccezione degli estensori di cattura che mediano la cattura dell’acido nucleico virale target sulla superficie della piastra. Poiché gli oligonucleotidi contenenti isoG e isoC non sono presenti in natura, l’ibridazione aspecifica è ridotta significativamente. Così, le sonde modificate con le basi non naturali non formano ibridi stabili con la sonda di cattura in assenza di RNA bersaglio. Nella descrizione iniziale del test di terza generazione, il limite di rilevamento dell’HIV-1 in campioni di plasma di 11 pazienti era di 50 copie per mL, il che rappresenta un miglioramento di 10 volte nel limite di rilevamento rispetto al test di seconda generazione. Durante il trattamento con la terapia antiretrovirale altamente attiva, la carica virale di HIV-1 è diminuita al di sotto del limite di rilevamento per tutti gli 11 pazienti.

Il test VERSANT HIV-1 RNA 3.0 ha un range dinamico da 75 a 5 × 105 copie/mL di HIV RNA. La versione 3.0 è stata approvata anche per un limite inferiore di rilevazione pari a 50 copie/mL in diversi altri paesi. Quando sono stati confrontati campioni appaiati nel test HIV-1 bDNA di seconda generazione (Quantiplex versione 2.0) e nel test Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR, sono stati ottenuti numeri di copie di HIV-1 costantemente inferiori usando il test bDNA. Tuttavia, è stata osservata una stretta correlazione quantitativa nei numeri di copie di HIV-1 RNA tra il test di terza generazione (versione 3.0) e il test Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR.18 I risultati della carica virale nel test bDNA versione 3.0 e nel test Amplicor RT-PCR erano circa 2 volte superiori rispetto al test versione 2.0. Risultati quantitativamente simili nel test bDNA versione 3.0 e nel test RT-PCR sono importanti nella cura del paziente a causa della probabile possibilità che vengano utilizzati metodi diversi per analizzare campioni dello stesso paziente per il corso delle terapie anti-HIV. Dati recenti suggeriscono che il rebaselining per i pazienti testati con un test RT-PCR potrebbe non essere necessario.

Simile al test bDNA HIV-1 versione 3.0, il test bDNA di terza generazione per l’HCV utilizzava anche oligonucleotidi sostituiti con isoC e isoG per ridurre l’ibridazione aspecifica. L’uso di oligonucleotidi sostituiti con isoC e isoG ha aumentato la sensibilità del test di circa 62 volte. Il limite inferiore di rilevamento del test HCV RNA 3.0 era di 3,2 × 103 copie/mL rispetto a 2 × 105 copie/mL nel test HCV RNA 2.0. L’intervallo dinamico di quantificazione lineare del test HCV RNA 3.0 si estendeva da 3,2 × 103 copie/mL (615 UI/mL) a 4 × 107 copie/mL di HCV RNA (7,7 × 106 UI/mL). Il test HCV RNA 3.0 aveva un’elevata specificità (98,2%) e, come il test di seconda generazione, era ugualmente efficace nella quantificazione dell’HCV RNA in tutti i genotipi. Le deviazioni standard tra le serie e all’interno delle serie per i campioni replicati erano rispettivamente di 0,2 log10 e 0,14 log10, indicando che il test di terza generazione era altamente riproducibile.

Oltre all’eradicazione dell’HCV nel siero, un obiettivo importante delle terapie anti-HCV è quello di ridurre i livelli di HCV nel fegato. L’utilità del test HCV RNA 3.0 per il rilevamento e la quantificazione dell’HCV RNA in campioni di biopsia epatica è stata studiata in 25 pazienti coinfettati con HCV e HIV.20 La riproducibilità del test HCV bDNA di terza generazione era simile tra i campioni di biopsia epatica e i campioni di siero. Inoltre, il rilevamento dell’HCV RNA in campioni di fegato di pazienti infettati dai genotipi 1, 3 e 4 mediante il test HCV RNA 3.0 è risultato altamente specifico e sensibile. In questo studio su 25 pazienti, alti livelli pretrattamento di HCV intraepatico

correlati a una bassa frequenza di risposta alla terapia anti-HCV. I livelli intraepatici di HCV pretrattamento erano più alti nei pazienti con infezione da HCV di genotipo 1. I risultati di questo studio hanno dimostrato che importanti marcatori della progressione della malattia da HCV, i livelli di HCV nel fegato e nel siero, possono essere quantificati in modo affidabile dall’analisi del bDNA durante il trattamento. I metodi per i test bDNA di terza generazione comprendono la preparazione del campione, l’ibridazione e la rilevazione del segnale per l’HIV-1 RNA e l’HCV RNA. Tutti i 3 s ep vengono eseguiti nei micropozzetti della piattaforma System 340 per il saggio HCV RNA 3.0 che non richiede una fase di estrazione separata. Nella versione 3.0 del test HIV-1 RNA, la preparazione del campione è diversa dal metodo HCV RNA e viene eseguita al di fuori della piattaforma System 340. Uno studio recente ha valutato un adattamento del metodo HIV-1 RNA versione 3.0 in cui la fase di trattamento del campione HIV-1 è stata modificata per consentire l’analisi simultanea di HCV e HIV-1 sulla piattaforma System 340. Il metodo HIV-1 è stato modificato omettendo l’incubazione di 2 ore a 63°C per la lisi virale. Invece, la lisi di HIV-1 e HCV è stata eseguita sulla piattaforma System 340. I metodi del test HCV bDNA sono rimasti invariati nel test combinato. La specificità e la quantificazione con il metodo combinato bDNA rientravano nelle specifiche dei singoli test HIV-1 e HCV. Il test simultaneo per l’HIV-1 e per l’HCV ha migliorato il flusso di lavoro nel laboratorio clinico e ha portato a costi inferiori. Poiché la rilevazione e la quantificazione dell’HIV-1 RNA e dell’HCV RNA sono cruciali per la diagnosi e per la valutazione delle risposte alla terapia, la capacità di effettuare test simultanei per entrambi i virus rappresenta un progresso significativo nella diagnostica molecolare.