The Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT/HIF-1β) is Influenced by Hypoxia and Hypoxia-Mimetics

Abstract

Background: L’Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT, HIF-1β) è un membro della famiglia di proteine basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) e un regolatore trascrizionale vitale per quanto riguarda i processi di sviluppo e adattamento fisiologico. Si discute sul fatto che ARNT sia collegata al cancro e ad altre malattie. ARNT è nota per essere traslocata nel nucleo cellulare, dove avviene l’accumulo della proteina. ARNT è un partner di eterodimerizzazione del ligando xenobiotico attivato Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR), le proteine Single Minded (SIM), il fattore cardiovascolare helix-loop-helix 1 e le proteine Hypoxia Inducible Factor (HIF-α). ARNT è obbligatorio per il legame di HIF-1, HIF-2 e HIF-3 al DNA. Mentre la degradazione delle subunità di HIF-α è soppressa dall’ipossia, ARNT è generalmente considerata come costitutivamente espressa in eccesso all’interno della cellula, e la stabilizzazione è comunemente ritenuta indipendente dall’ossigeno. Tuttavia, forniamo la prova che la regolazione di ARNT è molto più complessa. Lo scopo del nostro studio era di rivalutare la regolazione dell’espressione di ARNT. Metodi: Abbiamo esaminato linee cellulari di origine diversa come MCF-7 e T47D (cancro al seno umano), HeLa (carcinoma della cervice umana), Hep3B e HepG2 (epatoma umano), Kelly (neuroblastoma umano), REPC (rene umano) e Cos7 (rene primario di primate). Abbiamo usato analisi immunoblot, densitometria, RT-PCR e trasfezione transitoria. Risultati e conclusioni: I nostri risultati mostrano che i livelli di proteina ARNT sono influenzati dall’ipossia e dai mimetici dell’ipossia come il cloruro di cobalto (II) (CoCl2) e la dimetiloxalilglicina (DMOG) in un modo specifico della linea cellulare. Abbiamo dimostrato che questo effetto potrebbe essere innescato da HIF-1α che gioca un ruolo importante nel processo di stabilizzazione di ARNT in ipossia.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Introduzione

L’Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) è un membro della famiglia delle proteine basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) e un regolatore trascrizionale cruciale per quanto riguarda l’organogenesi e lo sviluppo neurale, nonché i processi di adattamento fisiologico all’ipossia e agli agenti inquinanti. Oltre ad ARNT (HIF-1β), altre due isoforme ARNT2 e ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1) esistono in varie specie. ARNT e ARNT2 condividono un’identità aminoacidica >90%. ARNT ha un modello di espressione più ubiquitario di ARNT2 nei tessuti adulti. Studi recenti riportano un collegamento di ARNT a diverse disfunzioni e malattie cellulari, come il cancro e il diabete.

Come tutte le molecole bHLH, ARNT ha bisogno di dimerizzare per formare complessi attivi di legame al DNA. ARNT è noto per formare eterodimeri con il ligando xenobiotico attivato Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) con il quale vengono indotti gli enzimi metabolizzatori, con le subunità HIF-α (Hypoxia Inducible Factors) sotto bassi livelli di ossigeno, le proteine SIM (Single Minded) per lo sviluppo neurale e CHF1 (cardiovascular helix-loop-helix factor 1) . Abbiamo precedentemente dimostrato che ARNT è molto probabilmente traslocato nel nucleo da importazione nucleare classica mediata da importine α/β. Nonostante una coesistente esportazione nucleare, ARNT si accumula principalmente nel nucleo.

Nell’ipossia le subunità α dei fattori inducibili dell’ipossia (HIF-α) sono stabilizzate e formano eterodimeri con ARNT (HIF-1β) che regolano la risposta cellulare ai bassi livelli di ossigeno. Tre diverse isoforme di subunità HIF-α dipendenti dall’ossigeno sono attualmente identificate: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) e HIF-3α . In condizioni normossiche le proteine HIF-α subiscono l’idrossilazione da parte degli enzimi Prolyl-Hydroxylase-Domain 1-3 (PHD1-3). L’HIF-α prolil-idrossilato serve come motivo di riconoscimento per la poliubiquitinazione da parte della proteina Von Hippel-Lindau (pVHL) e la successiva degradazione proteasomica. Tuttavia ARNT manca del dominio di degradazione dipendente dall’ossigeno (ODDD) ed è considerato costantemente espresso in condizioni di normox. È opinione corrente che l’ipossia non abbia alcun effetto sui livelli di ARNT. Tuttavia esistono studi sparsi che osservano un aumento parzialmente concomitante dei livelli di proteina ARNT in ipossia. Qui forniamo la prova che l’espressione di ARNT è effettivamente influenzata e modulata a seconda del tipo di cellula valutata. Questo suggerisce che le cellule tumorali potrebbero perdere la capacità di regolare ARNT durante la tumorigenesi. I nostri dati mostrano che la regolazione dell’espressione di ARNT è molto più complessa di quanto si pensi.

Nel nostro studio abbiamo studiato l’espressione di ARNT sotto diversi tipi di ipossia, mimetici dell’ipossia e fattori inducibili dell’ipossia, rivelando modelli di espressione specifici della linea cellulare e cofattori dipendenti.

Materiali e metodi

Cultura cellulare, induzione ipossica e mimetici dell’ipossia

Le linee cellulari MCF-7 (carcinoma duttale del seno umano), T47D (carcinoma duttale del seno umano), Hep3B (carcinoma epatocellulare umano), HeLa (adenocarcinoma umano della cervice), HepG2 (carcinoma epatocellulare umano) e Cos-7 (cellule renali simili a fibroblasti di primati) sono state incubate in terreno di coltura DMEM (Gibco). Le linee cellulari REPC (rene umano primario) e Kelly (neuroblastoma umano) sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 (Gibco). Il terreno di coltura è stato integrato con 10% di siero fetale di vitello (FCS, Gibco) e 100 UI/ml di penicillina / 100µg/ml di streptomicina, rispettivamente. Le cellule sono state coltivate in un’atmosfera umidificata a 37°C, 5% CO2 e 20.9% O2 (normoxia). Per gli studi di ipossia, le cellule sono state poste in un’atmosfera umidificata a 37°C, 5% CO2, N2 bilanciato con 1% o 3% O2. Il cloruro di cobalto (II) (CoCl2) è stato usato in una diluizione di 50 µM e la dimetiloxalilglicina (DMOG) è stata usata in una diluizione di 1 mM come mimetico dell’ipossia.

Transient Transfection

Le linee cellulari MCF-7, T47D e Hep3B sono state transfettate con siRNA usando il reagente di trasfezione Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen). Le cellule sono state coltivate al 50% di confluenza in piastre da 6 pozzetti prima della trasfezione, seguendo il protocollo del produttore. Prima dell’applicazione dell’ipossia il mezzo di coltura è stato cambiato e le cellule sono state incubate altre 6 ore in condizioni normotossiche.

Analisi di immunoblot e densitometria

Per il Western blotting le cellule sono state raccolte dopo il trattamento, lavate con PBS freddo come il ghiaccio, estratte con tampone di lisi di urea e sonicate per raccogliere lisati di cellule intere. Le concentrazioni di proteine sono state determinate usando il Bio-Rad DC Protein Assay seguendo il protocollo del produttore. Gli estratti proteici sono stati elettroforesi mediante SDS-PAGE e trasferiti su membrane di nitrocellulosa mediante elettroblottatura semi-secca. Le membrane sono state bloccate usando il 5% di latte non grasso in PBS. Gli anticorpi primari (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) sono stati incubati per una notte, seguiti da anticorpi secondari HRP corrispondenti (DAKO 1:5000) aggiunti per 2 ore. ECL (GE Healthcare) è stato usato come reagente di rilevamento. La quantità di proteine è stata confrontata utilizzando Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) secondo i protocolli. Ogni sfondo Western blot è stato sottratto dall’area di misurazione individuale. Il carico di Lamin A/C corrispondente è stato considerato al 100% ed è stato calcolato il valore proporzionale.

Isolamento dell’RNA e RT-PCR

Per misurare i livelli quantitativi specifici di mRNA, l’RNA totale è stato isolato dalle cellule usando ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) seguendo le istruzioni del produttore. Poi 0,2 µg di RNA sono stati trascritti inversamente usando Superscript III (Invitrogen). Il cDNA generato è stato usato come modello nell’analisi PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR). La RT-PCR è stata eseguita utilizzando ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e KAPA SYBR FAST Universal (Peqlab). L’amplificazione è stata effettuata utilizzando TaqMan Gene Expression Assays (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) secondo i protocolli del produttore. I primer specifici per il gene di mantenimento L28 (senso: 5`-ATGGTCGTGCGGAACTGCT-3` e inverso: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`) sono stati utilizzati per la normalizzazione. Le condizioni di ciclo erano una fase iniziale di attivazione della polimerasi a 95°C per 10 min, seguita da 45 cicli a 95°C per 15 s, 55°C per 30 s e a 72°C per 20 s. I campioni sono stati analizzati in quadruplicato e le quantità relative di mRNA sono state calcolate usando il metodo ∆∆CT.

Statistiche

L’analisi statistica è stata eseguita con il software GraphPad InStat. È stato applicato il t-test non accoppiato. I grafici sono mostrati come mezzi ± deviazione standard (SD). Sono stati eseguiti test di sopravvivenza MTT (dati non mostrati) per garantire che la sopravvivenza delle cellule non differisse tra i campioni.

Risultati

L’espressione di ARNT è indotta in ipossia in MCF-7, HeLa, Hep3B e REPC

Abbiamo esaminato la quantità dei livelli di proteina ARNT facendo crescere le cellule MCF-7 in condizioni di normoxia (21% O2) per 24 ore seguite da 48 ore di normoxia (Nox) o 24 ore di normoxia e 24 ore di ipossia 1% (Hox 1% 24h, 1% O2) o solo 48 ore di ipossia 1% (Hox 1% 48h, 1% O2). Gli estratti di cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo monoclonale di topo anti-ARNT. La proteina HIF-1α è stata osservata per confermare l’induzione di cellule ipossiche. Come mostrato in Fig. 1, i livelli di proteina ARNT sono stati elevati in risposta all’ipossia nelle cellule MCF-7. 24 ore di incubazione all’1% di ipossia hanno portato a un aumento significativo di ARNT rispetto a 48 ore di ipossia all’1%.

MCF-7-cellule sono state incubate fino a 96 ore in ipossia 1%, per rivelare gli effetti a lungo termine di ipossia. Le cellule MCF-7 hanno mostrato un aumento della concentrazione di ARNT dopo 12 ore. In ulteriori esposizioni all’ipossia le concentrazioni di ARNT hanno cominciato a diminuire fino ad un valore di base (Fig. 2).

L’induzione ARNT dovuta a diverse intensità di ipossia è stata misurata coltivando cellule MCF-7 in ipossia 3% (3% O2) e 1% ipossia (1% O2) per 12 ore e 24 ore (Fig. 3a).

Per chiarire le differenze tra linee cellulari distinte abbiamo coltivato cellule HeLa, Hep3B e REPC simili alle cellule MCF-7 (Fig. 3b-d). In tutti i tipi di cellule trattate con ipossia, i livelli di proteina ARNT erano elevati. L’ipossia all’1% ha portato a un aumento più rapido dei livelli di proteina ARNT ma anche a una normalizzazione più precoce rispetto all’ipossia al 3%. L’ipossia al 3% mostra un’induzione massima di ARNT dopo 24 ore.

Diverse linee cellulari mostrano varie reazioni all’ipossia e ai mimetici dell’ipossia per quanto riguarda i livelli di proteina ARNT

Per studiare una relazione tra i livelli di ARNT e HIF-α, le cellule MCF-7, HeLa, Cos7, REPC, HepG2, Hep3B e Kelly sono state trattate con i mimetici dell’ipossia cobalto(II)-cloruro (CoCl2) e dimetiloxalylglicina (DMOG) (Fig. 4a-g). 4a-g).

Le cellule HeepG2 e Kelly non hanno risposto a 24 ore di ipossia con un aumento dei livelli proteici ARNT. Le cellule HeLa hanno mostrato una leggera induzione di ARNT in ipossia e sotto trattamento con mimetici dell’ipossia, ma questo effetto non era statisticamente significativo. Le cellule MCF-7 hanno mostrato chiaramente un aumento dei livelli di proteina ARNT sotto 24 ore di ipossia al 3% e un aumento dei livelli di proteina ARNT dovuto al trattamento con CoCl2. D’altra parte il trattamento con DMOG non ha avuto alcun impatto sui livelli di ARNT nelle cellule MCF-7, anche se DMOG è uno stabilizzatore HIF molto potente. Le cellule Cos7 hanno mostrato un forte effetto di induzione di ARNT all’ipossia e ai mimetici dell’ipossia CoCl2 e DMOG. Le cellule REPC hanno mostrato una forte risposta all’ipossia, ma l’induzione di ARNT con CoCl2 è stata relativamente piccola. Il DMOG ha ridotto i livelli di proteina ARNT nelle cellule REPC. Le cellule HepG2 non hanno reagito all’induzione dei livelli di proteina ARNT all’ipossia né al DMOG. Tuttavia, le cellule HepG2 hanno mostrato un’induzione molto forte di ARNT con CoCl2. Le cellule Hep3B hanno reagito con un aumento dei livelli di proteina ARNT a tutti i trattamenti. Le cellule Kelly non hanno mostrato alcuna reazione nei livelli di proteina ARNT, né all’ipossia né ai mimetici dell’ipossia.

I cambiamenti nei livelli di ARNT mRNA non sono correlati ai livelli di proteina ARNT sotto l’influenza dell’ipossia e dei mimetici dell’ipossia

Abbiamo usato il metodo quantitativo RT-PCR, per esaminare i livelli di mRNA relativi ai cambiamenti osservati nei livelli di proteina ARNT. Le cellule MCF-7, HeLa, REPC e Hep3B sono state coltivate in condizioni normotossiche prima di applicare il trattamento con ipossia al 3%, ipossia all’1%, CoCl2 e DMOG per 24 ore (Fig. 5). Le cellule MCF-7 hanno dimostrato un calo insignificante dei livelli di ARNT mRNA in risposta all’ipossia. Tuttavia è stata osservata una riduzione significativa dei livelli di ARNT mRNA a causa del trattamento con CoCl2 e DMOG. Mentre le cellule HeLa e REPC non hanno mostrato alcun effetto sui livelli di ARNT mRNA dopo i trattamenti, le cellule Hep3B hanno reagito all’ipossia con una forte riduzione di ARNT mRNA. In queste cellule è stata osservata una reazione in diminuzione a CoCl2.

La proteina ARNT è stabilizzata in presenza di HIF-1α

Le cellule MCF-7, T47D e Hep3B sono state trasfettate transitoriamente con HIF-1α siRNA, per chiarire l’effetto di Hif-1α sui livelli di proteina ARNT (Fig. 6). Le cellule sono state incubate per 48 ore in normoxia con il reagente di trasfezione RNAiMAX e siRNA seguito da una fase di recupero di 6 ore. Successivamente le cellule sono state tenute in ipossia all’1% per 24 ore. Abbiamo osservato che i livelli di proteina ARNT sono diminuiti in ipossia se HIF-1α è stato bloccato. Tuttavia, la trasfezione siRNA aspecifica non ha influenzato l’aumento osservato dei livelli di proteina ARNT in ipossia.

Discussione

L’Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT/HIF-1β) svolge un ruolo di regolatore trascrizionale fondamentale nell’omeostasi cellulare. Funziona come partner di eterodimerizzazione di varie proteine regolatrici importanti, come HIF-α, le proteine SIM, AhR e CHF1. Pertanto è coinvolta in molti percorsi cellulari regolatori diversi. A causa del fatto che ARNT è pensato per essere costitutivamente espresso e non influenzato da cambiamenti fisiologici o farmacologici, per esempio l’ipossia, ARNT non è stato considerato il fattore limitante e un possibile bersaglio terapeutico nei rapporti precedenti. Tuttavia, studi recenti riportano un legame tra ARNT e diverse malattie, come il cancro. HIF-1α e HIF-2α sono ben noti per avere funzioni cruciali nello sviluppo e/o nella terapia del cancro. Come loro cofattore obbligatorio, la deplezione di ARNT si tradurrebbe in livelli inattivi o diminuiti di complessi HIF-α. Per sottolineare ulteriormente la rilevanza di ARNT, dimostriamo per la prima volta che l’ipossia, i mimetici dell’ipossia e HIF-1α giocano un ruolo importante nei meccanismi di regolazione dell’espressione di ARNT a seconda del tipo di cellula valutata.

Abbiamo esaminato otto diverse linee cellulari di 2 diverse specie ospiti per dimostrare l’influenza dell’ipossia e dei mimetici dell’ipossia sull’espressione delle proteine ARNT. Le cellule di cancro al seno MCF-7 reagiscono all’ipossia con un aumento dei livelli di proteina ARNT, mentre i livelli di ARNT mRNA sembrano diminuire o rimanere invariati. Ciò implica che esiste una regolazione di feedback reciproca tra la stabilizzazione della proteina e la sintesi de novo. Simili down e up-regulations della trascrizione genica in ipossia sono note per diversi enzimi e molecole. I nostri risultati non sono necessariamente il risultato di una riduzione generale della sintesi di mRNA nella cellula come risposta allo stress cellulare, perché la trascrizione del gene ESR2 è indotta in ipossia e HIF-1α knock-down (dati non pubblicati).

L’esposizione all’ipossia per un periodo più lungo di 48 ore porta ad una reversione ai livelli basali della proteina ARNT che possono essere visti in normoxia. Un simile picco di espressione è noto per la proteina HIF-1α dopo 4-12 ore in trattamento ipossico. Un’ulteriore incubazione ipossica porta al declino dei livelli di HIF-1α fino a raggiungere uno stato stazionario. Questo fatto potrebbe suggerire un effetto stabilizzante della sovraespressione di HIF-1α verso ARNT. La formazione di complessi HIF-1α/ARNT nel nucleo potrebbe prevenire la degradazione di ARNT attraverso i proteasomi, che è in linea con Choi et al. e Mandl et al. Per indagare i nostri risultati abbiamo abbattuto transitoriamente HIF-1α nelle cellule MCF-7 e abbiamo osservato fino al 90% di riduzione dei livelli di proteina ARNT in ipossia rispetto alla normoxia. Questo effetto è stato osservato anche nelle cellule T47D e Hep3B. Una reazione incrociata del siRNA di HIF-1α che abbatte ARNT a causa di una forte omologia di sequenza tra ARNT e HIF-α è stata esclusa dall’analisi in silico delle sequenze del siRNA e del gene. Questi risultati suggeriscono una forte correlazione tra ARNT e l’espressione della proteina HIF-1α. Una spiegazione potrebbe essere un effetto stabilizzante dei partner di legame di ARNT indipendenti dall’O2, come AhR, SIM e CHF1, verso ARNT in normoxia. In ipossia, i livelli ridotti di AhR, SIM e CHF1, potrebbero essere compensati dalla sovraespressione di HIF-α per quanto riguarda la stabilizzazione di ARNT. L’abbattimento di HIF-1α potrebbe quindi portare a livelli di ARNT altamente diminuiti attraverso una ridotta sintesi de novo e una minore stabilità verso l’ubiquitinazione e la degradazione proteasomica, perché mancano i partner di dimerizzazione. Questa ipotesi sottolineerebbe una regolazione di ARNT altamente dipendente dai partner di legame, che sarebbe in linea con Choi et al. e Mandl et al. Per esaminare se l’induzione di HIF-α porta a un aumento concomitante dell’espressione di ARNT, abbiamo trattato le cellule con CoCl2 e DMOG. Nonostante il fatto che l’effetto stabilizzante di HIF-α di CoCl2 e DMOG sia analogo, le cellule MCF-7 dopo DMOG reagiscono meno fortemente con un aumento della proteina ARNT che dopo il trattamento con CoCl2. Queste osservazioni sono in linea con un effetto stabilizzante di HIF-α su ARNT. Un comportamento opposto tra CoCl2 che induce ARNT in contrasto con DMOG potrebbe essere visto in cellule HepG2. È interessante notare che le cellule REPC reagiscono con una diminuzione dei livelli di ARNT sotto il trattamento con DMOG. Anche se l’effetto stabilizzante di HIF-α di DMOG è simile a quello di CoCl2, una diversa reazione cellulare da parte di DMOG non è insolita a causa di una diversa modalità d’azione. D’altra parte le cellule Cos7 e Hep3B reagiscono all’ipossia e ad entrambi i mimetici dell’ipossia con un forte aumento dei livelli di proteina ARNT, il che è in linea con l’effetto stabilizzante di HIF-α postulato da Mandl et al. Il fatto che, in contrasto con varie linee cellulari tumorali, i livelli di ARNT sono ben influenzati nella linea cellulare primaria Cos7 dall’ipossia e dai mimetici dell’ipossia potrebbe implicare una perdita di funzione durante la tumorigenesi in alcuni tumori. I dati riguardanti ARNT nello sviluppo del cancro cellulare sono scarsi e quindi sono necessarie ulteriori indagini.

La linea cellulare Hep3B mostra aumenti significativi dei livelli di proteina ARNT dovuti a tutti e tre i trattamenti ipossici, mentre l’ipossia e CoCl2 riducono significativamente l’ARNT mRNA. Questi risultati supportano l’ipotesi di un meccanismo di feedback reciproco, che può essere ipotizzato anche nelle cellule MCF-7. La linea cellulare renale REPC mostra un comportamento deviante. Queste cellule reagiscono con un forte aumento della proteina ARNT a causa dell’ipossia, ma con un’induzione meno intensa a causa di CoCl2 e in dissenso con la diminuzione dei livelli di proteina ARNT sotto il trattamento DMOG come discusso sopra. Ma inoltre le cellule REPC non mostrano alcuna variazione nei livelli di ARNT mRNA sotto i vari trattamenti, implicando una regolazione su base proteica.

Le cellule Kelly mostrano livelli stabili di proteine ARNT. Né l’ipossia né i mimetici dell’ipossia sono in grado di influenzare ARNT. Tali livelli stabili di ARNT possono essere visti anche nelle cellule HepG2 in ipossia e trattamento con DMOG, ma questa linea cellulare reagisce con un forte aumento della proteina ARNT al trattamento con CoCl2. Le cellule HeLa non mostrano un cambiamento significativo dei livelli di ARNT, né per quanto riguarda la proteina né l’mRNA. Questi risultati supportano l’opinione attuale, che ARNT è costantemente espressa e non influenzata dall’ipossia come rivisto da Semenza . Noi e altri abbiamo dimostrato che questa opinione non può essere generalizzata. Con la presente forniamo dati che contraddicono l’ipotesi di un partner di eterodimerizzazione ARNT costantemente espresso e non regolato, ma che è in linea con Chilov et al. Sostenendo anche Choi et al. e Mandl et al., mostriamo che l’eterodimerizzazione con HIF-α è un importante meccanismo di stabilizzazione della proteina ARNT in ipossia.

In conclusione, i nostri dati suggeriscono una generale regolazione stabilizzante dei partner di legame di ARNT, come HIF-α, AhR, SIM e CHF1 per quanto riguarda l’espressione di ARNT. Inoltre, possiamo mostrare che ogni linea cellulare/tipo reagisce distintamente all’ipossia e ai mimetici dell’ipossia per quanto riguarda l’induzione della sintesi proteica ARNT. Pertanto, una predicazione universalizzata dell’espressione della proteina ARNT non è ammissibile. Questi risultati dimostrano che la regolazione di ARNT dovrebbe essere ulteriormente studiata, soprattutto per quanto riguarda la tumorigenesi, perché la regolazione di ARNT è molto più complessa di quanto apprezzato oggi.

Riconoscimenti

Siamo grati a T. Svensson, B. Rudzewski e A.-K. Hellberg per l’eccellente supporto tecnico. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

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