Top Five Methods for Primary Antibody Labeling

In qualsiasi applicazione che utilizza anticorpi per la rilevazione del segnale (ad esempio, Western blotting, ELISA, immunoistochimica, o FACS), ci sono due approcci all’etichettatura degli anticorpi: etichettatura diretta e indiretta. Il Western blotting standard usa l’etichettatura indiretta perché si usa un anticorpo primario per rilevare l’antigene target, seguito da un anticorpo secondario a cui è attaccata una molecola di rilevamento.

In alcune situazioni, può essere meglio saltare l’anticorpo secondario e tutti i passaggi associati ed etichettare direttamente il tuo anticorpo primario. I casi che richiedono l’etichettatura diretta dell’anticorpo primario includono:

• C’è un legame aspecifico dell’anticorpo secondario
• Si stanno usando anticorpi primari di organismi non standardanticorpi primari di organismi non standard – in questo caso può essere difficile trovare buoni anticorpi secondari
• Quando si effettua il multiplexing con anticorpi che provengono dalla stessa specie
• Quando è necessario ridurre il tempo sperimentale eliminando l’incubazione dell’anticorpo secondario e le fasi di lavaggio associate

Parametri anticorpali

È possibile marcare l’anticorpo scelto non solo con coloranti fluorescenti ma anche con proteine fluorescenti, enzimi e particelle colorate. Tutti questi sono di solito attaccati tramite un gruppo terminale di lisina, quindi è necessario evitare buffer contenenti ammine (per esempio, Tris) e molecole in tutti i passaggi. Altrimenti, etichetterete soprattutto le vostre molecole di buffer! Si dovrebbe anche evitare il comune conservante sodio azide del buffer in quanto interferisce con la reazione di etichettatura.

L’anticorpo per l’etichettatura dovrebbe essere ad una concentrazione non inferiore a 0,5 mg/ml e >90% puro. Meno proteine interferenti e molecole contenenti gruppi amminici hai nella tua preparazione di anticorpi, più efficiente sarà la reazione di etichettatura. Ma anche se il tuo anticorpo nuota nella glicina e nella BSA, puoi sempre rimuovere le sostanze interferenti tramite dialisi. Puoi anche migliorare la purezza del tuo anticorpo facendolo passare attraverso una colonna di proteina A o puoi anche preparare la tua colonna di purificazione di affinità con un antigene adatto.

Metodi principali di etichettatura degli anticorpi in-house

Metodo dell’estere NHS (Succinimidyl)

Questo metodo è utile per la coniugazione di anticorpi con coloranti fluorescenti ampiamente disponibili come i derivati della rodamina. Viene tipicamente eseguito in un tampone fosfato con successiva separazione su colonna dal colorante non marcato. Lo svantaggio principale è che gli esteri sono instabili perché sono sensibili all’umidità. L’anticorpo marcato dovrebbe essere usato immediatamente dopo la fine della reazione.

Metodo dell’isotiocianato

Puoi usare questo metodo per fare l’isotiocianato di fluoresceina (FITC), che è molto popolare nella preparazione di proteine e anticorpi fluorescenti. Se avete lavorato con la microscopia fluorescente, avete avuto a che fare con il FITC. Sono disponibili anche analoghi isotiocianati di diversi coloranti standard.

L’isotiocianato è più stabile dell’NHS ma è più difficile da produrre e la vostra reazione di etichettatura sarà probabilmente meno efficiente con questo metodo. Come con l’NHS, il colorante in eccesso dovrebbe essere rimosso dopo la reazione tramite cromatografia.

Metodo della carbodiimmide

I composti derivati dalla carbodiimmide convertono i gruppi carbossilici sulle proteine in intermedi reattivi che possono reagire con le lisine. L’alta reattività dei carbodiimmidi significa che possono essere usati per etichettare gli anticorpi con materiali relativamente inerti come le particelle magnetiche o d’oro. Il carbodiimmide più comunemente usato è EDC. L’NHS viene talvolta aggiunto alla reazione per favorire la formazione di intermedi relativamente stabili.

Il metodo è semplice, ma, come l’NHS, l’EDS è igroscopico, quindi è necessario utilizzare l’anticorpo immediatamente dopo l’etichettatura.

Metodo a due tag

Qui si etichetta l’anticorpo con un’altra proteina che funge da catalizzatore, per esempio HRP o fosfatasi alcalina. Poiché entrambe le molecole contengono numerosi gruppi amminici, la reticolazione diretta (come con il metodo NHS) porterebbe a polimeri della stessa molecola. Pertanto, si dovrebbe eseguire il collegamento in due fasi separate. Si reticola l’anticorpo alla molecola X e il catalizzatore alla molecola Y. È necessario scegliere X e Y con attenzione perché dovrebbero interagire per formare il coniugato. Per esempio, si potrebbe scegliere la maleimmide come X e un tiolo come Y.

Anche se il coniugato risultante sarà più stabile di quello che si ottiene con il metodo NHS, questo metodo richiederà tre volte tanto lavoro; fasi separate di etichettatura e purificazione per l’anticorpo, il catalizzatore e la reazione di coniugazione. La buona notizia è che puoi comprare molecole catalitiche pre-etichettate e poi etichettare il tuo anticorpo di conseguenza.

Metodo del periodato

Questo metodo è utile per generare coniugati specifici HRP-anticorpo. Il periodato attiva l’HRP creando molecole di aldeide che interagiscono con i residui di lisina. L’HRP stesso ha solo pochi residui di lisina, quindi la polimerizzazione dell’enzima non è una preoccupazione significativa. I legami tra l’HRP e l’anticorpo sono reversibili a meno che non siano stabilizzati dall’aggiunta di cianoidride di sodio.

Questo era il mio elenco dei migliori metodi di etichettatura degli anticorpi fatti in casa. Ci sono molti kit commerciali sul mercato con una chimica di base simile che può rendere la vostra vita molto più facile. Se il tuo laboratorio ha i soldi.

Hai un altro metodo di etichettatura di anticorpi che vuoi condividere con noi? Mettiti in contatto scrivendo nella sezione commenti.

Letteratura:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chimica e Radiochimica: I primi 10 anni. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.