Una struttura complessa di arrestin-2 legata a un recettore accoppiato alla proteina G

Caratterizzazione funzionale e determinazione della struttura del complesso Arr2-NTSR1

Le interazioni delle arrestine con GPCR non visibili sono relativamente deboli e altamente dinamiche ma ottenere un complesso stabile è un passo essenziale per gli studi strutturali. Pertanto, prima dei nostri studi strutturali, abbiamo caratterizzato l’interazione di NTSR1 con arrestin utilizzando il sistema commerciale NanoBiT, che è un metodo efficace per rilevare le interazioni proteina-proteina.17 NTSR1 è stato trovato per interagire sia con Arr2 e Arr3, che è rafforzata dalle maggiori concentrazioni di agonista peptide, neurotensina (NTS). I mutanti Arrestin con tre residui idrofobici C-terminali mutati in alanina (3 A mutanti; I386A, V387A e F388A in Arr2, e I387A, V388A e F389A in Arr3),18,19 che sono noti come forma pre-attivata di arrestin, hanno mostrato una maggiore attività di legame a NTSR1 (Fig. 1b).

Abbiamo ulteriormente testato l’interazione arrestina-NTSR1 con il saggio Tango, un saggio basato sulle cellule che determina le attività di legame delle proteine di membrana ai partner di legame solubili.7,20 I nostri saggi Tango hanno mostrato che l’attività di legame di NTSR1 a Arr2 è stato aumentato di circa due o tre volte, rispettivamente, quando peptide agonista NTS o piccola molecola agonista ML314, un noto modulatore positivo-allosterico (PAM),21,22 è stato aggiunto. L’attività di legame di Arr2 a NTSR1 è stato aumentato di circa quattro volte quando entrambi NTS e ML314 sono stati utilizzati. Il legame di NTSR1 a Arr2 è stato ulteriormente migliorato con l’introduzione di mutazioni 3A (Fig. 1c).

In base ai risultati di cui sopra, abbiamo eseguito studi strutturali utilizzando il mutante 3A di Arr2 in complesso con NTSR1 in presenza di NTS e ML314 ma il complesso dissociato in griglie cryo-EM a causa degli effetti negativi associati con vitrificazione del campione. Per superare questo problema di dissociazione, abbiamo fuso il NTSR1 umano wild type con il mutante umano 3A Arr2 al suo C-terminale con un linker di tre aminoacidi (GSA). Il dominio RIL del citocromo b562 (BRIL) è stato anche fuso all’N-terminale del recettore per aumentare l’espressione del complesso. Arr2 è stato ulteriormente stabilizzato fondendo la catena leggera Fab30, un frammento di anticorpo utilizzato per stabilizzare la forma attiva di Arr2,23 al suo C-terminale con un linker di 12 aminoacidi (GSAGSAGSAGSA). Il costrutto del complesso di fusione è stato co-espresso con la catena pesante His8-tagged Fab30 e una chinasi GPCR, GRK5, che ha fosforilato il recettore per un migliore legame di arrestin. La proteina complessa è stata purificata utilizzando una colonna di affinità al nichel in presenza di 2 µM NTS e 10 µM ML314, poi concentrata e ulteriormente purificata mediante cromatografia di filtrazione su gel per studi strutturali (Fig. 1d, e, vedi sezione “Materiali e metodi” per i dettagli).

La proteina complessa purificata BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 ha mostrato una temperatura di fusione relativamente alta (Tm) a 58 °C determinata dal saggio di termostabilità24 (Fig. 1f). Ha visualizzato una distribuzione uniforme quando ispezionato da EM colorazione negativa (Fig. 1g). Singola particella cryo-EM dati sono stati raccolti con un microscopio FEI Titan Krios. Un numero totale di 17.206 micrografie sono state registrate, e oltre 5 milioni di particelle complesse sono stati raccolti e ordinati per l’ulteriore elaborazione dei dati. La classificazione 2D ha identificato conformazioni multiple di particelle complesse. Dopo la classificazione 3D intensiva, 220.464 particelle (~ 4,5% del totale delle particelle iniziali) sono stati selezionati per la ricostruzione della struttura (informazioni supplementari, Fig. S1). La mappa di densità ha mostrato una risoluzione media di 4,8 Å determinata dal criterio di correlazione guscio Fourier (FSC) di 0,143, con la struttura del nucleo composto da Arr2 e Fab regione variabile (Fv) mostrando una gamma di risoluzione fino a 4,5 Å (Fig. 2a e informazioni supplementari, Figg. S1, S2). Tuttavia, l’eterogeneità conformazionale tra NTSR1 e Arr2 è ancora presente come illustrato nell’analisi multi-corpo (informazioni supplementari, Fig. S3), anche se una frazione molto bassa del dataset completo è stato utilizzato nella ricostruzione finale.

Nonostante la risoluzione moderata, la mappa EM ha permesso di determinare chiaramente la posizione e l’orientamento di NTSR1, Arr2 e Fab30 nel complesso (Fig. 2). Il modello complesso è stato costruito agganciando la struttura cristallina del complesso NTSR1-NTS (PDB: 4GRV),14 e la struttura di Arr2 legato con fosforilato vasopressina C-terminale peptide (V2Rpp) e Fab30 (PDB: 4JQI)23 nella mappa densità, seguita da regolazione manuale modello, perfezionamento spazio reale, e cicli iterativi di perfezionamento Rosetta e ricostruzione modello contro la mappa EM.25 Il modello finale complesso contiene NTSR1 residui da R49 a T416, di cui ICL3 (A270 a P292) e la regione linker tra l’elica 8 e la coda C-terminale (P384 a S404) sono mancanti. Il modello di Arr2 include i residui da T6 a M352 e il modello di Fab30 contiene un totale di 409 residui che comprendono sia la catena leggera che la catena pesante del Fab. Il BRIL fuso N-terminalmente e la piccola molecola ML314 non sono visibili nella mappa di densità e quindi non sono inclusi nel modello del complesso. Le statistiche e la geometria del modello strutturale sono riassunte nelle informazioni supplementari, tabella S1.

La struttura complessiva del complesso Arr2-NTSR1

Il complesso Arr2-NTSR1 è formato dall’assemblaggio asimmetrico dei due componenti con l’asse orizzontale di Arr2 che interseca la superficie interna della membrana cellulare a circa 20°, con conseguente interazione degli anelli idrofobici C-edge (L191 e M192, e L334 attraverso L338) della arrestina con la membrana cellulare (Fig. 2a, b). Questo è coerente con la struttura cristallina del complesso visivo arrestina-rhodopsin, che per la prima volta ha mostrato l’assemblaggio asimmetrico arrestina-GPCR e ha confermato la funzione degli anelli idrofobici C-edge dell’arrestina come un’ancora di membrana che stabilizza il legame dell’arrestina al recettore incorporato nella membrana, che è stato successivamente confermato sperimentalmente.7,26,27 L’interazione degli anelli idrofobici C-edge di Arr2 con lo strato di membrana cellulare suggerisce che la capacità di legare i lipidi è una proprietà generale dei membri della famiglia arrestin.

Nonostante la somiglianza nell’assemblaggio asimmetrico del complesso Arr2-NTSR1 con quello del complesso Arr1-rhodopsin, l’orientamento relativo di arrestin al recettore è drammaticamente diverso tra questi due complessi arrestin-recettore. La sovrapposizione dei TMD del recettore di questi due complessi rivela che l’orientamento di Arr2 è ruotato di 90° intorno all’asse transmembrana da quello dell’arrestina visiva (Fig. 2c). In questo nuovo orientamento, le posizioni di ICL3 e sia TM5 e TM6 del recettore sono puntati verso il dominio N-terminale di Arr2, rendendo possibile per ICL3 di assomigliare la coda C-terminale di interagire con il dominio N di Arr2 (Fig. 2b).

Per valutare la stabilità conformazionale del complesso di assemblaggio, abbiamo eseguito sei indipendenti, due microsecondi-lungo tutte le simulazioni dinamiche molecolari atomo del complesso Arr2-NTSR1 senza il Fab30 stabilizzante. Per tutto il corso della simulazione, il C-edge loop L334 attraverso L338 è rimasto in associazione con i lipidi di membrana e la coda C-terminale di NTSR1 è rimasto in interazione con il dominio N-terminale di Arr2 (informazioni supplementari, Figg. S4 e S5). Tuttavia, la struttura del nucleo di arrestin può ruotare intorno alla struttura cryo-EM in misura limitata, e il loop dito esteso può sganciarsi dal nucleo TMD NTSR1 (informazioni supplementari, Fig. S5). Questi dati di simulazione suggeriscono che l’anello delle dita così come l’interfaccia del nucleo tra Arr2 e il recettore è altamente dinamico e l’assemblaggio del complesso Arr2-NTSR1 catturato dalla struttura cryo-EM rappresenta probabilmente uno dei molti stati conformazionali, che è coerente con il fatto che l’eterogeneità conformazionale dell’assemblaggio complesso Arr2-NTSR1 esiste ancora nelle particelle della classe 3D utilizzata nella ricostruzione finale cryo-EM (informazioni supplementari, Fig. S3).

L’interfaccia del nucleo Arr2-NTSR1

Il complesso Arr2-NTSR1 è assemblato attraverso interazioni intermolecolari che consistono in due interfacce principali separate: un’interfaccia del nucleo costituito da due patch separate tra gli anelli di cresta centrale di arrestina e il lato intracellulare del recettore TMD, e un’interfaccia di coda tra il dominio N-terminale di Arr2 e il recettore C-terminale coda (Fig. 2b). Una zona dell’interfaccia del nucleo tra Arr2 e NTSR1 è il finger loop (da E66 a L71) dell’arrestina, che è inserito nella cavità intracellulare del recettore TMD e circondato da ICL1, ICL2, TM5 e 6, del recettore (Fig. 3a). In questa configurazione, la superficie superiore del finger loop forma un’interfaccia diretta con il giro tra TM7 e l’elica 8 del recettore (Fig. 3a).

Per convalidare l’interfaccia della struttura complessa, abbiamo eseguito esperimenti di reticolazione disolfuro basati sulle cellule. In questa serie di esperimenti, sono stati introdotti residui di cisteina site-specific all’interfaccia di Arr2 e NTSR1. Entrambe le proteine con mutazioni di cisteina sono state co-espresse in cellule come proteine separate. I prodotti di crosslinking si sono formati trattando le cellule con un reagente ossidante e sono stati monitorati da SDS-PAGE seguito da western blotting per rilevare il tag Flag che è stato fuso al C-terminale di Arr2. Lo stesso metodo è stato utilizzato per convalidare l’interfaccia visiva arrestin-rhodopsin complesso.7,9 reazioni di reticolazione di un totale di 177 coppie di residui sono stati eseguiti, tra i quali abbiamo osservato forti segnali di reticolazione tra Arr2 residui D67 e L68 nella regione centrale del loop dito, con NTSR1 residui V367 attraverso N370 situato a cavallo tra TM7 e elica 8 (Fig. 3b, e le posizioni di tali residui di interfaccia sono presentati come sfere in Fig. 3a). Come confronto, il residuo L71 all’estremità C-terminale del finger loop ha mostrato nessun segnale di crosslinking o molto debole con questi residui NTSR1 (Fig. 3a, b). Diversi residui di loop dito sono stati trovati anche a reticolazione con residui a ICL1 (Q98) e TM6 (R294 e A297), che sono componenti della cavità intracellulare del recettore TMD (informazioni supplementari, Fig. S6). Questi dati di reticolazione hanno convalidato la patch di interfaccia tra Arr2 finger loop e il recettore e hanno dimostrato che l’arrestin finger loop serve come componente chiave dell’interfaccia centrale di questo complesso Arr2-GPCR.

Le sequenze aminoacidiche di Arr2 finger loop sono arricchite di residui acidi, simili a quelli di arrestin visiva (Fig. 3c), che è nota per legarsi alla cavità TMD caricata positivamente.7 Quando NTSR1 e rodopsina sono sovrapposti, il finger loop di Arr2 occupa lo stesso spazio della regione corrispondente dell’arrestina visiva, ma non si inserisce così in profondità nella cavità TMD come l’arrestina visiva (Fig. 3d), indicando che l’associazione del finger loop di Arr2 con la cavità intracellulare di NTSR1 TMD potrebbe essere più dinamica di quella tra arrestina visiva e rodopsina.

L’altra patch dell’interfaccia del nucleo tra Arr2 e NTSR1 è l’interazione delle regioni della cresta di Arr2 con ICL1 e ICL2 del recettore, che è diversa da quella nel complesso arrestina visiva-rodopsina. In contrasto con gli orientamenti simili degli anelli delle dita delle due arrestine, la sovrapposizione dei due recettori ha lasciato le strutture centrali delle arrestine in due orientamenti che differiscono di un angolo di circa 90° come mostrato in Fig. 2c. I diversi orientamenti delle strutture centrali di Arr2 e delle arrestine visive nei loro complessi GPCR risultano in diverse modalità di legame delle regioni di cresta delle arrestine con i loop intracellulari dei recettori, in particolare ICL1 e ICL2, in questi due complessi arrestin-GPCR (Figg. 2c e 4).

Il confronto strutturale di NTSR1 e rodopsina rivela che condividono una conformazione conservata TMD con il loro ICL1 che adotta un loop esteso e ICL2 che forma una breve elica nei loro rispettivi complessi legati all’arrestina. L’elica ICL2 della rodopsina è inserita nella fessura formata dall’ansa centrale, dall’ansa inferiore e dall’ansa lariat dell’arrestina visiva (definita fessura MBL).7 Tuttavia, la stessa fessura MBL in Arr2 è occupata dall’ICL1 di NTSR1 (Fig. 4a) a causa del diverso orientamento dell’arrestina. Corrispondentemente, ICL2 di NTSR1 è ruotato lontano dalla fessura MBL per riposizionarsi nella parte superiore dell’anello lariat (Fig. 4a). Esperimenti di reticolazione disolfuro hanno mostrato segnali di reticolazione tra i residui del recettore L94 attraverso S96 su ICL1 di NTSR1 e residuo G286 al ciclo inferiore di Arr2, che è coerente con l’interfaccia di ICL1 di NTSR1 con questa regione cresta di Arr2 (Fig. 4b).

ICL3 del recettore, nonostante sia invisibile nella mappa di densità, forma probabilmente un’interfaccia con il dominio N di β-arrestina basato sulla conformazione del complesso Arr2-NTSR1 (Fig. 2b). Disolfuro reticolazione dati hanno mostrato che ICL3 residui Q275, C277, T278 e V279 di NTSR1 reticolato con residui T56, T58, V81 e N83 sulla superficie superiore del Arr2 N-dominio (Fig. 4c e informazioni supplementari, Fig. S6). Questi residui ICL3 anche mostrato forti segnali di reticolazione con Arr2 residuo K160 (Fig. 4d). Ulteriori segnali di crosslinking disolfuro sono stati osservati tra la maggior parte dei residui da Q273 a G280 del NTSR1 ICL3 e il residuo P14 da Arr2 (Fig. 4d). Questi dati reticolazione indicano che ICL3 del recettore è posizionato vicino al N-dominio e può interagire con i residui alla superficie del N-dominio di Arr2 (Fig. 4e).

L’interfaccia coda Arr2-NTSR1

Mentre l’interfaccia centrale Arr2-NTSR1 è altamente dinamico, l’interfaccia coda tra NTSR1 C-terminale coda e il Arr2 N-dominio sembra simile a quella nel visivo arrestin-rhodopsin complex9 (Fig. 5). Abbiamo osservato la densità di elettroni ad un livello di contorno di 0,016 (a cui la densità della struttura complessiva complesso può essere correttamente mostrato) di circa dieci residui di coda C-terminale di NTSR1 che si legano al primo filo β di Arr2 (Fig. 5a). Tuttavia, informazioni dettagliate su questa regione della coda C-terminale, compresi i suoi residui specifici, è difficile da identificare a causa della risoluzione limitata della mappa di densità. Analisi di NTSR1-Arr2-Fab30 proteina di fusione mediante spettrometria di massa (Fig. 5b e informazioni supplementari, Fig. S7) ha rivelato che sette residui di serina o treonina da S401 a T416 su NTSR1 coda C-terminale erano fosforilati, suggerendo il possibile coinvolgimento di questa regione nel legame alla superficie positivamente carica della arrestina N-domain. Esperimenti di reticolazione disolfuro hanno mostrato che Arr2 residuo P14 al turno C-terminale del primo filamento β fortemente reticolato con i residui del recettore H406 attraverso S410 (Fig. 5d e informazioni supplementari, Fig. S6), che ha indicato che i residui del recettore C-terminale a H406 sono probabilmente la regione che si lega a N-domain arrestin (Fig. 5c).

Un modello per l’interazione Arr3-GPCR

Il genoma umano contiene due sottotipi di β-arrestina: Arr2 e Arr3, che condividono oltre il 53% di identità di sequenza ma hanno sia alcune funzioni sovrapposte che alcune divergenti. Poiché Arr3 ha mostrato un’affinità di legame con NTSR1 simile a quella di Arr2 (Fig. 1b), abbiamo voluto verificare se la modalità di legame di Arr3 a NTSR1 è conservata con quella di Arr2. I nostri esperimenti di reticolazione disolfuro hanno mostrato che i residui di Arr3 finger loop da E67 a L72 (corrispondenti a E66 a L71 di Arr2) si sono reticolati con il corrispondente set di residui (A369 e N370) a cavallo tra TM7 e l’elica 8 di NTSR1 (informazioni supplementari, Fig. S8), indicando una conservata interfaccia finger loop con TM7 e H8 del recettore tra queste due β-arrestine.

Inoltre, i dati di reticolazione disolfuro hanno mostrato che Arr3 residuo P15 (corrispondente a P14 di Arr2) reticolato con i residui da N405 a T407 della coda C-terminale del recettore, suggerendo una simile interfaccia coda tra Arr3 e NTSR1 (informazioni supplementari, Fig. S8). Simile modello di reticolazione tra NTSR1 ICL3 residui e Arr3 N-dominio residui, tra cui P15 al C-terminale del primo β-stand e K161 (corrispondente a K160 di Arr2) sul ciclo tra i primi β-fila sono stati osservati anche (informazioni supplementari, Fig. S8). Insieme, questi dati di reticolazione suggeriscono che l’assemblaggio complessivo di Arr3 con NTSR1 è simile a quello di Arr2 a NTSR1 in questa configurazione nucleo impegnato.

Un modello per il reclutamento di β-arrestine da parte di 5-HTR1A e 5-HTR1B

Molti GPCR, compresi i recettori della serotonina 5-HTR1A e 5-HTR1B così come diversi recettori della dopamina, mancano o contengono una coda C-terminale molto corta e sono proposti per utilizzare il loro ICL3 come interfaccia alternativa per reclutare β-arrestine.28 5-HTR1A e 1B hanno lunghi ICL3 con molteplici siti di fosforilazione per una potenziale interazione con i domini N caricati positivamente delle β-arrestine. I nostri saggi di legame biochimico dimostrato che entrambi i recettori legati a Arr2 e 3 con attività simile a quella di NTSR1 con Arr2 (informazioni supplementari, Fig. S9). Tuttavia, quando la struttura del complesso visivo arrestina-rhodopsin è stato utilizzato come modello, è stato difficile modellare la modalità di legame del fosforilato ICL3 di 5-HTR1A o 1B alla fessura caricata positivamente sul N-dominio delle β-arrestine. Questo perché TM5 e 6 così come ICL3 della rodopsina sono posizionati nel sito opposto alla superficie caricata positivamente della catena N dell’arrestina nella struttura del complesso arrestina-rodopsina.

La struttura del complesso Arr2-NTSR1, tuttavia, mostra un complesso distinto con Arr2 ruotato di 90° dalla posizione dell’arrestina visiva nel complesso arrestina-rodopsina (Fig. 2c). TM5 e TM6 di NTSR1 sono, quindi, posizionati sopra la superficie anteriore del dominio N di Arr2, permettendo a ICL3 del recettore (non visibile nella struttura) di raggiungere il dominio N caricato positivamente di Arr2 (Fig. 4e). I nostri dati di reticolazione disolfuro forniscono la prova che NTSR1 ICL3 può interagire con la fessura caricata positivamente del N-dominio di Arr2 e 3 (Fig. 4c-e, informazioni supplementari, Figg. S6 e S8). Pertanto, la struttura del complesso Arr2-NTSR1 può servire come modello adatto per modellare l’interfaccia delle β-arrestine con 5-HTR1A e 5-HTR1B.

Utilizzando la struttura Arr2-NTSR1 come modello, e la struttura cristallina di ergotamina-bound 5-HTR1B come modello iniziale per 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 abbiamo generato un modello di omologia del complesso Arr2-5-HTR1B, in cui l’interfaccia centrale tra Arr2 e 5-HTR1B è simile a quella del complesso Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, b). Abbiamo poi eseguito esperimenti di reticolazione disolfuro per testare l’assemblaggio complesso di Arr2-5-HTR1B mostrato nel modello di omologia (Fig. 6c e informazioni supplementari, Fig. S10).

Abbiamo osservato segnali di crosslinking tra i residui di finger loop D67 L68, V70, e L71 di Arr2 e i residui N373, E374 e D375 al giro tra TM7 e l’elica 8 di 5-HTR1B (Fig. 6c). I residui D67, L68, V70 e L71 dell’anello del dito si sono reticolati con i residui R308 e K311 del recettore sulla superficie interna di TM6 (informazioni supplementari, Fig. S10). Questi dati di crosslinking hanno supportato una modalità conservata di legame del finger loop Arr2 con la cavità intracellulare del dominio TM 5-HTR1B (Fig. 6a, b). I dati di crosslinking disolfuro hanno anche mostrato segnali di crosslinking tra i residui Arr2 R285 e G286 nel loop inferiore di arrestin con ICL1 residuo K79 di 5-HTR1B (Fig. 6c e informazioni supplementari, Fig. S10). Questo crosslinking specifico è coerente solo con l’orientamento dell’arrestina nel modello Arr2-NTSR1, ma non è compatibile con il complesso visivo arrestina-rhodopsin. Insieme questi dati di reticolazione hanno sostenuto un’interfaccia centrale tra la regione della cresta Arr2 e il lato intracellulare del dominio TM 5-HTR1B, che è conservato con quello nel complesso Arr2-NTSR1 (Fig. 6a-c).

5-HTR1B contiene più residui di serina e treonina nella zona centrale del suo lungo ICL3 che può essere fosforilato per il legame alla superficie del N-dominio di arrestin caricato positivamente (Fig. 6d). Abbiamo progettato mutazioni coppia cisteina nella potenziale interfaccia tra ICL3 del recettore e il N-dominio di Arr2 e trovato che ICL3 residui T268, S295, L298 e E300 sono stati reticolati con residui sulla superficie del top β-sheet, tra cui T56, V81, N83, K147 e K157 di Arr2 (Fig. 6e e informazioni supplementari, Fig. S10). I residui S260 e T268 su ICL3 hanno mostrato segnali di crosslinking con i residui K11 sul primo filamento β e N15 sul turno che segue il primo filamento β di Arr2 (Fig. 6e e informazioni supplementari, Fig. S10). Il residuo S260 è vicino all’estremità C-terminale di TM5, e la sua reticolazione con K11 sul lato caricato positivamente del dominio N di Arr2 è possibile solo nell’orientamento Arr2-NTSR1 ma non nell’orientamento dell’arrestina-rhodopsin perché nella struttura del complesso arrestina-rhodopsin, sia TM5 che 6 del recettore sono posizionati sul sito posteriore della superficie caricata positivamente del dominio N dell’arrestina.

Abbiamo anche osservato un modello di reticolazione Arr2 quasi identico tra 5HTR1A e 5-HTR1B. Segnali di reticolazione sono stati osservati tra i residui D67, L68, V70 e L71 di Arr2 e i residui N404, K405 e D406 (corrispondenti a N373, E374 e D375 di 5-HTR1B) a cavallo tra TM7 e elica 8 di 5-HTR1A (informazioni supplementari, Fig. S11). I residui D67 e L68 dell’anello del dito erano anche reticolati con i residui del recettore R339 e K342 (corrispondenti a R308 e K311 di 5-HTR1B) sulla superficie interna di TM6 (informazioni supplementari, Fig. S11). Abbiamo inoltre osservato il crosslinking disolfuro tra Arr2 fondo loop residui R285 e G286 e ICL1 residuo L67 di 5-HTR1A (corrispondente a K79 di 5-HTR1B) (informazioni supplementari, Fig. S11). Questi dati di reticolazione supportano un’interfaccia simile tra Arr2 con 5-HTR1A e 5-HTR1B, che è conservata con quella nel complesso Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, c).

L’ICL3 di 5-HTR1A contiene più di 100 residui di aminoacidi (da 233 a 336) con 12 residui di serina o treonina che costituiscono sei codici di fosforilazione parziale insieme a residui di acido glutammico o acido aspartico (informazioni supplementari, Fig. S12). Abbiamo progettato mutazioni di coppia cisteina per mappare la potenziale interfaccia tra ICL3 di questo recettore e il dominio N di Arr2. I dati di crosslinking hanno mostrato che i residui ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 e D285 si sono reticolati con V81 e K160 nel dominio N di Arr2 (informazioni supplementari, Fig. S11). Il residuo P14 dal primo filamento β di Arr2 ha fortemente reticolato con i residui ICL3 N300, P308, P315, P318, P321 e R323 di 5-HTR1A (informazioni supplementari, Fig. S11).Questi dati di reticolazione, insieme al modello di omologia del complesso Arr2-5-HTR1B, hanno fornito un quadro generale di come 5-HTR1A e 5-HTR1B reclutare Arr2.

In questo articolo, riportiamo una struttura di Arr2 in complesso con NTSR1, un GPCR di classe A, da analisi crio-EM singola particella. Mentre la modalità di legame dell’interfaccia di coda tra la coda C-terminale del recettore e la catena N dell’arrestina caricata positivamente è conservata con quella nel complesso visivo arrestina-rhodopsin, questa struttura mostra un diverso orientamento di Arr2 da quello visto nel complesso visivo arrestina-rhodopsin. La modellazione dell’omologia e la mappatura dell’interfaccia di reticolazione disolfuro dimostrano che questa interfaccia centrale è conservata nei complessi Arr2 con la sottofamiglia 5-HTR1A e 1B. In questi modelli complessi, l’orientamento di Arr2 permette a ICL3 del recettore di raggiungere la superficie della N-domain di Arr2, fornendo la possibilità per un GPCR che manca di una coda C-terminale di utilizzare il suo ICL3 per interagire con la N-domain di arrestin. Poiché Arr2 e Arr3 sono partner proteici ubiquitariamente espressi per la trasduzione del segnale di molti GPCR non visivi, i nostri studi strutturali e biochimici sull’interazione di Arr2 con i membri della sottofamiglia NTSR1 e 5-HTR1 hanno fornito un modello alternativo per comprendere l’interazione di Arr2 e Arr3 con i GPCR non visivi.