アポリポ蛋白E2遺伝子型は2型糖尿病発症の2倍増と関連する。 長期観察研究からの結果

Abstract

Background。 アポリポ蛋白E（APOE）多型は心血管（CV）疾患と関連しているが，2型糖尿病（T2DM）長期発症との相互作用は不明である。 我々は、南ヨーロッパの一次予防コホートにおいて、APOE遺伝子型と長期的な（i）CVイベントおよび（ii）T2DM発生率との関連を調査した。 方法 脂質クリニックで追跡調査を受けている合計436名の患者において、個々のAPOE遺伝子型を評価し、追跡期間の中央値は15年であった。 主要なCVイベント（CV死亡、心筋梗塞、脳卒中）およびT2DM発症に関するデータを収集した。 結果 APOE遺伝子型の違いによる主要なCVイベント発生率に関する差は認められなかった。 しかし、T2DMの既往がある39人を除くと、APOE2キャリアはAPOE3キャリア（27.1%）およびAPOE4キャリア（28.7%）よりも追跡中のT2DM発生率が高い（42.2%）ことが示された。 APOE2キャリアにおけるT2DM発症の年齢、性、中性脂肪、スタチン使用量調整ORは、野生型APOE3キャリアと比較して1.8（95％CI 1.1-2.9, p=0.03）であった。 交絡因子としてのスタチンの役割に対処するために、スタチン治療を受けている患者のT2DM発生率を解析した。 スタチン治療を受けているAPOE2キャリアは、APOE3ホモ接合体（31.6%）およびAPOE4キャリア（32.5%）と比較して、T2DM発生率も高かった（57.9%）。 交絡因子を調整した後、スタチン投与中のAPOE2キャリアは、APOE3ホモ接合体と比較してT2DMリスクが同様に2倍増加した（OR 2.1, 95%CI 1.1-4.0, p=0.03）。 結論 我々の知見は、APOE2キャリアにおけるT2DM発生率の2倍増を示唆している。 このことは、APOE遺伝子型に合わせた特異的な糖代謝異常のフォローアップを促すかもしれない。 はじめに

心臓血管（CV）疾患は、一貫して治療成績が向上しているにもかかわらず、先進国における疾病および死亡の主要原因のままである。 CVリスクは環境因子とアポリポ蛋白E（APOE）のような遺伝因子の影響を受けている。 APOEは第19染色体に位置する多型糖タンパク質で、脂質代謝において多機能な役割を担っている。 カイロミクロン、超低密度（VLDL）、高密度リポタンパク質（HDL）の形成に不可欠であり、末梢組織から肝臓へのコレステロールの輸送にも関与している。 APOE遺伝子には3つの対立遺伝子（E2、E3、E4）があり、6つの異なる遺伝子型（E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4）を生み出す。 APOE遺伝子座は、長年にわたり冠動脈疾患（CHD）の感受性遺伝子座として同定されてきたが、この関連を検討した疫学研究の結果は一貫していない。

歴史的に、APOE4キャリアは、（i）CHDの発症、（ii）冠動脈再灌流処置にかけられるリスク、（iii）CHDによる死亡、の高いリスクに苦しんでいると説明されてきた。 最近では、このような関連性を再現できなかったデータもあるが、新しいエビデンスにより、E4対立遺伝子がCHDの危険因子としての役割を担っていることが裏付けられた。 さらに、これらの多型が2型糖尿病（T2DM）の有病率に与える影響についても論争がある。 興味深いことに、APOE遺伝子型の違いによるT2DMの長期罹患率は、これまでプロスペクティブに評価されたことはない。 我々のグループは以前、APOE4キャリアは、非キャリア（50.6±13.8歳）に比べ、より若い年齢（44.2±14.7歳）で脂質専門クリニックに紹介されていることを示した（p<0.001） 。 本研究では、南ヨーロッパの患者コホートにおいて、APOE遺伝子型が長期的な（i）CVアウトカムと（ii）T2DM発生率に与える影響を調査することを目的とした

2. 材料と方法

2.1. 研究デザインと母集団

1994年1月から2007年10月の間に三次病院の脂質異常症専門外来に連続入院し追跡調査した691人を対象に、単施設研究を前向きに実施した。 全患者は，脂質プロファイルの著しい異常やコントロール困難，家族性脂質異常症の疑いにより，プライマリーケア医や院内の他の専門医から紹介され受診した。 脂質目標値を達成するためにどのような薬剤を使用すべきかについて、正式な勧告は行わなかった。 APOE遺伝子型は、調査目的のみで実施されたため、脂質低下薬に関する治療上の決定には考慮されなかった。 遺伝子型を決定していない家族性高コレステロール血症（HeFH）患者で、CVイベントの既往がある患者は除外した。 患者は中央値（四分位範囲（IQR））15年（12-17年）追跡され、すべての患者は10年以上追跡されていた。 3人（0.7%）だけが追跡不能となった。

この研究は地元の施設委員会によって承認され、すべての患者がインフォームドコンセントを行った。 危険因子の評価

紹介時の年齢、性別、T2DM、喫煙状況、アルコール摂取など、ベースライン、人口統計学的変数、臨床変数を収集。 糖尿病は，空腹時血糖値3.3 mmol.L-1以上，または血糖降下薬の使用と定義した。 高血圧は、収縮期血圧140mmHg以上、拡張期血圧90mmHg以上、または現在降圧治療を受けているものと定義された。 現在の喫煙（1日1本以上）および飲酒（1日2単位以下のアルコール飲料）は定義された。 初診時に，いくつかのベースライン検査値を取得し，12時間空腹時採血で，総コレステロール（TC），HDL，LDL，トリグリセリド，アポリポ蛋白（アポ）AおよびアポB，リポ蛋白（Lp）（a）値などの完全脂質プロファイルを標準技術でアッセイした.

2.3. DNA抽出とAPOE遺伝子型判定

DNA は標準的な手順で全血検体から抽出された。 これらの試料から得られたゲノムDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応とリバースハイブリダイゼーションを用いてAPOE多型（rs7412とrs429358）の解析を行った。 APOE遺伝子型のDNA塩基配列評価の詳細は、別の場所で発表されている 。 ApoE濃度はネフェロメトリーで測定された

2.4. イベントの定義

すべての参加者は、全国健康登録と健康データプラットフォーム（PDS）との記録連携を通じてフォローアップされた。 主要評価項目は、CV死亡率、MI、脳卒中の複合とした。 MIは，急性心筋虚血の臨床的証拠を有し，99パーセンタイル上限基準値を超える値が少なくとも一つある心筋トロポニン値の上昇/下降が検出され，以下の少なくとも一つが認められた急性心筋梗塞と定義された。 (i）心筋虚血の症状、（ii）新たな虚血性心電図変化、（iii）病的Q波の発生、（iv）虚血性病因と一致するパターンでの新たな生存心筋の損失または新たな局所壁運動異常の画像証拠、（v）血管撮影による冠動脈血栓の同定 …。 脳卒中は、出血または梗塞の結果、脳、脊髄、網膜の血管損傷によって引き起こされた局所的または全体的な神経機能障害の急性エピソードと定義された。 CV死亡は、急性心筋梗塞、心臓突然死、心不全による死亡、脳卒中による死亡、CV処置による死亡、CV出血による死亡、およびその他のCV原因による死亡と定義した。 副次的評価項目はT2DM発症率である

2.5. 統計解析＜7077＞＜4811＞アレルの頻度は遺伝子計数法を用いて決定した。 遺伝子型の分布についてはHardy-Weinberg equilibriumを行った。 連続変数は平均値±SDで表した。 分布が正規分布でない場合は中央値およびIQRを用い，Kolmogorov-Smirnov検定を用いて評価した。 グループ間の比較には，正規変数には一元配置分散分析，非正規変数にはクラスカル・ウォリス検定が用いられた． カテゴリー変数はパーセンテージで示し、カイ二乗またはフィッシャーの正確検定を使用して比較した。

いくつかの個々の遺伝子型群における患者数は、グループ比較をサポートするには少なすぎた。したがって、他のいくつかの報告と同様の方法で、E4アレルの1コピー以上の患者（APOE4キャリア）またはE2アレルの1コピー以上の患者（APOE2キャリア）とそうではない患者（APOE3ホモ接合体）を比較した。 この種の他の多くの研究と同様に、E4/2遺伝子型を持つ8人の被験者は、E2およびE4対立遺伝子がCHDリスクに対して反対の効果を持つことが提案されているので、その後の解析から除外された。 CVリスクは、まずAPOE対立遺伝子との関連で非調整モデルで検討し、次に年齢、性別、高血圧（有・無）、糖尿病（有・無）、喫煙状況（現在、非喫煙）、スタチン治療（有・無）の調整を行った。 参加者は、最初のCVイベント発生時、死亡時、または最終フォローアップ時に打ち切られた。 T2DMは、まずAPOE対立遺伝子との関係を調整しないモデルで検討し、次に年齢、性、スタチン治療（有無）、トリグリセリドで調整した。 参加者は、T2DMの診断時、死亡時、最終フォローアップ時に打ち切られた。 統計解析はすべてSPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) を用いて行い、有意水準はp<0.05とした。 結果

3.1. 患者集団

南ヨーロッパ系の白人患者444名（男性259名、女性185名）を対象とし、遺伝子型を決定した。 E2、E3、E4対立遺伝子の頻度は、それぞれ7.9、78.5、13.6％であった（表1）。 E4/2遺伝子型を持つ被験者を除くと、436人中283人がAPOE3ホモ接合体（64.9％）、102人がAPOE4キャリアー（23.4％）、51人がAPOE2キャリアー（11.7％）であった。 APOE対立遺伝子の分布は、Hardy-Weinberg平衡であった。 対立遺伝子の分布に関して、性別による有意差は認められなかった。

人口統計学的，臨床的，検査的変数に関してAPOE群を比較した（表2および3）。 ベースライン時、性別、体重、喫煙習慣、飲酒量に関して差は認められなかった。 血圧の平均値は各群とも正常範囲であったが、高血圧はAPOE4キャリアでより少なかったが、統計的有意差には達しなかった（APOE4: 38.2% vs. APOE2: 52.9% and APOE3: 49.1%, p=0.11）。 一方、APOE2キャリアはT2DMの有病率が数値的に高かった（APOE2: 11.8% vs. APOE3: 8.8% and APOE4: 7.8%, p=0.72）。

脂質プロファイルに関して、LDL、トリグリセリド、ApoE、ApoBは群によって有意差があった(図1)。 APOE2キャリアはLDLが低かった（APOE2: 3.3 (2.6-4.5) vs APOE3: 4.1 (3.0-4.9) and APOE4: 4.0 (3.0-5.3) mmol.L-1, p=0.3）．04）、ApoB値（APOE2: 3.1（2.4-3.7） vs APOE3: 3.8（3.1-4.5） and APOE4: 3.5（3.0-3.9） mmol.L-1, p<0.001）であった。 一方、APOE2キャリアでは、残りのグループと比較してトリグリセリドが著しく高かった（APOE2：8.7（5.5-13.5） vs APOE3：5.2（3.2-8.8） and APOE4：4.5（2.8-11.0） mmol.L-1, p<0.001）。 予想通り、APOE4キャリアではApoE濃度が低かった（APOE4: 0.11 (0.09-0.16) vs. APOE2: 0.20 (0.15-0.33) and APOE3: 0.14 (0.11-0.18) mmol.I.）。L-1、p<0.001）。

アスピリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、β遮断剤、カルシウム拮抗剤の使用に関しては群間差は認められなかった。 抗脂質薬の使用歴については、APOE3ホモ接合体ではAPOE2およびAPOE4キャリアに比べスタチンの使用頻度が高かった（APOE3：63.3%、APOE2：47.1%、APOE4：47.1%、p＝0.005）

3.2. APOE遺伝子型と長期的なCVアウトカム＜7077＞＜4811＞患者は中央値で15年（IQR12-17）の期間追跡された。 この間，主要評価項目は436例中42例（9.6％）で発生し，19例（4.4％）のMI，16例（3.7％）の脳卒中が含まれた。7例（1.6％）は初発イベントとしてCV死があった。 最初のイベント発生までの期間の中央値（IQR）は7（4-11）年であった。 APOE4キャリア（8.8％、未調整OR 0.9, 95％CI 0.4-1.9, p=0.82）またはAPOE2キャリア（9.8％、未調整OR 1.0, 95％CI 0.4-2.5, p0.95）間の追跡時の主要エンドポイント発生率は野生型APOE3キャリア（9.9％）と差が認められなかった（図2（a））。 年齢、性別、従来のCV危険因子（T2DM、高血圧、喫煙）の有病率、スタチン使用量を調整しても、APOE多型と主要エンドポイント発生率との間に関連は認められなかった（APOE2およびAPOE4キャリアは、APOE3ホモ接合体と比較してそれぞれOR 0.9, 95%CI 0.3-3.1, p=0.89, 1.3, 95%CI 0.5-3.3, p=0.62）。

(a) CV mortality, MI, and stroke

(b) T2DM incidence

(a) CV mortality.1, MI, and stroke

(a) CV mortity.1、MI、および脳卒中。 MI, and stroke
(b) T2DM incidence

Figure 2

3.3.CV死亡率、MI：心筋梗塞、脳卒中発生率、APOE：アポリポ蛋白E

。 APOE遺伝子型とT2DM発症率

T2DMのベースライン有病率はAPOE2キャリアで数値的に高いことに注目し、異なるAPOE多型におけるT2DM発症率を調べた。 T2DMの既往がある患者（n＝39，8.4％）はすべて除外し，390名の患者について追跡調査時のT2DM発生率を求めた（7名は追跡調査時のT2DM状態を決定することができなかった）。 T2DMは、APOE2キャリア（n=19、42.2％）でAPOE3キャリア（n=70、27.1％）およびAPOE4キャリア（n=27、28.7％）よりも高率であった。 未調整の解析では、T2DM発生率はAPOE3ホモ接合体よりもAPOE2キャリアで高かった（OR 1.8, 95%CI 1.1-2.9, p=0.03）（図2（b））。 年齢、性別、中性脂肪、スタチン使用を調整した後、APOE2キャリアでは野生型APOE3キャリアと比較して1.8倍の発生率（OR 1.8, 95%CI 1.1-3.1, p=0.03）が認められた。 APOE4キャリアについては、同じ変数で調整しても（OR 1.3, 95%CI 0.9-2.5, p=0.13）、APOE3キャリアと比較してT2DM発症率に有意差は認められなかった。

スタチン剤はT2DM発症における交絡因子として重要な役割を果たすことがあるので、我々はスタチン服用患者（n = 222）のT2DM発症割合についても推計を行った。 その結果，スタチン治療中のAPOE2キャリアは，APOE3ホモ接合体（31.6％）およびAPOE4キャリア（32.5％）と比較して，T2DMの発症率が数値的に高かった（57.9％）。 一方、スタチンを使用せず、他の脂質低下薬を使用している患者（n＝35）では、APOE遺伝子型の違いによるT2DM発症率の差は認められなかった（APOE2: 44.4% vs. APOE3: 35.7% vs. APOE4: 58.3%, p＝0.58)。 スタチン治療を受けたAPOE2キャリアは、APOE3キャリアに比べてT2DMの発生率が高かった（年齢、性別、中性脂肪で調整したOR 2.1, 95%CI 1.1-4.0, p=0.03）。 一方、スタチン治療を受けたAPOE4キャリアは、APOE3ホモ接合体と差がなかった（年齢、性、中性脂肪調整後OR 1.3、95%CI 0.7-2.4、p=0.42）。 最後に、スタチン治療を受けたAPOE2キャリアにおけるT2DMの発生率は、非治療の場合と比較して差は認められなかった（年齢、性別、およびトリグリセリド調整後のOR 1.9, 95%CI 0.6-5.7, p=0.27）＜794＞＜1371＞4.スタチン治療を受けたAPOE2キャリアのT2DMは、年齢、性別、およびトリグリセリド調整後のOR 1.9, 95%CI 0.6-5.7, p=0.27）。 考察＜3112＞＜4811＞本研究では，APOE遺伝子型は長期的なCVイベントの予測因子ではなかったが，APOE遺伝子型とT2DM長期発症率との間に有意な相互作用があり，APOE2キャリアではT2DM長期発症率が高いことが分かった。＜794＞＜4811＞APOE遺伝子型のCVアウトカムへの影響は文献上一貫性がないが，E4アレルはCHDがわずかに増加すると思われる． 我々のコホートでは，よく知られたCV危険因子を調整した後でも，この関連は有意でないままであった。 我々の研究におけるイベントの発生率は、Baltimore Longitudinal Study of Agingの730人のコホート（平均追跡期間：男性20年、女性13年）で観察されたものと同様であり、患者の4.9％がMIを、1.0％がCV死を発症していた … しかし、我々の知見とは異なり、この研究では、APOE4対立遺伝子は、男性では冠動脈イベントのリスクを増加させるが（RR 2.9, 95%CI 1.8-4.5, p<0.001）、女性ではそうではない（RR 0.9, 95%CI 0.4-1.9, p=0.62） ことが観察された。 追跡期間が短い研究では，APOE遺伝子型が冠動脈のリスクと関連するかどうかについては，まだ論争が残っている。 17の研究を含むメタアナリシスでは、APOE4キャリアではCHDリスクがわずかに高く（OR 1.06, 95%CI, 0.99-1.13）、APOE2キャリアではリスクが20％低い（OR 0.80, 95%CI, 0.70-0.90）ことが観察された。 同様に、22の研究を含む別のメタアナリシスでは、野生型APOE3キャリアと比較して、APOE4キャリアではMIリスクが高く（OR 1.20, 95%CI, 1.08-1.34） APOE2キャリアではリスクが低い（OR 0.79, 95%CI, 0.70-0.91） と報告された。 一方、これまでで最大の前向きコホート（n = 22,169）では、APOE遺伝子型は、様々なCVリスク因子、すなわち脂質プロファイルをコントロールした後ではCHDリスクと関連していなかった … APOE4はまた、脳血管虚血イベントのリスク上昇と関連しているかもしれない。

異なるAPOE多型によるT2DM発生率に関するデータはないが、矛盾しているものの、T2DM有病率の推定値はいくつかある。 30の独立した横断研究（n = 13,620）のデータを組み合わせたメタ分析では、APOE2キャリアはより一般的にT2DMの既往があった（OR 1.18, 95%CI 1.02-1.35, p=0.023） …。 さらに、最近のゲノムワイド関連研究により、APOEは新規のT2DM感受性遺伝子座であることが同定されている。 我々の研究では、年齢、性別、中性脂肪、スタチン使用を調整した後、追跡調査中のT2DM発症リスクは、APOE2キャリア（42.2％）で野生型APOE3キャリア（27.1％）よりも有意に高かった（OR 1.8, 95%CI 1.1-3.1, p=0.03）。 ポルトガルの65歳から75歳の人口におけるT2DMの有病率は23.8％であり、このコホートにおけるT2DMの世界的な発生率が高いことも注目されるところである。 おそらく我々は，FINnish Diabetes Risk SCore（FINDRISC）によるとT2DMの10年リスクが高いか非常に高い集団に直面しているのだろう。 過去には、APOE4は、おそらく膵島内のアミロイド沈着が原因で、空腹時血糖の進行性上昇とT2DMと関連していた 。 APOE2とT2DMの関連もまた推測に過ぎない。 APOE2ホモ接合体の大多数は、血漿コレステロール値が正常か、あるいは低いにもかかわらず、ほとんどすべてのAPOE2キャリアは、トリグリセリドに富むリポ蛋白の肝クリアランスが損なわれるためにトリグリセリド値が上昇する … ヒトAPOE2およびAPOE3遺伝子置換マウスを用いた研究では、APOE2マウスは空腹時血漿中のトリグリセリドとインスリンレベルが上昇し、食後高脂血症が遷延することが示された . 重要なことは、APOE2を含むトリグリセリドに富むリポ蛋白の循環からのクリアランスが損なわれると、白血球による食後脂質の取り込みが増加し、炎症と脂肪組織における慢性的な脂質沈着が促進されることである。 脂肪率の上昇と炎症の組み合わせは、APOE2キャリアにおける食事誘発性肥満の感受性を高め、高インスリン血症、ひいてはT2DMの発症を加速させる . 興味深いことに、ヘテロ接合型HeFHの患者は、T2DMになりにくいことが報告されている . さらに、LDL受容体（LDLR）陰性変異を有するHeFH患者では、LDLRやアポリポ蛋白Bの欠損変異の保有者よりもT2DM有病率が低いという逆用量依存的な関連性が見いだされた . HeFHとスタチン治療に共通する経路である細胞内コレステロールの取り込みは、おそらく細胞内コレステロールレベルの上昇が膵β細胞の機能に悪影響を及ぼすため、T2DMの発症に関与している可能性がある … しかし、もしLDLRを介した細胞内コレステロールの取り込みだけが関係しているとすれば、LDLRの取り込みに影響を与える遺伝的欠損を持つHeFH患者における糖尿病からの仮想的な保護が説明されるだけだろう 。 別の仮説では、この保護はHeFHで観察される高い血漿LDLコレステロール濃度に依存しており、APOE2キャリアにおいてLDLコレステロール濃度が正常、あるいは低くても有害な影響を与える可能性があることを明らかにしている。 APOE2キャリアにおける新規発症T2DMの高いリスクの認識は、定期的な経口ブドウ糖負荷試験による耐糖能異常の早期診断、ひいては早期食事・治療介入につながる戦略であろう。 これらの患者における脂質異常症の治療もまた再考されるべきであろう。 APOE多型は血漿脂質レベルに影響を与えるだけでなく、スタチン治療に対する反応性にも影響を与える。 さらに、スタチン治療は、わずかではあるが、T2DM発症の有意なリスク上昇と関連している。 ピタバスタチンは短期および長期の治療で糖代謝に影響を与えないようであり、おそらくT2DM発症リスクの高い患者では他の薬剤より優先されるべきであろう。 血漿中のトリグリセリド値の上昇と炎症におけるその有害な影響のバランスをとるために、高トリグリセリド血症のT2DM患者に対する利用可能な推奨に従って、トリグリセリド値の低い目標値を考慮することもできるだろう。 まず，サンプル数が限られていることと研究デザイン（観察研究）のために統計的検出力が不足しているため，弱い関連性が検出されなかった可能性を否定できない。 しかし、我々は長い追跡調査を行っており、イベント数も多い。 第二に、選択バイアスの可能性もこの研究に内在する限界である。 我々の集団は、脂質専門クリニックでのフォローアップのためにプライマリーケア医によって選ばれたものであり、集団全体の断面を表しているわけではない。 さらに、ほとんどの患者が組み入れ時に脂質低下治療を受けており、スタチンによって異なるリスク層が薄くなる可能性があるため、APOEとCVリスクとの関連性がないことの一因となっているかもしれない。 スタチンはまた、T2DM発症リスクのわずかではあるが有意な上昇と関連している。しかし、回帰モデルはこの変数で調整されていた。 最後に，追跡期間中のスタチンの新規処方やスタチン治療期間についても分析で調整することができなかった

5. 結論＜3112＞＜4811＞要約すると，南ヨーロッパの大規模で前向きな長期追跡調査患者コホートにおいて，APOE遺伝子型とCVアウトカムとの間に相互作用は認められなかった。 しかし，APOE2遺伝子保有者では，年齢，性別，中性脂肪，スタチン使用量で調整したT2DM発症率が2倍であることが分かった。 このことは、定期的な経口糖負荷試験による早期診断、糖尿病誘発性の低いスタチンを用いたより良いスタチン選択、そして最終的にはこの選択されたグループにおける脂質レベルの低下を目指す戦略を促すものであろう。

Conflicts of Interest

著者は利益相反と解釈される関係を報告していない。

Authors’ Contributions

Cátiaサントル-フェレイラは研究を考案、研究の設計に参加、データを取得、統計解析を実施した。 Rui Baptistaは、研究の構想、研究の設計に参加し、データを取得し、重要な知的内容のために原稿を改訂した。 Manuel Oliveira-Santosは、研究のデザインに参加し、データを取得した。 Regina Costaは、研究デザインとデータ取得に参加した。 José Pereira Mouraは、研究の構想、研究計画への参加、重要な知的コンテンツのための原稿の改訂を行った。 Lino Gonçalvesは、本研究を構想し、研究計画に参加し、重要な知的コンテンツのために原稿を改訂した。 794>

謝辞

本研究は、POCI-01-0145-FEDER-032414の助成を受けて実施された。