インド産Alternariaのマイコトキシン（TeA, AOH）の分離と毒性

アルテルナリア種の収集と分離

インドの様々な地域から罹病植物の葉、果実、茎などの感染部分を収集し、実験室に持ち込まれました。 葉は0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌し，滅菌蒸留水（SDW）で数回十分に洗浄した後，ペトリ皿のポテトデキストロース寒天培地（PDA）上に3〜4日置いた． 感染した葉片を含むPDAプレートを28℃、12時間の明暗光周期で6-10日間培養した57。 細菌汚染を避けるため、培地中にストレプトマイシンを補充した。 1498>

病原性試験

形質スペシャルを決定するために、分離株の病原性分析をAlternariaに感受性のトマト品種上で実施した。 合計60株のAlternariaの病原性を試験した。 トマトの種子を次亜塩素酸ナトリウムで傷つけ，水道水で洗浄し，風乾した。 植物はポットで別々に栽培した。 植物の生育に必要な温度と湿度は、それぞれ28℃から32℃、相対湿度40%から60%に維持された。 植菌は最適な濃度（2×106 spores/ml）を保ち、葉面散布を行った。 実験植物は25℃、8時間露温室で維持した。 これらの植物を2-3日間定期的に観察し、無接種対照葉に対する感染の程度と病勢の推移を観察した。 症状は、胞子散布の1日後に見え始めた。 発病度は、接種1日目から6日目まで評価した。 データは分散分析（ANOVA）およびダンカン検定（P≦0.05）を用いて統計的に分析した。

DNA extraction and identification of pathogen

病原体は、サイズや形状などの形態学的特徴に基づいて最初に同定された。 と分生子の構造を確認し、さらにITS領域と5.S領域を増幅するユニバーサルプライマーITS1 (5′-TCCGTAGTGAACCTGCGG-3′) と ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATGC-3′) によるITS増幅で確認した。8S遺伝子を増幅した。 DNA抽出は、Doyle and Doyle58が提案する方法に従って行った。 0.5gの凍結乾燥ミセルマットを10mlのCTAB抽出バッファーを用いて乳鉢と乳棒ですり潰し、水浴中で65℃、30分間インキュベートした。 次に、このサンプルに等量の冷やしたクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、穏やかに混合した後、10,000 rpm、4℃で10分間遠心分離を行った。 得られた上清を等量のイソプロパノールと混合し、4℃で2時間静置した。 再び10000rpm、4℃の温度で10分間遠心分離を行った。 ペレットは70%エタノールで洗浄した後、4時間風乾させ、アルコールの痕跡を除去した。 増幅 ITS rDNA反応は、2.5μlの10X反応バッファー、5μlの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、および1.0μlのITSおよび5.8S領域共通のフォーワードプライマー（ITS1）とリバースプライマー（ITS4）、0.3μlのTaq DNAポリメラーゼ、10〜100 ng DNAおよび2.5 μl MgCl2、を含む25μl反応混合物で実施された。 PCRの最適化されたサーマルプロファイルは、95℃3分の初期変性、95℃30秒の変性、70℃30秒のアニーリング、72℃1分の最終伸長、さらに40サイクルの追加であった。 増幅は0.5X TBEバッファーの1%アガロースゲルで確認し、標準DNA分子量マーカーと並行して行い、紫外線透過器で可視化した。

ITS 配列解析

得られた分離株のITS rDNA領域を、QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Germany) でメーカー指定の方法で切断・精製を行った。 精製産物は最終的にインド・ケララ州のSciGenome Cochinに送られ、塩基配列が決定された。 配列はNCBI BLASTを用いてGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) の配列と比較した。 BLAST解析は、全長のITS配列をクエリーとして行い、公開配列との関係を明らかにした。 最も高い相同性と総スコアを記録し、さらなる解析を行った。 本研究で得られた配列は、GenBankに提出した。 NCBI GenBankデータベースから他のAlternaria株のITS配列をダウンロードし、参照配列として系統解析に使用した。 すべてのDNA配列は、BioEdit sequence alignment editor59, 60に含まれるプログラムClustal Wでアライメントした。 1498>

Alternaria種からの毒素の抽出

毒性代謝物の抽出は、Andersenらの方法に従って、いくつかの変更を加えて実施した62。 これらの植物毒素の抽出は、20 日齢の培養液を用い、Potato Dextrose Broth (PDB) 培地で実施した。 各Alternariaコロニーの中心から3つの寒天プラグ（3 mm）を切り出し、200 ml PDB培地に植菌した。 病原体のコロニーをコルク・ボーラー（5 mm）を用いて切断し、コロニーをPDB培地に植え付けた。 20日経過した培養物を、真空濾過機で濾紙に通して濾過した。 その後、濾液を沈殿させ、回転式真空濃縮器 (IKA® RV 10) を用いて43℃でメタノールを蒸発乾固させた。 抽出した濾液に等量の酢酸エチルを加え、分液ロートでよく混合した。 有機相と水相の2相が得られた。 水相を分離し、酢酸エチルで抽出した。 酢酸エチル抽出物を真空エバポレーターで44℃で濃縮し、メタノールに溶解した。

カラムクロマトグラフィーによるAlternaria phytotoxinの精製と分離

化合物の精製と分離はDeviら63の方法を用いて、少し修正を加えて実施した。 カラムクロマトグラフィー (CC) は、ガラスカラム (700 mm × 30 mm) で行い、固定相にはシリカゲル (100-120 mesh size Merk) を選択しました。 移動相は、純溶媒または条件に応じて異なる溶媒から構成された。 カラムには、Alternaria種から抽出した粗製複合体を充填した。 有害代謝物の分離には、クロロホルム：メタノール（80：20および95：05）、ベンゼン：アセトン：酢酸（60：35：05）の比率の移動相を使用し、グラジエント溶出を行いました。

植物毒の薄層クロマトグラフィー（TLC）分析

薄層クロマトグラフィー（TLC）は、同定されたAlternaria種の大胞子および小胞子が生成する様々な植物毒を特定するために使用されました。 TLCはAndersenら64の方法を用いて行った。 この方法では、4.5 g のシリカゲル G254 (バインダーとして 13% CaSO4 ½ H2O) に 25 ml の二重蒸留水を加え、シリカゲルのスラリーが形成されるまでガラス棒で攪拌した。 その後、このスラリーをガラス板上に静かに塗布し、安全な場所に置いて風乾させた。 移動相は、クロロホルム：メタノール（80：20；v/v）、ベンゼン：アセトン：酢酸（60：35：5；v/v）、クロロホルム：メタノール（95：5；v/v）、酢酸エチル：ベンゼン（95：5；v/v）の割合で使用し、各種植物毒素の分離に使用した。 次に、これらの混合溶媒をデシケータに入れ、30分間放置してその内部の環境を飽和させた。 TLCを行う前に、シリカゲルでコーティングされたガラス板を60℃のオーブンに10分間入れて充電した。 チャージ後、5 µlの試料を底面から2 cm離れた異なる位置にスポットした。 スポット後、TLCプレートをデシケーター内で数分間乾燥させた。 0.2%エタノール塩化第二鉄の照射によりスポットを現像し、365 nmのUV光で可視化した。 TLCプレートは一晩風乾させた後、Rf値を算出した。 1498>

HPLC-UV Analysis

Preparation of the standard

TeA (cat No: T1952), AOH (cat No: A4675) and AME (cat No: A4678) was purchased from Biogenuix (LKT laboratories, Inc.), New Delhi, India)から購入し、結晶化した状態で使用して標準品を調製した。 毒素のストック溶液（1000 µg ml-1）および別のワーキング溶液（10 µg ml-1）をHPLCグレードメタノールで調製し、さらなる使用のために-20 ℃で保存した。 これらの毒素は、調製した作業溶液を希釈することにより、HPLCキャリブレーションおよびその他の追加実験の標準として使用した。

HPLC-UV分析条件

HPLC分析では、サンプルは、ベース不活性化（250 mm long × 4.6 mm, 5.0 µm particle size) C18 Waters Spherisorb, ODS2 column (product No: PSS831915, USA) をガードカラムに接続し、UV-VIS detector (2998 PDA) とWaters 600E system controllerを備えたWaters series system (Waters, Waters Corporation, Milford, USA)で分析しました。 2998 PDA検出器は、積分波長として254 nmに設定した。 Waters 717plus オートサンプラー (Waters Corporation, Milford, USA) の10μlループを使用してサンプルを注入した。 カラムとガードカラムは28 ℃にサーモスタット制御されていた。 流速は0.70 ml/min、移動相はHPLCグレードのメタノール（溶媒A）75%、0.1 Mリン酸バッファーを1リットルに対して900 ml DW添加し、リン酸でpH 5.8に維持した水溶液（溶媒B）25%から構成されました。 装置はリニアアイソクラティックモードで運転し、検出は200-400 nmの範囲でモニターされました。 AME、TeA、AOH の分析における HPLC メソッドの信頼性は、検出限界 (LOD) と定量限界 (LOQ) によって検証されました。

LC-MS/MS 分析

Alternaria 毒素 (AME, AOH および TeA) をさらに確認するには、Tölgyesi ら 65 の手法を少し変更してクロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (LC-MS/MS) が実施されました。 この方法では、メタノールによる固液抽出と、それに続くTeA、AOH、AMEの誘導体化が行われます。 次に，ポリマーベースのカートリッジで固相抽出を行って試料を精製し，最後にLC-MS/MSで毒素を分離した。

試薬、溶媒、標準物質の調製

AME、AOH、TeAの乾燥した分析用校正物質はBiogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) から購入しました。 標準品は1.0 mlメタノールで希釈し、0.1 mg ml-1のストック溶液を得た。 原液はすべて4 ℃で保存した。 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) および undecanal は Sigma-Aldrich から購入した。 誘導体化試薬（0.58% DNPH in HCl solution）はSiegelらの記載に従って調製した7。停止試薬はメタノール中の5% (v/v) undecanalであった。 10 μg/ml メタノール溶液の1 mlと1 ml DNPH溶液を混合し、誘導体化TeA、AOHおよびAME標準溶液（それぞれ1.91 μg/ml, 2.54 μg/ml, 2.71 μg/mlメタノール）を調製した。 この混合物を一晩放置し、試料抽出およびSPEクリーンアップの項に記載したとおりに処理した。 最終容量はメタノールで10 mlに調整した。 これらの溶液は、分析のためのLC-MS/MS条件を最適化するために使用された。 合計50mMのギ酸アンモニウム緩衝液を水で調製し、ギ酸でそのpHを3.0に調整した。 メタノールとアセトニトリルはSigma-Aldrichから入手したLC-MSグレードを使用した。 酢酸エチル、n-ヘキサン、ジクロロメタン、ギ酸、ギ酸アンモニウムはHPLCグレードで、Merck（Darmstadt, Germany）より購入した。 Kinetex C-18 UPLC LG 500 カラム (3 × 100 mm, 2.6 μm), Strata SPE カートリッジ (6 ml, 200 mg) および再生セルロース (RC) シリンジフィルター (15 mm, 0.45 μm) は Phenomenex (Utrecht, the Netherland) から取得した。 Supelco Ascentis Express C-18, cyano (ES-CN) and phenyl-hexyl HPLC columns (2.1 × 100 mm, 2.7 μm) は Sigma- Aldrich から購入した。 メソッド開発に使用した標準毒物サンプルは、Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, India) から購入した。 1498>

試料抽出

粗代謝物抽出試料をカラムクロマトグラフィー法で精製し、メタノールに溶出・溶解したフラクションを使用しました。 各フラクションのサンプル50mlを50mlポリプロピレン（PP）製遠心管に混合し、密封しました。 このサンプルを5秒間ボルテックスミキシングし、CAT S50シェーカーで600min-1の速度で45分間、室温で水平方向に振とうした。 その後，5,000rpm，20℃で10分間遠心分離し，上層を新しい50 ml PP遠心管に回収した。 100 μlの誘導体化試薬（2 mol/lit HCl中 0.596% DNPH）をサンプルに加え、5秒間ボルテックスミキシングした。 試料を常温で1時間放置し、誘導体化した。 その後、500μlの停止試薬5％（v/v）ウンデカナール（メタノール中）を加え、5秒間ボルテックスミキシングを行った。 30分間放置後、50mMギ酸アンモニウム緩衝液（pH4、ギ酸で調整）で35mlまでPPチューブで希釈した。 このサンプルを5,000rpm、20℃で10分間遠心分離し、固相抽出クリーンアップを行います。

固相抽出（SPE）クリーンアップ

Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) カートリッジを6 mlメタノール、続いて6 ml水、6 ml 50 mMギ酸バッファで調整した後、このカートリッジは、20℃で2分間、遠心分離し、固相抽出クリーンアップに供される。 75mlのリザーバーがカートリッジに接続され、試料がリザーバーにロードされた。 その後、サンプルは滴下された。 その後、6 mlのメタノール-水(15/85, v/v)で洗浄し、さらに6 mlのn-ヘキサンでSPEカラムを洗浄した。 カートリッジを5分間真空乾燥した後、5 mlのメタノールでガラス管に試料を溶出した。 試料を緩やかな窒素気流下、45℃で蒸発乾固し、250μlのメタノールに20秒間ボルテックスミキシングして再溶解した。 最終段階として、サンプルを再生セルロースフィルターでろ過し、HPLCバイアルに入れました。

装置および機器

メソッド開発は、Ascentis Express C-18 (2.1 × 100 mm, 2.1 mm) を用いて行いました。7 μm) UPLC LG 500 nm システム (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA detector, Waters Corporation, Milford, MA, USA) に MassLynx triple quadrupole MS detector (Waters, Milford, MA, USA) を結合させたものを使用しました。 データ取得と評価は、MassLynx version 4.0 で行いました。 最終メソッドは、Waters acquity QSM バイナリポンプ (SN- L10QSM943A), Waters acquity fin オートサンプラー (SN-M10SDI443M), カラムサーモスタットおよびTQD Quantum Ultra トリプル四重極MS検出器を含むThermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS system (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) にも移管されました。 ターゲットカラム温度は30 °C、ターゲットサンプル温度は10 °Cとしました。 データ取得と評価はXcaliburソフトウェア2.0.7を用いて行った。 SP1です。 両システムとも、取り込み時にマイナスイオン化のみを行うエレクトロスプレーインターフェース（ESI）を装備していた。 乾燥ガスおよびコリジョンガスには窒素を使用した。 イオン源パラメータを補足表S2にまとめた。 さらに、Agilent 1100 HPLC と AB Sciex 4000 トリプル四重極 MS (Framingham, MA, USA) を組み合わせた LC-MS/MS システムで、メソッドの移植性を調査しました。

装置条件

Alternaria 毒素は、2.1 mm C-18 プレカラムを備えた Ascentis Express C-18 (2.1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC カラムで直線グラジェントを使用して溶出されます。 4種類の溶媒（溶媒A、B、C、D）をバイナリーポンプで混合した。 溶媒Aはアセトニトリル（ACN）＋水（5：95）、溶媒BはACN：5％イソプロピルアルコール（IPA）、溶媒Cは100％メタノール、溶媒Dは純アセト酸アンモニウムであった。 流速は0.5ml/minであった。 グラジエントプログラムでは，蓄積された親油性マトリックス溶質を除去するために十分な洗浄工程が必要であった。 合計分析時間は5分であった。 カラムサーモスタットにより温度は30℃に保たれ、注入量は1.0μlであった。 オートサンプラーは20℃で作動させました。

UPLCのLG 500 nmシステムは、ネガティブモードで作動するエレクトロスプレーインターフェース（ESI）を介してMS/MS検出器（Micromass Quattro Ultima PT）に結合されました。 最適化されたESI設定は、ソース温度120 °C、脱溶媒温度350 °C、乾燥ガス流量650 L/Hr、コーンガス流量30 L/Hr、キャピラリー電圧3.50 kVであった。 乾燥ガスおよびコリジョンガスには窒素を使用した（2.67 × 10-6 bar）。 検出時にはMSにMRM（Multiply Monitoring Reaction）モードを適用し、各ターゲットトキシンについて2つのイオン遷移をスキャンした。 MS/MS検出器ではMRMモードを適用し、各ターゲット化合物について2つのイオントランジション（quantifierとqualifier）を記録した。

異なるAlternariaマイコトキシンの毒性評価 (TeA, AOH and AME)

異なるマイコトキシンが誘発する細胞死の程度は、剥離葉接種法によって測定されました。 ハウス栽培植物から新鮮な葉を切り離し、水道水の流水で3～4分間適切に洗浄した後、1.0% (0.01 g/ml) 次亜塩素酸ナトリウムで約1分間殺菌し、70%エタノールで表面拭取りを行い、最後に滅菌蒸留水で十分に無菌的にすすぎを行った。 最後に、湿らせたろ紙の上に葉を置き、下面を滅菌針で穿刺した。 毒素は100μg/mlの濃度で滅菌脱イオン水に溶解させた。 3種の毒素のそれぞれを100μlの液滴とし，細い針（ディスポバン，1ml）で傷ついた葉に注入した。 対照試料は、滅菌蒸留水を注入して調整した。 処理葉試料は、温室条件（27℃で14時間明暗サイクル）のモイストチャンバー（温度27±0.5℃、相対湿度60％）内に維持した。 対照試料と比較し，毒性発現に関連する変化を見出すため，定期的な観察（24時間ごと，6日間）を行った。 実験セットは3つの複製で維持され、毒性誘導細胞死による影響を受けた葉面積の割合は、（Systronic leaf area meter 211）によって測定され、以下に示す式で計算された。