スタチンの血管新生への影響｜Revista Española de Cardiología

INTRODUCTION

スタチンは、コレステロール生合成の限界段階であるメバロン酸合成を触媒する酵素、3-ヒドロキシ3-メチルグルタリルコエンザイムA (HMG-CoA) 還元酵素の活動を阻害します1。 その結果、細胞内コレステロールが減少し、低比重リポタンパク質（LDL）受容体によるコレステロールの取り込みが代償的に増加し、血漿コレステロールが減少するのである。 スタチンの発見とコレステロール濃度の高い被験者への適用により、冠動脈疾患の一次予防および二次予防の大幅な改善が可能となりました。2,3 最近では、コレステロール濃度の低い被験者においても、冠動脈疾患の一次予防および二次予防におけるスタチンの有効性が確認されています。4-6 スタチンは、LDLコレステロール（C-LDL）を減少させる以外に、内皮機能、細胞移動、炎症、プラークの血栓傾向など、動脈硬化のいくつかの構成要素に対して一連の多面的な作用を有しています7-12。 正常コレステロール血症動物では、スタチンが心筋の虚血再灌流病変に対して保護効果を持つことが実証されており、おそらく内皮による一酸化窒素生成（NO）に関連した機序によるものと考えられる13

セリン/スレオニンプロテインキナーゼAktまたはプロテインキナーゼB（PKB）は細胞の生存、成長および代謝14の多機能細胞内制御因子（レギュレーター）である（図1）。 心血管系の機能に関連して、Akt/PKB は血管内皮増殖因子（VEGF）14,15 やアンジオポエチン16-18 によって刺激される細胞内経路に作用し、細胞の生存を促進し血管を十分に発達させる19。Aktシグナルの常時活性化は虚血再灌流病変におけるアポトーシスから心筋細胞を守る20。 細胞保護作用に加えて、Aktは、内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）のセリン1179または1177をリン酸化する能力を通じて、VEGFやシアストレスに応答して内皮によるNO産生の活性化因子として働き、血管運動調節を行います21,2223。 一方、Aktは内皮細胞がVEGF産生焦点に移動するのに必須である24。したがって、細胞の生存、NO産生、VEGFによる移動を仲介するAktの能力は、プロテインキナーゼAktが血管形成刺激に対する内皮の反応を仲介することを示唆している

Fig.1. スタチン、Aktシグナルと血管新生/血管新生。 アンジオポエチン1（Ang-1）、VEGF、線維芽細胞増殖因子（FGF）は、その膜受容体に結合すると、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）によりホスファチジルイノシトール4，5-リン酸（PIP2）からホスファチジルイノシトール3，4，5-三リン酸（PIP3）への変換を誘起する。 PIP3の形成は、PDK-1キナーゼによるAktプロテインキナーゼのリン酸化に必要である。 スタチン投与はAktのリン酸化を増加させ、ワートマニン（PI3K阻害剤）はリン酸化を抑制する。 HMG-CoA還元酵素の産物であるメバロン酸もPI3Kを阻害し、その後のAktのリン酸化を抑制する。 したがって、スタチン系薬剤は、HMG-CoA還元酵素とメバロン酸の生成を阻害することにより、Aktのリン酸化を増加させ、同時に内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）のリン酸化と活性化、一酸化窒素合成（NO）、血管新生や血管新生に誘導する種々の生理作用が期待されます。 また、Aktは内皮細胞のアポトーシスを抑制します。

最近、スタチンは内皮細胞25や骨髄の内皮前駆細胞（EPC）のプロテインキナーゼAkt/PKB25-27の細胞内シグナル伝達経路も刺激し、血管新生25と血管新生の両方を誘導することがVasaらによってヒトで証明されています26,27。 本稿では、Aktの活性化に関連した機序によるスタチンの血管新生25および血管新生26の誘導効果について概説する。 血管新生とは、内皮前駆細胞（血管芽細胞）が移動して他の内皮前駆細胞と融合し、内皮細胞に分化しながら新しい血管を形成する過程である。 一方、血管新生とは、分化した内皮細胞が移動・増殖して新しい毛細血管を芽生えさせ、形成された血管を拡張する過程である（図2）

図2. 血管新生と血管形成の模式図。 (A）血管新生とは、血管芽細胞や内皮前駆細胞が凝集して血管を形成することである。 血管芽細胞はその場で合体するか、移動して遠くの部位で血管を形成する。 (B）血管新生とは、分化した内皮細胞の増殖と移動により、既存の血管から新しい血管が形成されることである。 (C）血管新生と血管新生は同時に起こることもある。 (Cleaver et al.29より引用)

当初、血管新生の過程は胚の発生に限られ、一方、血管新生（これも胚で起こる）は成人の新生血管形成に関わる唯一の過程であると考えられていた。 しかし、最近、生後の新生血管形成のパラダイムが見直され、末梢血中を循環している内皮前駆細胞33が成体動物の新生血管形成巣に取り込まれること34、組織の虚血に反応してその数を増やすこと35、試験管内での増殖やその後の移植により側副血管の発達を促すこと36が明らかにされた。 これらの研究により、血管新生と血管新生の両方が成人における新生血管形成に関与していることが立証された。

側副血管の発達におそらく寄与する第三のメカニズムは、既存の細動脈側副血管のサイズと口径が増大することで、これは動脈新生と呼ばれるプロセスである37。 血管が閉塞すると、既存の側副血行路を通る血流速度の増加、内腔シアストレスの増大が起こり、側副血行路、特に中間のサイズの側副血行路の成熟に寄与する因子となる。 培養中の内皮細胞は、血管新生を刺激または阻害する因子に応答する能力、およびin vitroで内皮チューブを形成する能力を保持している。 細胞増殖のアッセイにより、ある物質が内皮細胞増殖に及ぼす影響を分析することができる。 ボイデンチャンバーを用いて、内皮細胞が透過性膜で仕切られたある物質を含む溶液に向かって移動する様子を調べることができる。 管状内皮の形成機構や、ある物質が管に与える影響を、二次元あるいは三次元のアッセイを用いて研究することができる。 最後に、内皮細胞の培養により、血管新生過程に関与する分子経路を研究することができる。

最近では、細胞選択技術や特殊な培養液を用いて、分化した内皮細胞の研究に発展した技術を、内皮前駆細胞の研究に応用している33-36。

Methods of study in vivo

試験管内での技術によって血管新生と血管形成の予備的な分析が可能であるが、生体内ではこれらの過程に影響を与えたり調節したりする多くの因子が存在する38。 マウス角膜モデル、ニワトリ胚脈絡膜、海綿状移植物などである。38 これらのシステムは、動物の犠牲を必要とするので、特定の瞬間の効果しか捉えられない。 これらのシステムでは、動物を犠牲にする必要があるため、特定の瞬間の効果しか捉えられません。単一組織における事象の時間的変化を研究するために、マウスの背中の皮膚や頭蓋骨のための生体内顕微鏡技術が開発されています39。 最後に、遺伝子工学技術の発展により、ある遺伝子の抑制（ノックアウト）や付加（ノックイン）が血管新生や血管形成の過程に及ぼす影響を研究することが可能になった。

Fig.3. 血管新生の研究のための骨髄移植のマウスモデル。 使用する骨髄ドナーは、特定の内皮プロモーターであるTie-2によって制御された遺伝子LacZ（β-ガラクトシダーゼをコードする）を構成的に発現しているトランスジェニックマウスである。 骨髄は抽出され、骨髄が皮下照射されたマウスの受容体に移植される。 移植された骨髄の再構成を達成するための4週間の期間の後、新生血管形成を刺激するために、1つまたは複数の介入がマウス受容体（示されたケースは角膜モデルである）においてなされる。 これらの介入の後、動物を犠牲にし、β-ガラクトシダーゼの発現を検出するための組織学的研究が行われる。 X-GAL染色により、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞は青みを帯びた色調を獲得する。 内皮細胞に特異的なプロモーターを用いることで、新生血管形成巣に取り込まれた青い細胞を内皮系の細胞として同定することができる。

EFFECT OF STATINS ON THE INDUCTION OF ANGIOGENESIS AND VASCULOGENESIS

我々の研究室や他の場所で行われた調査では、スタチンがタンパク質キナーゼAkt/PKBの細胞内シグナル経路25-27を刺激し、血管新生25と血管新生の両方を促すことが実証された26。 さらに、Vasaらは、EPCの動態に対するスタチンの効果をヒトで実証することができた28

Effects in vitro of statins

The statins rapidly activate protein kinase Akt/PKB in endothelial cells25 and EPC,26,27 thus increase phosphorylation of eNOS and subsequent production of NO.27 the statins are rapidly activated protein kinase Akt/PKB in Endothelial cells25 and EPC,26,27. スタチンによるAktの活性化は、内皮細胞やEPCの増殖、遊走、細胞生存を促進し、血管構造の形成も促進する。 また、ドミナントネガティブ型Aktをコードするアデノウイルスを用いてAktを阻害すると、スタチンによる作用が抑制される。 組織再生過程におけるスタチンの可能性は、先に骨芽細胞で実証された。 スタチンによるAktの活性化のメカニズムは正確にはわかっていないが、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）の阻害剤であるワートマニンやLY294002によってこのプロセスが阻害されることから、PI3Kシグナルが関与している可能性が高い（図1）。 さらに、シンバスタチンによるAktの活性化は、メバロネートの添加によるインキュベーションで阻害されたことから、HMG-CoA還元酵素の阻害が必要である（図1）。 メバロン酸は、コレステロールの生合成だけでなく、いくつかの細胞プロセスで必須であるユビキノン、ドリコル、イソプレノイドの生成にも必要である。 スタチン系薬剤はイソプレノイド合成を修飾することでeNOSのメッセンジャーRNA（mRNA）を安定化するが41、タンパク質合成酵素eNOSの値の変化は観察されていない。 この意味で、mRNA濃度の上昇は、AktによるeNOSのリン酸化活性化（15分）よりも遅い（24時間）ことが重要である。 この活性化時間の短さは、ex vivoの大動脈環状部で観察されたNOの産生および血管拡張におけるスタチンの誘導する変化と一致する42。

スタチンの生体内効果

スタチンと細胞内Aktシグナルの活性化は、正常コレステロール血症のウサギで開発した末梢虚血モデルにおいて血管新生を促進した25。スタチン投与動物において、高い灌流圧、より多くの副血管、より大きな毛管密度が認められた（図4）。 一方、スタチンは、マウス26,27およびヒトの末梢血中の内皮前駆細胞数を増加させる28。また、スタチンは、骨髄から得られたEPCからの血管新生もあって、正常コレステロール血症マウスにおいて角膜新生血管を増やす（図3、5）26。マウス骨髄移植モデルを用いて、スタチン投与マウスの角膜に骨髄からのEPCがより多く含まれていることが確認された。 したがって、スタチンは、VEGFや顆粒球および単球コロニー刺激因子（GM-CSF）で以前に示されたように、EPCの動態に重要な影響を与え、35 これらの細胞のスタチンによる動員は、出生後の新生血管を増加させる可能性があります。 Statin-induced increase in neovascularization in the leg of a rabbit in response to the unilateral resection of the femoral artery. a) 大腿動脈とその枝を剥離した。 大腿動脈遠位部にβ-ガラクトシダーゼ（Ad-βgal）またはAkt（Ad-myrAkt）をコードするアデノウイルスを注入し、大腿静脈を一時的にクランプしながら15分間インキュベートして内皮への遺伝子導入が行われる。 b) 3日目に腓腹筋を摘出し、X-GAL染色を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色した組織学的標本で遺伝子導入分布を決定する。 c) 内腸骨を通して血管造影を行い、異なる処置群における側副血管の形成を分析する。 40日目に行われた血管造影では、生理食塩水を注射しただけの動物に比べ、0.1mg/kgのシンバスタチンを腹腔内注射した動物で側副血管の形成が増加していることが確認される。 側副血管の定量的解析は、対照群、シンバスタチン投与群、およびAd-VEGFの筋肉内注射を受けた動物群で行われた。 手術後31日目に生理食塩水、Ad-βgalおよびAd-myrAktの注入を受けた実験群で血管造影スコアを分析した。 d) 虚血下腿の内転筋におけるアルカリホスファターゼの染色は、手術後40日目に群対してシンバスタチンで処置した動物の群でより大きな毛細血管密度を明らかにした。 各実験のデータは平均±SDで示した（各処理群のn＝6ウサギ、＊P25）

図5. スタチンによる血管新生による角膜新生血管の増加。 a) 角膜新生血管を示す代表写真（左：ビヒクル、右：シンバスタチン）。 b) 全角膜のX-gal染色。 青みがかった点は、β-ガラクトシダーゼを発現する細胞である（左、ビヒクル；右、シンバスタチン）。 c) Tie2/LacZ/BMT マウスからのパラフィン包埋角膜における蛍光の組織化学研究の代表的顕微鏡写真である（左、ビヒクル；右、シンバスタチン）。 二重陽性細胞の存在は、骨髄から得られた内皮前駆細胞（EPC）が新生血管形成巣に取り込まれた（血管新生）ことの証拠である。 この場合の赤色はβ-ガラクトシダーゼ、緑色は内皮特異的マーカーであるイソレクチンB4を示している。 二重陽性細胞（黄色）は骨髄から得られたEPCで、新しい血管に取り込まれた。 d) Tie2/LacZ/BMTマウスの角膜全体における蛍光の組織化学的研究の代表的顕微鏡写真（左：ビヒクル、右：シンバスタチン）。 赤色はβ-ガラクトシダーゼ、緑色は特異的内皮マーカーであるレクチンBS-1を示す。 e) 新血管系に組み込まれた移植由来のEPCの定量化。 EPCの数と新生血管を形成する内皮細胞の総数との比率で表す。 *P26)

CONCLUSIONS

スタチンはセリン/スレオニンプロテインキナーゼAktまたはPKBの活性化に関連したメカニズムを通じて骨髄から得られた内皮細胞およびEPCの増殖、移動、細胞生存を促進します。 VEGFと同様に、スタチンは血管新生を促進する。 したがって、Aktの活性化は、生後の新生血管形成など、スタチンの有益な作用の一部に関与している可能性がある

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