バイカリンとその類縁体の酸素・ブドウ糖欠乏神経細胞に対する効果の比較検討 TLR2/TNF𝛼

Abstract

本研究はバイカリンとその類縁体3種について検討するものである． バイカリン、ウォゴノシド、ウォゴニンは、酸素・グルコース欠乏（OGD）からの神経細胞の保護効果およびOGD損傷におけるtoll様受容体2（TLR2）の発現に作用した。 その結果、バイカリンとその 3 種類のアナログは、神経細胞を OGD 障害から保護し、TLR2 のタンパク質レベルをダウンレギュレートすることが示された。 これらのフラボノイド類縁体の細胞毒性は、構造中のサイト7に存在するD-グルコピラノシデュロン酸が核となる。 また、8 番目のメトキシル基は TLR2 タンパク質の発現に関係し、抗炎症作用も示した。 さらに、カスパーゼ3および抗酸化力を検出し、OGDモデルにおける4種のアナログの細胞アポトーシスおよび抗酸化力に対する影響を検討した。 はじめに

漢方薬であるオウゴン根は、抗菌、抗ウィルス、抗炎症、抗酸化、抗射病など様々な薬理作用があり、臨床でも使用されている。 その有効成分は、バイカリン、バイカリン、ウォゴニン、ウォゴニサイドからなるフラボン類の一種である（図1）。 オウゴン根は虚血・再灌流による傷害から神経細胞を保護することが報告されている。 フラボンの主要成分であるバイカリンは、虚血・再潅流による障害に対する神経保護作用や中枢神経系への作用が確認された。 近年、バイカレインが複数の部位で神経作用が期待されることが研究された。 しかし、バイカリンと TLR2 の神経細胞への発現を比較した報告はない。 また、wogonin, wogonosideが神経細胞に作用することは、いくつかの研究により報告されている。 バイカリンとバイカリンは抗酸化物質として研究され、いくつかのモデルではバイカリンよりもさらに強力にいくつかの遊離赤血球を減少させた。 バイカレインとバイカリンは過酸化水素による細胞傷害を有意に抑制したが、ウォゴニンとウォゴノシドの作用はより弱かった。 704>

バイカリン、バイカレーの抗炎症作用が確認されるにつれ、脳虚血再灌流における自然免疫反応の研究が進み、バイカリン、バイカレーの抗炎症作用が脳虚血再灌流障害からの保護に大きなアッセイの一つとなった理由の一部が提示された． グリアにおける虚血再灌流障害の主要な標的として、Toll like receptor (TLR) やNODs (nucleotide-binding oligomerisation domain) など、いくつかの受容体が示されていた。 私たちの先行研究では、バイカリンはin vivoおよびin vitroで虚血再灌流障害を受けた神経細胞におけるNOD2およびTNFαの発現を減弱させることが示されました。 Wogonosideはtoll-like receptor 4 (TLR4)のシグナル伝達を介してリポポリサッカライドによる血管新生を抑制することが報告されている。 しかし、バイカリンおよびその類縁化合物によるTLR2への作用は不明であった。

以上の情報をもとに、バイカリンおよびその類縁化合物の酸素・ブドウ糖欠乏（OGD）時の自然免疫反応のターゲットと考えられるもの、バイカリンおよびその類縁化合物の化学構造と作用との関連を調べるために、一種類のニューロン細胞PC12を介して、バイカリンおよびその類縁化合物の制御挙動を調べた。 TLR2 は自然免疫の初期受容体の一つであり、バイカリンによって肺細胞の炎症活性化および TNFαが抑制されることから、この神経損傷モデルにおけるバイカリンとその類縁体の役割を調べるために TLR2 と TNFαのタンパク質発現をテストした。 一方、caspase3はアポトーシスの指標として知られており、いくつかの研究では、いくつかのフラボンが炎症細胞のアポトーシスを誘導することが報告されているので、我々はcaspase3タンパク質の発現を検出した。 さらに、この論文では、OGDモデルの細胞の総抗酸化能力に対する4つのアナログの効果も検出し、これらのフラボンの全体の能力をさらに比較した。 材料と方法

2.1. 化学物質と材料

バイカリン（純度98％）は清華大学薬学研究所のLujun Zhang博士から提供されたものである。 Wogonoside（純度98%）は北京大学薬学院のXiuwei Yang博士によって発表されました。 Baicaleinとwogoninは、いずれも純度98％（バッチ番号111595-200604と111514-200403）で、China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Productsから購入した。 実験中は脱イオン水を使用した。 その他の有機溶媒および試薬は、分析試薬グレードを使用した。 pH7.4 の PBS バッファーは当研究室で調製した。 PC12細胞は、中国医学科学院基礎医学研究所細胞バンク（中国・北京）から提供された。 ウシ胎児血清（FBS）およびRPMI 1640培地はGIBCO社から購入した。 抗TLR2/TNFα/カスパーゼ3/β-アクチン抗体は、Santa Cruz Company（米国）より購入した。 二次抗体は、Zhongshan Company (Beijing, China)から購入した。 Total antioxidation capability（T-AOC）検出キットはNanjing Jiancheng Bioengineering Institute（Nanjing、China）から購入した＜704＞＜7618＞2． 細胞培養

PC12細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）、5％ウマ血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（各100U／mL）を添加したRPMI1640で、6ウェルプレート（コスター社）の各ウェルに2mL接種して約1×106cells／mLに調整した。 細胞は加湿インキュベーター（5％CO2）（日本サンヨー）で37℃にて培養し、少なくとも48時間付着させた

2.3. 細胞毒性試験 in vitro

バイカリンおよびその3種のアナログの細胞に対する安全な投与量をin vitroのMTT（メチルチアゾール・テトラゾリウム）アッセイにより評価した。 96ウェルプレートで24時間培養した後，バイカリンとその類縁体を10 mg/mLから0.001 mg/mLの用量で添加した。 化合物を添加した24時間後に，96ウェルプレートの培養液をMTT（5 mg/mL, 200 μL per well）と共に37℃で4時間インキュベートした後，培養液を慎重に吸引し，200 μL dimethylsulfoxide (DMSO) per wellを添加して青色のホルマザン生成物を溶解させた． マイクロプレートリーダー（Model 550，Bio-Rad，USA）を用いて490 nmの吸光度の値を測定した。 試験ウェルの吸光度の結果は、cell aliveで表した。 50％細胞毒性濃度（CC50）を算出した.

2.4. 酸素-ブドウ糖欠乏症の細胞

酸素-ブドウ糖欠乏症（OGD）については、増殖培地をグルコースフリー培養液（各ウェル2mL）に置き換え、プレートを95％N2/5％CO2で満たし37℃のインキュベーター（中国長沙、YCP-30Q）に120分入れた。 その後、細胞を通常の供給培地に戻し、37℃、通常の条件下で培養した（Sanyo, Japan）、後の実験のために特定の時間、培養した。 酸素とグルコースを奪われない対照細胞培養物は、グルコースを含む培地中で通常の条件下でインキュベートした。

OGD損傷からの化合物の保護効果については、細胞生活アッセイは、以前に記載したように実施された。 96ウェルプレートで24時間培養した後、バイカリンとそのアナログを10 mg/mL から 0.001 mg/mL の用量で添加した。 24時間後，96ウェルプレートの培養液をMTT（5 mg/mL, 200 μL per well）と共に37℃で4時間インキュベートした． マイクロプレートリーダーを用いて、490 nmの吸光度の値を測定した。 試験ウェルの吸光度の結果は、細胞生存率として表した。 50％有効濃度（EC50）を算出した． 704>

TLR2/TNFαとカスパーゼ3の研究では、バイカリンとその類似体の最小安全濃度は10μg/mLと指示された。 これらの化合物（10μg/mL）は、培養液をグルコース溶液に交換し、細胞を通常の状態で培養した際に添加されました。 バイカリンおよびその類似化合物を添加後、特定の再灌流時間（0.5、1、3、6時間）に細胞をピックアップし、タンパク質実験を行った。 対照として、培地をビヒクルとして使用し、再灌流時間6時間で細胞を回収した。 試料の調製

コントロールとして、薬剤を添加しない2つのグループを採用した。 1群は酸素・グルコース遮断を行わず、全ての実験過程において通常の成長培地を用いた培地に播種した。 もう1群は酸素・グルコース欠乏させた培地に播種し、モデルコントロールとした。 各時点で、細胞サンプルは前述と同様に準備した。 各ウェルから培地を抜き取り、細胞を冷PBS（pH7.4）で3回洗浄し、100μLのRIPAを用いてウェスタンブロッティング用の総タンパク質を採取した

2.6. ウエスタンブロット

β-actin、TLR2、TNFα、およびCaspase3のタンパク質発現のウエスタンブロットアッセイは、以下のように最小限の修正で参照した：ゲル（10%）にサンプルをロードし、マーカー（リトアニアのフェルメンタースから購入）、ゲルの端に行くまで実行された。 転写は12ボルト、280 mAで60分間セミドライにする必要がある。 その後、メンブレンをPBST（1×PBS＋0.1％Tween20）中の10％ミルクで60分間室温でゆっくり振ってブロッキングした。 メンブレンを1 mL PBSTに入れ、1 : 1000に希釈した抗体を加え、シェーカー上で室温で60分間インキュベートし、一次抗体インキュベーション後にPBSTを使用して3回洗浄した。 その後、メンブレンをPBST中、濃度1：3000の二次抗体で60分間インキュベートした。 最後にメンブレンをPBSTで3回洗浄した

2.7. Total Antioxidation Capability Detection

この実験の原理は、試料中の還元成分によってFe3+がFe2+に還元された後の色の変化を検出することであった。 還元成分には酵素のほか、脂溶性抗酸化物質のビタミンEや水溶性抗酸化物質のビタミンC、ビリルビン、尿酸などの非酵素性分子が含まれる可能性がある。 その後、マイクロプレートリーダーを用いて520 nmで光学密度を測定した。 細胞サンプルは前述と同様に調製し、バイカリンおよびその類似物質添加後の特定の再灌流時間（6時間）に採取した。 各ウェルから培地を抜き取り、冷PBS (pH 7.4) で3回洗浄した。 これらのプレート内の細胞をPBS（1 mL/well）で凍結融解を繰り返しながら分解した。 遠心分離12 000 rpm/min後、上清を採取し、T-AOC試験を行った。

2.8. データ解析

すべての値は平均値±S.D.で表した。データはANOVAによって統計的に分析した。 ニューマン-キールズの比較は、必要に応じて、有意差の原因を決定するために使用された。 0.05以下のP値は統計的に有意であるとみなした。 CC50とEC50の計算には、CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology)のソフトウェアを使用した。 細胞増殖プロファイル

細胞は10%FBSを含む培地に48時間播種した。 細胞毒性のMTT試験

バイカリンとその類似体の細胞毒性を調べ、安全な投与量を決定するために、PC12細胞に対してin vitroでMTTアッセイを実施した。 実験の結果、バイカリンとウォゴノシドの10μg/mLが正常PC12細胞に対する安全濃度で最も高く、バイカリンとウォゴニンの1μg/mLが正常PC12細胞に対する安全濃度で最も高いことがわかった（図2）。

(a)

(b)

(a)
(b)

酸素・グルコース欠乏で処理したPC12細胞では、正常コントロールと比較して40％以下の細胞しか生存しなかった（𝑃<0.05 ）。 モデルコントロールと比較して，バイカリンとウォゴニンの最小有効濃度（MEC）は10 μg/mLであり，ウォゴノシドとバイカリンはともに1 μg/mLで同じであった． バイカリンとワルニンの最大有効濃度（MAXEC）は1 mg/mLで同じであり，両者の安全性は同じであることを示唆するものであった。 wogonosideのMAXECは1 mg/mLであったが，baicaleinのMAXECは10 μg/mLにとどまった。 バイカレインはwogonosideよりも細胞毒性が強いことが示唆された。 これらの化合物は、いずれも濃度依存性を明確に示さなかった（図3）。

(a)

(c)

(d)

のような結果であることがわかった。

(b)
(b)
(c)
(d)

バイカリンの保護作用． PC12細胞の酸素・グルコース欠乏（OGD）状態（MTTアッセイ）におけるwogonoside、baicaleinおよびwogonin。 96ウェルプレートで24時間培養し，2時間酸素・グルコース遮断した後，化合物を1 mg/mL から 0.001 mg/mL の範囲で添加した。 #正常コントロールに対して0.05%。 *モデルに対して0.05。 8118>

バイカリンのCC50 (188.4 μg/mL or 0.422 mmol/L) は他の3化合物と大きな差異を示した． バイカリンはCC50 8.9 μg/mL（0.0329mmol/Lに相当）でより細胞毒性を示した。 ヲゴニンおよびヲゴノシドは，それぞれCC50 10.6 μg/mL（0.0373 mmol/L）および13.7 μg/mL（0.0298 mmol/L）と同程度の毒性を呈した． しかし、バイカレインは、OGD障害から細胞を保護する効果がより高いことがわかった。 バイカレーの最小有効投与量は1 μg/mL（0.0037 mmol/L）であった。 バイカリンのEC50は1.2 μg/mL（0.0027 mmol/L）であり，WogoninおよびwogonosideのEC50は4であった．3 μg/mL（0.0151 mmol/Lに等しい）および7.4 μg/mL（0.0161 mmol/Lに等しい）である。 毒性と効果を比較した結果，4化合物の安全性指標はそれぞれ156（バイカリン），8.89（バイカリン），2.47（ウォゴニン），1.85（ウォゴノシド）であった（表1）．

3.3. TLR2、TNFα、Caspase3の発現に及ぼす影響

OGDで傷ついた細胞では、TLR2やTNFαのタンパク質がはっきりと発現しており、OGDが自然免疫反応を刺激して炎症を起こしていることを意味していた。 OGDモデルでは、カスパーゼ3タンパク質がある程度上昇したが、統計的に有意な値は見られなかった（図4）。 バイカリンは、投与3時間後にTLR2およびTNFαのタンパク質発現を減弱させた。 バイカリンが0.5時間作用した場合、TLR2の発現は正常者と比べてもモデルと比べても統計的有意差を示さず（𝑃<0.05） 、1時間のTLR2発現は増加したが（正常者と比較、𝑃<0.05） 、3時間および6時間の発現は正常者と比べて明らかな差を示さなかった（モデルとの比較、𝑃< 0.05）…バイカリンは、TLR2の発現を抑制し、モデルと比べても有意差を示さなかった。 0.5時間のTNFαの発現はコントロールよりまだ高く（𝑃<0.05），1 時間，3 時間，6時間の発現は明らかに低下し，モデルレベルとの有意差を示した（𝑃<0.05)． バイカリンは、図4（a）に示すように、タンパク質カスパーゼ3の発現には明らかに影響を与えなかった。

(a)

(b)

(c)

(d)

wogonoside (10 μg/mL) の添加後、TLR2およびTNFαは明らかにダウンレギュレートされた。 TLR2の発現はモデルよりもはるかに低く、正常値よりもさらに低かった（𝑃<0.05 ）。 TNFαの発現は，wogonoside投与後0.5時間から6時間まで明らかに抑制された（𝑃<0.05）． また、wogonosideはcaspase3の発現に明らかな影響を与えなかった（図4（b））。

バイカレイン投与後、TLR2はバイカレイン添加後0.5時間および1時間後も有意に発現が増加し（𝑃<0.05） 、3時間および6時間後には通常まで低下していることが示された。 TLR2と同様に3時間後、6時間後には正常値まで低下した（図4（c））。 TLR2はwogonin添加後0.5時間で正常値まで低下し（モデルとの比較、𝑃<0.05） 、実験期間中も低下したままであった。 0.5時間、1時間の時点では、TNFαは正常より多く発現していたが（𝑃<0.05） モデルより少なく、3時間、6時間ではTLR2発現と同様に正常レベルに近づいた（図4（d））。

バイカリン、ウォゴノサイド群と同様にカスパーゼ3の発現はバイカリン、ウォゴニン群で有意な変化を示さなかった（図4（c）、図4（d））

3.4. Total Antioxidation Competence (T-AOC)

T-AOCキットを用いて、正常細胞の抗酸化力は約2.5U/mgであり、酸素-グルコース欠乏処理した細胞の1つは0.5U/mgをはるかに下回っていることがわかった。 バイカリンでは1.8U/mLであり、正常細胞との比較、OGDモデルとの比較のいずれにおいても有意な差が認められた。 wogonoside群、baicalein群、wogonin群ではそれぞれ1.6、0.8、0.6 U/mgであり、いずれも正常値およびモデルとの有意差を示した（図5）。

4.考察

バイカリンはバイカリンから派生した糖鎖化合物で、バイカリンの部位7にD-グルコピラノシデュロン酸の官能基を持っており（図1）、より生物機能を発揮すると思われます。 バイカリンの基本構造は、ベンゾピランの5、6、7番目の部位に3つの水酸基を持ち、ベンゾピランの反対側（2番目の部位）にフェニル基を持つものである。 また、バイカリンはベンゾピラン環上にエノール構造を持ち、共役を維持している。 バイカリンとウォーゴニンの違いは、ウォーゴニンの炭素数8のメトキシル基とバイカリンの炭素数6の水酸基の2点である。 バイカリンは水酸基が3つあるため、より親水的な性質があると思われる。 また、wogonosideはwogoninの炭素数7にD-glucopyranosiduronic acidを持つグリコシル化体であり、wogoninの炭素数7にD-glucopyranosiduronic acidを持つグリコシル化体である。 バイカレインとバイカリンは炭素数6に水酸基を持つが、ウォゴニンとウォゴノシドには水酸基はない。 バイカリンとウォゴニンは炭素数7に水酸基を持つが、ウォゴノシドとバイカリンはともに7位の水酸基にグリコシル化されている；最後に、ウォゴニンとウォゴノシドは炭素数8にメトキシル基を持っているが、バイカリンとバイカリンにはこの官能基はない .

細胞毒性と神経保護作用の結果から、7位のD-グルコピラノシデュロン酸は細胞毒性を低下させるのに重要であり、バイカリンはバイカリンより細胞毒性が低く、ウォゴノシドはウォゴニンより細胞毒性が低いことが明らかになった。 704>

今回、PC12細胞の酸素・ブドウ糖欠乏（OGD）障害時にTLR2が高発現することを見出し、障害神経細胞で受容体が活性化していることが示唆された（図4）。 TLR2 は、免疫反応や炎症反応の重要なメディエーターとして同定されており、TNFαを活性化することで炎症反応を媒介することが確認されています。 704>

研究の結果、中枢神経系における TLR2 は、損傷シグナルの直接的な発生源であり、重要な治療標的であることが判明した。 その結果、化合物を添加してから数時間後にTLR2とTNFαの発現が明らかに減少した。 同じプロファイルで，wogoninとwogonosideはbaicalinとbaicaleinよりもTLR2とTNFαの発現をより抑制した。 発現抑制はwogoninおよびwogonoside投与後0.5時間から始まったが，TLR2およびTNFαの発現抑制はbaicalinおよびbaicalein投与後3時間と遅く現れた。 したがって，wogoninとwogonosideはTLR2に対して優先的に作用することがわかった。 704>

これらのアナログによるTLR2およびTNFαの過剰抑制を条件として、アナログ添加によるアポトーシスの有無を確認するためにカスパーゼ3の検出を行った結果、TLR2およびTNFαの過剰抑制が確認された。 OGDモデルにおけるcaspase3タンパク質の発現は、正常者と比較して確かにある程度増加したが、統計学的な差は認められなかった。 また、4種のアナログの投与により、caspase3タンパク質の発現量は、6時間後に減少し、正常対照に近づく傾向を示したが、明らかな変化は認められなかった（正常またはモデルとの比較、𝑃>0.05 ）。 以上の結果より、OGDモデルの傷害を受けたPC12細胞には明らかなアポトーシスは認められず、4種のアナログも傷害を受けたPC12細胞のアポトーシスを誘導することができないことが示唆された。 バイカリンはスナネズミの脳虚血再灌流障害を抗酸化・抗アポトーシス経路で抑制し、バイカリンとウォゴニンはヒト膵臓癌細胞およびHL-60白血病細胞でアポトーシスを誘導することが知られている。 704>

T-AOCの検出では、バイカリンとウォゴノシド>バイカリンとウォゴニンの配列が全体の抗酸化能力であり、バイカリンとウォゴノシドのサイト2上のグリコシル化形態が全体の抗酸化に大きな役割を担っていることが分かりました。

以上のことから、バイカリンとその3種のアナログは、神経細胞をOGD障害から保護し、TLR2の発現とTNFα（下流因子）の抑制を総合的に示したことから、脳障害の主要メカニズムの一つであるTLR2を標的とした脳卒中治療への応用の可能性が示唆された。 また、これらの化合物の間には、TLR2 を標的とした薬剤の安全性、有効性、特異性とともに、構造活性相関が存在する。 今回、バイカリンとその天然型類縁体が、TLR2、TNFα、T-AOCの分子標的として初めて研究されました。

Authors’ Contribution

最初の二人の著者は等しく貢献している。

Acknowledgements

著者は研究室のすべてのメンバーに感謝しています。 本研究は、中国国家自然科学基金（30801523, 81073092）、中国国家新薬研究特別プロジェクト（2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, 2011ZX09101-002-11）, 清華大学特別研究基金（LF 20103579）によって一部支援されたものです。