ベータガラクトシダーゼアッセイ（A better Miller）

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Background

β-…ガラクトシダーゼは、E. coliのlacオペロンのlacZ遺伝子によってコードされている。 coliのlacオペロンのlacZ遺伝子にコードされている。 120kDa、1024アミノ酸からなる大きなタンパク質で、4量体を形成している。 本酵素の細胞内での働きは、ラクトースをグルコースとガラクトースに分解し、炭素源・エネルギー源として利用することである。 合成化合物のo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド（ONPG）も基質として認識され、切断されてガラクトースと黄色をしたo-ニトロフェノールが生成される。 ONPGが酵素より過剰な反応では、単位時間当たりのo-ニトロフェノールの生成量はβ-ガラクトシダーゼの濃度に比例するので、黄色の生成量から酵素濃度を知ることができる

では、なぜ気にするのだろう。 通常、実験は細胞内のβ-ガラクトシダーゼ濃度が、研究対象のシステムの何らかの側面を読み取ることができるように設計されている。 例えば、ある研究者がlacZ遺伝子にプロモーターを融合させ、様々な条件下でのプロモーター活性の読み出しとしてβ-Gal濃度を使用することができる。 1972年、Jeffrey Millerが出版した “Experiments in Molecular Genetics “には、ONPGを用いてβ-Galの量を決定するプロトコルが記載されている。 このことから、ONPG/β-Galアッセイは「ミラー」アッセイと呼ばれ、β-Gal活性の標準的な量を「ミラーユニット」と呼んでいます

1 Miller Unit = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420}) – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})}. ここで、

  • Abs420は黄色のo-ニトロフェノールの吸光度、
  • Abs550は細胞の破片からの散乱で、これを1倍すると、1.となる。75は420nmで観察される散乱に近似する、
  • t = 反応時間（分）、
  • v = 測定した培養物の体積（ミリリットル）、
  • Abs600† は細胞密度を反映する、
  • Abs600† は細胞密度を表す。

†Note that this value is different for spectrophotometer used and should be calibrated by plating known Abs600 cultures to determine the colony-forming units per Abs600.

In his book, Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Drn. Millerは、この式は非誘導大腸菌（低β-Gal産生）では約1 Miller Unit、完全誘導培養（ラクトースまたはIPTGで培養）では約1000 Unitをもたらすと説明している。 この差の理由は不明だが、Miller博士の分光光度計と私の使用している分光光度計のAbs600/細胞密度の違いや、Miller博士が28℃でアッセイを行ったのに対し、私は（便宜上）30℃でアッセイを行っていることに起因しているのではないかと思う。

Protocol

私が使用しているプロトコルは、Zhang and Bremer の論文 (JBC 270, 1995, Free full text!) に由来しています。

要するに、このプロトコルは、バクテリアの培養液 (Abs600) の細胞密度を測定し、キュベットから細胞のアリコートを取り出して、細胞膜を破壊する洗剤を含む「透過化」溶液と混合します (ただし β-Gal はそのまま残します)。 これにより細胞は死滅し、翻訳が停止する。 インキュベーションの後、ONPG「基質」溶液を加え、黄色に発色させる。

  1. テストしたい条件下で培養する。
  2. 培養中に、80μLの透過液のアリコートを1.5mLマイクロチューブを使用し、チューブを閉めます。
  3. Abs600を測定し、記録します。
  4. 培養液の20μLアリコートを取り出し、80μLの透過液に加えます。

これでサンプルは数時間安定しました。

  1. 最後のサンプルを採取した後、サンプルと基質液を30℃の温室に20～30分間移します。
  2. 各チューブに600μLの基質液を加え、添加した時間を記録します。
  3. 十分に発色したら700μLの停止液に加えてよく混ぜ、停止した時間を記録します。
  4. 最後のサンプルを停止した後、チューブをマイクロフュージに移し、全速力で5～10分間スピンします。
  5. チューブを慎重に遠心分離機から取り出し、チューブの上部から溶液をキュベットに移します。 キュベット内に粒子状の物質があると、散乱して測定値に影響が出るので、それを避けるためです。 これは1より小さく、0.05より大きい必要があります。

Calculate Miller Units as:

displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ of culture sampled})*(\text{volume } )*(\text{reaction time}) })} ❺。 }

Comments on the assay

  • Reshma 11:28, 15 October 2007 (CDT)です。 MillerはOD600=0.28から0.70の培養を推奨しています。 しかし、彼はオーバーナイト培養も使用できるが、指数関数的に成長する細胞はより正確なアッセイを与えるとしています .
  • 反応はいつ行われるのでしょうか？ これに対する良い答えは、文献では見つけられませんでした。 反応を完了させると、Abs420は2-3程度になります。 もちろん、これは分光光度計の信頼できる範囲外ですが、反応がどこまで進むかの目安になります。 停止液を加える前に黄色が検出される程度で、停止前にLBブロスの色くらいになると、再現性のあるデータが得られました。 反応の途中で酵素を飽和させる基質が必要なので、行き過ぎないようにすることを忘れないでください。 私は日常的に、各培養について3回別々に測定し、それらを平均しています。
    • Reshma 11:28, 15 October 2007 (CDT): Miller は、OD420nm の測定値は理想的には 0.6-0.9 であるべきだと推奨しています。
    • 頻繁に、人々は使い捨てのプラスチック キュベットを使用して、培養物の濁度と黄色の o-nitropenol の両方を測定しています。 私の経験では、使い捨てのキュベットはひどい光学系を持っています。確かに透明ですが、光路は哀れなほど歪んでいます (遠くの物体を透視してみてください)。 ブランクとサンプルに同じキュベットを使い、分光光度計の中で同じ向きにすれば、これは大きな問題にはならない。 問題は、多くの異なる試料を異なるキュベットで測定した場合に発生します。 同じ培養液を異なるキュベットで測定した場合でも、値が大きく異なることがあります。 高品質のガラス製か石英製のキュベットを使用するか、底の平らな96ウェルプレートを使用したプレートリーダーで測定することをお勧めします。 私は、150μLの培養液をピペッティングしてAbs600を測定する際の誤差は、使い捨てのキュベットを使用するよりもはるかに少ないと感じている。 もちろん、測定した濁度は1cmキュベットと同様にcells/mLで校正する必要があります。
    • サンプルを回転させて上澄みから慎重に取り除くことにより、550nmでの散乱を測定して420nmではどうであるかを推測する必要がなくなります。 これは速すぎる。 誤差の大きな要因の一つは、反応時間の見積もりでしょう。 1時間程度かかるように反応条件を設定すれば、時間の誤差は小さくなる。 もし、反応を遅くする必要があれば、使用する細胞を少なくし、透過化バッファー量を増やして、100μLのままにしておくとよいでしょう。 あるいは、β-Galコンストラクトのリボソーム結合部位を弱めるために、再設計することも可能である。 もし、私の細胞が40,000ミラーユニットのβ-Galを作ると、翻訳ストレスで非常に具合が悪くなることがわかりました。 この場合、β-Gal mRNAの翻訳を弱める方が良いのです。
      • 私は酵素動力学を行うように、これらの反応を行います。 10秒間隔でサンプルを開始するので（時間はカウントアップ）、たとえ数分間しか反応させなくても正確な反応時間を得ることが可能です。 1.5～30分の反応時間で、非常に再現性の高い結果を得ることができます。 反応に必要な時間の感覚がつかめれば、同じ反応時間を必要とするサンプルをグループ化するのは簡単です。 各サンプルを3連で行えば、タイミングが再現可能であるという確信が得られます。 –Kathleen 16:43, 14 December 2005 (EST)
      • このアッセイを使って得た実際のデータの一例を紹介します。 これはタイムコースの実験でした。 各時刻に、それぞれの培養液から 1 mL を取り出し、OD600 を測定し、キュベットから直接 20 µL のアリコートを 3 つ取り、それぞれを 80 µL の透過処理溶液に加えました。 アッセイを上記のように正確に行い、全てのサンプルはタイムコースが終了するまで室温で保存した。 これらの培養物のOD600は、この実験の過程で0.4から4（私のスペックでは）まで変化し、β-Galアッセイの反応時間は2-25分と変化した。 各培養の各時点における3つの個別のβ-Galアッセイ（赤または黒のシンボル）をグラフにプロットし、各実験におけるアッセイの再現性を説明した–。Kathleen

      Millergraph.jpg

      レシピ

      透過液

      サンプルあたり80μL必要

      • 100mM第二リン酸ナトリウム（Na2HPO4）
        • （張本人は200mMリン酸ナトリウムとしています）
        • （張本のレシピは、100mM第二リン酸ナトリウムです。 これを他の成分と一緒にすると、どうやっても溶液化できなかったので、100mMに戻した。 50mMを使ったこともあるが、検出できない。）

        20mM KCl

      • 2mM MgSO4
      • 0.8mg/mL CTAB (hexadecyltrimethyl ammonium bromide)
      • 0.4 mg/mL デオキシコール酸ナトリウム
      • 5.4 μL/mL ベータメルカプトエタノール

      基質溶液

      1試料あたり600 μL必要です。

      • 60 mM Na2HPO4
      • 40 mM NaH2PO4
      • 1 mg/mL o-nitrophenyl-β-D-Galactoside(ONPG)
      • 2.7 μL/mL β-mercaptoethanol

      （Zhangプロトコルは20 μg/mL CTABと10 μg/mL deoxycholateも入っています。

      停止液

      1サンプルあたり700μL必要です。

      • 1 M Sodium Carbonate (Na2CO3)

      ストップ液の高いpHはβ-Galを変性させ、反応の黄色をおよそ2倍にします。