一次抗体の標識法トップ5

シグナル検出に抗体を用いるアプリケーション（ウェスタンブロッティング、ELISA、免疫組織化学、FACSなど）では、抗体の標識法には直接標識と間接標識の2つのアプローチがあります。 標準的なウェスタンブロッティングでは、一次抗体で標的抗原を検出し、次に検出分子を結合させた二次抗体を使用するため、間接的な標識となります。

状況によっては、二次抗体と関連するすべてのステップを省略して、一次抗体を直接標識する方がよい場合があります。 一次抗体の直接標識が必要なケースは以下の通りです。

• 二次抗体の非特異的な結合がある場合
• 非特異的な抗体を使用している場合標準的な生物の一次抗体-この場合、良い二次抗体を見つけるのが難しいかもしれません
• 同じ生物種に由来する抗体で多重化する場合
• 二次抗体のインキュベーションとそれに伴う洗浄工程を省いて実験時間を短縮したい場合

抗体パラメータ

選択した抗体を蛍光色素のみならず蛍光蛋白でラベルすることが可能です。 酵素、着色粒子など。 これらはすべて通常、末端のリジン基を介して結合しているので、すべてのステップを通じてアミン含有バッファー（例えばTris）や分子を避ける必要があります。 さもないと、バッファーの分子をほとんどラベル化してしまうことになるのです また、一般的な緩衝液の保存料であるアジ化ナトリウムも、標識反応を阻害するため避けるべきです。

標識用の抗体は、0.5 mg/ml以上の濃度で、>90%の純度のものを使用する必要があります。 抗体調製液中の妨害タンパク質やアミノ基含有分子が少ないほど、標識反応の効率は高くなります。 しかし、たとえ抗体がグリシンやBSAで泳動されていても、透析によって干渉物質を除去することはいつでも可能です。 また、A-proteinカラムに通すことで抗体の純度を上げることもできますし、適切な抗原を用いた独自のアフィニティ精製カラムを用意することもできます。

主な自社での抗体標識方法

NHS (Succinimidyl) Ester Method

この方法は、抗体をローダミン誘導体のように広く利用できる蛍光色素と結合させるために有用な方法です。 通常、リン酸緩衝液中で行い、その後、非標識色素からオンカラムで分離する。 主な欠点は、エステルは湿気に弱いため不安定であることである。

Isothiocyanate Method

Fluorescein isothiocyanate (FITC) は、蛍光タンパク質や抗体の調製によく使われる方法ですが、この方法で作製した抗体も使用することができます。 蛍光顕微鏡を扱ったことのある人なら、FITCを扱ったことがあるはずです。

イソチオシアン酸はNHSよりも安定ですが、作るのが難しく、この方法では標識反応の効率が悪くなる可能性があります。

カルボジイミド法

カルボジイミド由来の化合物は、タンパク質上のカルボキシル基をリジンと反応できる反応性の中間体に変換する。 カルボジイミドは反応性が高いため、磁性粒子や金粒子のような比較的不活性な物質で抗体を標識するのに使用できる。 最も一般的に使用されているカルボジイミドはEDCである。

方法は簡単ですが、NHSと同様にEDSは吸湿性があるので、標識後すぐに使用する必要があります。

Two-Tag Method

ここで、抗体を触媒として働く別のタンパク質、例えばHRPやアルカリホスファターゼで標識します。 どちらの分子も多数のアミノ基を持つため、（NHS法のように）直接架橋すると同じ分子のポリマーになってしまいます。 そのため、2つのステップに分けてリンクを行うことになる。 XとYは相互作用してコンジュゲートを形成する必要があるため、慎重に選択する必要があります。 たとえば、Xにマレイミド、Yにチオールを選択します。

得られたコンジュゲートはNHS法よりも安定ですが、この方法では、抗体、触媒、コンジュゲート反応に別々の標識と精製工程が必要で、3倍もの労力がかかります。

過ヨウ素酸塩法

この方法は、特異的なHRP-抗体コンジュゲートの生成に有用で、触媒分子をあらかじめ標識したものを購入し、抗体をそれにあわせて標識します。 リジン残基と相互作用するアルデヒド分子を生成することで、ペリオデートはHRPを活性化します。 HRP自体は数個のリジン残基しか持っていないので、酵素の重合はあまり気にならない。 HRPと抗体の結合は、シアノハイドライドナトリウムを添加して安定化させない限り、可逆的です。 同じような基礎化学を使った市販のキットもたくさんあり、もっと簡単にできるかもしれません。

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Literature:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM.のコメント欄に書き込んで、連絡を取ってください。 クリックケミストリーと放射化学。 最初の10年。 Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.