分岐DNA（bDNA）技術

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はじめに

分岐DNA（bDNA）アッセイは、核酸分子の信頼できる定量化のためのユニークで強力なツールを提供するものです。 bDNAアッセイは、PCRなどの標的増幅法とは根本的に異なり、検出手段として標的配列を複製するのではなく、レポーターシグナルをブーストすることで生理的レベルの核酸分子を直接測定するため、標的配列の抽出や増幅に特有の誤差が生じない。 bDNAアッセイは、合成オリゴヌクレオチドプローブとbDNA分子を用いた線形信号増幅を採用しており、約500～1000万分子の間で正確かつ高精度に測定することが可能である。 bDNAアッセイの新しい技術として、プリアンプ分子の追加、オリゴヌクレオチドプローブ配列への新規ヌクレオチドisoCとisoGの組み込みにより、シグナルをさらに増強し、bDNAアッセイ構成要素の非特異的ハイブリダイゼーションによるノイズを低減することができる。 これらの改良により、bDNAアッセイの定量的な検出限界は50分子まで広がりました。

bDNAテクノロジーの歴史

臨床または研究環境での日常使用に適したbDNAアッセイは、ウイルス性疾患患者の予後やモニタリングなど多くの分野で応用され成功しています。 B型肝炎ウイルスDNA、C型肝炎ウイルスRNA）、ヒト免疫不全ウイルス1型RNA、サイトメガロウイルスDNAを測定するために開発され、臨床検体中のウイルス量を直接定量するための信頼できる方法として利用されている。 オリゴヌクレオチドプローブのカスタム設計により、bDNAアッセイの応用範囲は、ウイルス核酸定量をはるかに超えるものとなっている。 標的核酸分子の特定の配列に対するオリゴヌクレオチドプローブを作成することにより、bDNAアッセイは様々なアプリケーションに適応することができるようになった。 例えば、細胞内のmRNAレベルを測定するためのプローブを設計して、bDNAアッセイを行った。 これは、健康な患者や免疫不全の患者集団におけるサイトカインmRNAレベルの変化のモニタリング、インスリンのスプライシングパターンの調査、分子毒性学アプリケーションにおけるストレス遺伝子誘導の評価など、多くの研究アプリケーションで実りあるアプローチであることが証明されている。 bDNAアッセイは、その汎用性、使いやすさ、高い性能から、核酸定量法として急速に普及しています

概要

bDNAアッセイは、96ウェルのマイクロプレート形式を採用しており、一連の特異的ハイブリッド化反応とハイブリッド化プローブの化学発光検出を基本としています。 各マイクロウェルの表面には、特定のヌクレオチド配列を含む「キャプチャー」プローブが付着しています。 これらの捕捉プローブは、標的核酸分子内の特定のヌクレオチド配列に結合している「標的プローブ」のサブセットに結合する。 この一連のハイブリダイゼーションにより、標的核酸分子はマイクロウェルの表面に固定される。 ターゲット核酸の検出とシグナルの増幅は、別の一連のハイブリダイゼーションによって達成される

ターゲットプローブの第2のサブセットは、ターゲット核酸分子をbDNA増幅器分子に結合させる。 標的プローブとbDNA増幅器分子の間に追加の増強層を提供する前置増幅器分子の追加により、さらに大きな信号増幅が達成されることができる。 各bDNA増幅器分子は15本の腕を持ち、それぞれの腕にはアルカリホスファターゼ標識プローブの結合部位が3つずつあるように設計されている。 アルカリホスファターゼによって活性化されたジオキセタン基質を導入すると、化学発光信号が生成される。 このシグナルは、ルミノメーターで放出された光子の数を数えることにより、簡単に定量することができる。 bDNAアッセイは、放出される光子の数が検体中の標的核酸の量に直接関係するため、本質的に定量的であると言える。

材料

装置 ・8×12マイクロウェルホルダー付きChironプレートヒーター ・Chironプレート読み取りルミノメーター

1日目の試薬

  • オリゴヌクレチオ-ド
  • Oligonucleotide- 試薬は以下の通り。修飾マイクロウェル
  • 溶解用希釈液
  • 溶解試薬（プロテイナーゼK）
  • 捕捉用ターゲットプローブ
  • ラベル用ターゲットプローブ
  • 検体標準品およびコントロール（オプション）

2日目の試薬

手順

1日目

  1. 組み合わせにより検体作業試薬を調製してください。
  • 6 ml 溶解希釈液
  • 600 ml 溶解試薬
  • 32 ml 500 fm/ml捕捉用ターゲットプローブ (20 fm/200 ml final)

    • 96 ml 500 fm/mlラベル用ターゲットプローブ (60 fm/200 ml final)

Note: 実際のターゲットプローブ濃度は、ターゲット核酸分子によって異なります。

  1. 血漿・血清検体の場合、Specimen Working Reagent 150mlと血清・血漿50mlをオリゴヌクレオチド修飾マイクロウェルに2本ずつ分注します。 細胞・組織試料の場合、Specimen Working Reagent を用いて RNA ペレットを調製・抽出し、各 RNA 抽出液を 200 ml ずつオリゴヌクレオチド修飾マイクロウェルに分注します。 コントロールはステップ2（上記）の検体と同じ方法で処理し、2重測定してください。
  2. 必要であれば、絶対定量用に標準品を入れることもできます。 検体作業試薬150mlと標準曲線メンバー50mlをオリゴヌクレオチドで修飾したマイクロウェルに分注します。
  3. マイクロウェルをマイラーフィルムでシールし、チロンプレートヒーターを用いて53℃で一晩インキュベートします。 (注)温度はアッセイに最適な温度となります。 プレートを冷却している間に、200fm/mlのアンプ濃縮液をラベル希釈液で希釈し、アンプ液を調製してください。 最終濃度は10fm/50mlです。
  4. マイクロウェルをWash Aで2回洗浄し、希釈したアンプを各ウェルに50mlずつピペットで注入してください。
  5. マイクロウェルをカイロン社製プレートヒーターで53℃、30分間インキュベートします。 プレートを冷却している間に、500 fm/ml のラベルプローブをラベル希釈液で希釈し、ラベル作業溶液を調製してください。 最終濃度は 20 fm/50 ml です。
  6. マイクロウェルを Wash A で 2 回洗浄後、Label Working Solution 50 ml を各ウェルにピペットで注入してください。 マイクロウェルを53℃のチロンプレートヒーターで15分間インキュベートします。
  7. チロンプレートヒーターからプレートを取り出し、室温で10分間静置します。 この間に99.7% v/v LumiphosPlusと0.3% v/v 10% SDSからなる基質溶液を調製する（例：LumiphosPlus 3 ml, 10% SDS 9 ml）
  8. Wash Aでマイクロウェルを2回、 Wash Bで3回洗浄し、50 mlの基質溶液をそれぞれのウェルに加える
  9. 化学発光の測定プレート読み取りルモメータで発光を測定する（例：LuRnO3,LumiphosPlus 3 ml、LuRnO3,LumiphosPlus 9 ml）。 (

トラブルシューティング

  • オリゴヌクレオチド修飾ウェルの取り扱いは慎重にお願いします。 ウェルストリップを分割して使用しないでください。 インキュベーション中の蒸発を防ぐため、新しいプレートシーラーでウェルをしっかりと密閉してください。 インキュベーション後、プレートシールを剥がす際には、マイクロウェルホルダーからウェルを引き抜かないように注意してください。 また、脂質が多い検体や濁りのある検体は定量できない場合があります。
  • 最適な結果を得るために、すべての試薬は使用前に測定手順書に記載されている温度まで下げてください。 マイクロウェルへの試薬の添加は、ピペットチップをウェルの中央付近の壁に接触させ、ウェル内の液面より上になるように行います。

アプリケーション

ウイルス定量またはウイルス負荷試験は、HIV-1またはC型肝炎ウイルス（HCV）に感染した患者の日常管理の一部になっています。 現在、臨床検査室で使用可能な分子技術がいくつかある。 これらのうち、分岐DNA（bDNA）アッセイだけが、HIV-1およびHCVのウイルス負荷試験としてFDAに承認されている。 この信号増幅技術は、一連のハイブリダイゼーション反応の上に構築されており、完全自動化に非常に適しているため、この種の分析の実行に必要な労力を軽減することができます。

核酸標的分子の検出にbDNA技術を用いた分子診断アッセイは、ウイルスおよび細菌感染の診断や、治療中の疾患進行のモニタリングにおいて、感度、特異性、信頼性の高いツールです。bDNA試験は、研究室での開発段階から、貴重な臨床アプリケーションを持つ米国食品医薬品局承認の定量分析法へと発展してきています。 bDNA検査は、完全自動化への適応性が高いため、多くの分子ベースの手順よりも労働集約的でない。 bDNAを用いると、標的配列の増幅が不要であるため、過剰なアンプリコンやキャリーオーバーによる複製サンプル間のクロスコンタミネーションが起こりにくくなる。 また、bDNAはシグナル増幅技術であるため、アッセイはそのダイナミックレンジ全体において0.5 logまたは3倍以下の変動で定量することが可能である。

bDNAテクノロジーは、寄生虫トリパノソーマ

ブルージー、サイトメガロウイルス、抗生物質感受性および耐性ブドウ球菌、ヒトパピローマウイルス、B型肝炎ウイルスなどの幅広い微生物による感染を検出する方法が開発されており、汎用性があることが証明されています。 しかし、最近ではHIV-1やC型肝炎ウイルス（HCV）のRNAを定量するためのbDNAアッセイの開発に注力し、臨床分子診断室でのbDNA法の日常的な適用につながってきている。

第一世代のHIV-1 bDNAアッセイ

正確で再現性の高い第一世代のbDNAアッセイは、ヒト血漿中のHIV-1 RNAおよびHCV RNAの検出用に開発された（Quantiplex HIV-1 or HCV RNA 1.0.0）．0 assay, Bayer, Tarrytown, NY）。9-11 Quantiplex bDNA assayの最初の報告の1つでは、血清陰性のドナーの血漿サンプルを用いて、第一世代の

bDNA assayを用いた反応性が観察されず、優れた特異性が示されました9。 bDNAアッセイでは、HIV-1の血清陽性の患者348人のサンプルの83%で陽性結果が観察された。9 Quantiplex HIV-1 RNA 1.0アッセイによる定量化のダイナミックレンジは、104（検出下限）から106以上のHIV RNA copies/mLに及んだ9,11。 bDNA検査では、2～3倍のウイルス量の変化が統計的に有意であり、Quantiplex HIV-1 RNA 1.0アッセイの精度と再現性が高いことが示されました。 したがって、bDNAは、ウイルス量検査と新しいHIV-1逆転写酵素およびプロテアーゼ阻害剤の臨床効果を評価するほとんどの臨床試験で選択される方法となった。

bDNA検出方法の感度は、標的および捕捉プローブの設計を変更し、前置増幅オリゴヌクレオチドを追加することによって第2世代のHIV-1アッセイ（Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay、Bayer）において強化された。 ターゲットおよびキャプチャープローブの設計を改善することにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高め、アッセイのバックグラウンドを減少させることができた。 プリアンプは、1つのプリアンプ分子が多くのbDNA分子とハイブリダイゼーションするための複数の領域を持っているため、シグナル強度を劇的に増加させることができる。 さらに、各bDNA分子はAP標識プローブとハイブリダイゼーションするための複数の繰り返し配列を持っている。 Quantiplex HIV-1 RNA 2.0アッセイを用いたシグナル出力は、約500 copies/mL から 1.6 × 106 copies/mL まで直線性を示した（記載のダイナミックレンジは500から8 × 105 copies/mL ）。 また，第2世代HIV-1 bDNAアッセイの感度は第1世代アッセイと比較して20倍に向上した（検出下限はそれぞれ500 copies/mLと10 × 104 copies/mLであった）． 精度に関する広範な分析では，Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assayの初回検査結果と再検査結果を比較した． HIV-1 RNA 2.0アッセイは高い再現性を有していた14。ウイルス量が5,000コピー/mL以上の174検体のうち、96%で初回結果と再検査結果のコピー数の差が0.3 log10未満であった。 ウイルス量が500〜5,000copies/mLの69検体では、86％が初回と再検査の結果の差が0.3log10未満であった。 しかし，1年間のインターバルでルーチン臨床検査を受けた5,339人の患者のうち，ウイルス量が500copies/mL未満のサンプルは41.6％であった。

したがって，かなりの割合の患者に対して，より感度の高い（すなわち，検出下限が<500 copies/mL）bDNA assayが必要であると考えられた。

既知のHIV-1ウイルスコピー数を持つ標準サンプルの希釈液を用い，Quantiplex HIV-1 RNA 2.0アッセイとRT-PCRテスト（Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）の性能特性が比較された。 同じ標準試料の希釈液を2つのアッセイで試験した場合、HIV-1コピー数は一般にbDNAアッセイよりもRT-PCRアッセイの方が高かった。 例えば、RNAコピー数の範囲は、bDNAアッセイでは900から7.68×105copies/mL、RT-PCRアッセイでは3,360から1.88×106copies/mLであった。 HIV-1コピー数対信号出力の回帰直線の傾きを比較すると，bDNA法は比例的な系統誤差が少ないことが示唆された． 1,650 HIV-1 コピー/mL の標準試料を用いた検査間の変動は、bDNA 検査の方が RT-PCR 検査よりも低かった。bDNA および RT-PCR 検査の変動係数はそれぞれ 24.3% および 34.3% であり、この HIV-1 RNA コピー数では bDNA 検査の方がわずかに正確だったことが示唆された。 また，1,650copies/mL標準品と比較すると，165HIV-1 RNA copies/mLを含む検体ではラン間変動係数が高くなった（44.0%，42.bDNAアッセイとRT-PCRアッセイではそれぞれ7%）。 HIV-1のコピー数が等しい場合，bDNAテストによってHIVサブタイプAからFの間で比較すると，アッセイ結果は同様であった． しかし，このバージョンのRT-PCRでは，A，E，F亜型はB，C，D亜型に比べ検出効率が低かった． 第2世代のbDNA検査とAmplicor Monitor RT-PCR検査によるHIV-1定量化の違いは、診断と治療を通じて、個々の患者さんに検査方法の一貫性が必要であることを示唆しています。 HCVの検出については，第1世代のbDNAアッセイ（Quantiplex HCV RNA 1.0 assay，Bayer）が，ヒト血漿中のHCV RNAコピー/mLの動的定量範囲を3.5 × 105から1.2 × 108まで有していた． このアッセイを用いることにより，ジェノタイプ1〜6が検出されたが，ジェノタイプ1（検出率97％：HCVジェノタイプ1を含むことが分かっている血清69検体中67検体に陽性信号）と比較して，ジェノタイプ2および3（検出率67％：HCVジェノタイプ2または3が含まれていると分かっている89検体中60検体に陽性信号）では感度が低いことが判明した． Quantiplex HCV RNA 1.0アッセイと研究所が開発したHCVのRT-PCR検査の比較では，RT-PCR検査の方が感度が高く，検出下限値は2.5×104 HCV RNA copies/mLであった． しかし，HCV bDNA検査は，研究室開発のHCV RT-PCR検査よりも再現性が高く，時間も短かった。

HCVジェノタイプ2および3の検出率を改善するために，第2世代のアッセイが開発された（Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer）。15 第2世代のHCV RNA検査における大きなデザイン変更は，HCVゲノム中の，遺伝子型を超えて保存性が高い配列へのプローブを用いたことであった． これらの保存領域は、5′非翻訳配列とHCVゲノムのコア遺伝子の配列であった。 ターゲットプローブとキャプチャープローブを変更した結果、第2世代アッセイではHCVの遺伝子型による検出率のばらつきが劇的に減少した。 6つのHCVジェノタイプはいずれも高い検出率を示し、HCVジェノタイプ2および3の検出率も著しく向上した（HCV2.0およびHCV1.0アッセイでは、HCVジェノタイプ2または3を含むことが分かっている検体の93%から67%が検出された）。 また、第2世代のbDNAアッセイの感度は、HCV 1.0アッセイと比較してわずかに向上しました（定量下限は2.0×105 vs 3.5×105 ）。

HIV-1とHCVに対する第3世代bDNAアッセイ

第1世代と第2世代のbDNAアッセイは、ターゲットではない配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリッドが非特異的に起こり、アッセイの感度に制限がありました。 第3世代のbDNAアッセイ（Quantiplex HIV-1 RNA 3.0）における重要な技術的改良点は、そのような非標的配列に対する非特異的なハイブリダイゼーションであった。0アッセイ，Bayer）では，標的ウイルス核酸のプレート表面への捕捉を仲介する捕捉エクステンダーを除き，bDNAシステムのすべてのプローブの合成に非天然塩基，5′-メチル-2′-デオキシイソグアノシン（isoG）および 5′- メチル-2′- イソキシシチジン（isoC）を用いることが，決定的な技術的改良であった。 isoGとisoCを含むオリゴヌクレオチドは自然界に存在しないため、非特異的なハイブリダイゼーションが著しく減少する。 したがって、非天然塩基で修飾されたプローブは、標的RNAが存在しない場合には、捕捉プローブと安定なハイブリッドを形成することがない。 第3世代アッセイの最初の説明では、11人の患者からの血漿検体中のHIV-1の検出限界は50コピー/mLであった。これは第2世代アッセイと比較して検出限界が10倍向上したことを意味する。 VERSANT HIV-1 RNA 3.0は、75～5×105 HIV RNA copies/mLのダイナミックレンジを有し、高活性抗レトロウイルス療法によりHIV-1ウイルス量は11名全員において検出限界以下まで減少しました。 また、バージョン3.0は、他のいくつかの国で50コピー/mLの検出下限が承認されています。 第2世代のHIV-1 bDNAアッセイ（Quantiplexバージョン2.0）とAmplicor Monitor 1.0 RT-PCRアッセイで一致するサンプルを比較すると、bDNAテストでは一貫して低いHIV-1コピー数が得られた。 しかし、第3世代（バージョン3.0）アッセイとAmplicor Monitor 1.5 RT-PCRテストの間には、HIV-1 RNAコピー数に近い定量的相関が見られました18。バージョン3.0 bDNAアッセイとAmplicor RT-PCRアッセイのウイルス量結果は、バージョン2.0アッセイの約2倍となりました。 バージョン3.0のbDNA検査とRT-PCR検査における定量的な類似結果は、抗HIV治療の経過を調べるために同じ患者からの検体を検査する際に異なる方法を用いる可能性が高いため、患者のケアにおいて重要である。 最近のデータでは、RT-PCRアッセイで検査した患者のリベースは必要ないかもしれないことが示唆されている。

HIV-1 version 3.0 bDNAアッセイと同様に、HCVの第3世代のbDNAアッセイもまた、非特異的ハイブリダイゼーションを減らすためにisoCおよびisoG置換オリゴヌクレオチドが使用されている。 isoCおよびisoG置換オリゴヌクレオチドの使用により、アッセイの感度が約62倍向上した。 HCV RNA 3.0の検出下限は，HCV RNA 2.0の2×105 copies/mLに対し，3.2×103 copies/mLであった． HCV RNA 3.0アッセイの動的直線定量範囲は3.2 × 103 copies/mL (615 IU/mL) から4 × 107 HCV RNA copies/mL (7.7 × 106 IU/mL) までであった． HCV RNA 3.0は高い特異性（98.2%）を有し，第2世代アッセイと同様に，すべてのジェノタイプのHCV RNAの定量に等しく有効であることが確認された． 血清中のHCVを除菌することに加え、抗HCV療法の重要な目標は肝臓中のHCV濃度を下げることである。 HCVとHIVの重複感染者25人を対象に、肝生検検体中のHCV RNAの検出と定量に対するHCV RNA 3.0 assayの有用性を検討した20。第3世代のHCV bDNA assayの再現性は、肝生検検体と血清検体で同様であった。 また，ジェノタイプ1，3，4に感染した患者の肝検体におけるHCV RNAの検出は，HCV RNA 3.0 assayにより高い特異性と感度を有していた． 25名の患者を対象とした本研究では，治療前の肝内

HCVの高値は，抗HCV療法への反応頻度が低いことと相関していた。 治療前の肝内HCV濃度は，HCVジェノタイプ1に感染した患者で最も高かった。 本研究の結果，HCVの疾患進行の重要なマーカーである肝内および血清中のHCV濃度は，治療中にbDNA分析によって信頼性の高い定量が可能であることが示された。 第3世代のbDNAアッセイの方法は、HIV-1 RNAおよびHCV RNAの試料調製、ハイブリダイゼーション、シグナル検出を含む。 HCV RNA 3.0アッセイでは、抽出工程を別途必要としないため、3つのアッセイはすべてシステム340プラットフォームのマイクロウェルで実施されます。 バージョン3.0のHIV-1 RNAアッセイでは、サンプル調製はHCV RNAメソッドとは異なり、System 340プラットフォームの外で行われます。 最近の研究では、バージョン3.0のHIV-1 RNAメソッドの適応が評価され、システム340プラットフォームでのHCVとHIV-1の同時検査に対応するためにHIV-1サンプル処理工程が修正されました。 HIV-1メソッドは、ウイルス溶解のための63℃での2時間のインキュベーションを省略することで変更されました。 その代わりに、HIV-1およびHCVの溶解はSystem 340プラットフォームで行われました。 HCV bDNAの検査方法は、複合アッセイで変更されませんでした。 複合bDNA法による特異性と定量性は、個々のHIV-1およびHCVアッセイの仕様の範囲内であった。 HIV-1およびHCVの同時検査は，臨床検査室におけるワークフローを改善し，コストの低減につながった． HIV-1 RNAとHCV RNAの検出と定量は診断と治療効果の評価に重要であるため，両ウイルスの同時検査は分子診断学において重要な進歩を意味する

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