抗体バリデーション

すべての抗体がすべての実験や条件に対して有効であるとは限りません。 特定の用途や生物種に対してバリデートされる必要があります。 現在、「抗体バリデーション」の標準的な手段はなく、実験の再現性・信頼性に大きな影響を与える可能性があります。 ジャーナルや助成機関は、このギャップに対処するための措置を講じています。 現在では多くが、特定の用途に対してどのように抗体を検証するかを明示的に示すことを要求しています。 残念ながら、抗体のバリデーションに普遍的に受け入れられる基準はありません。

基本的なバリデーション

標準的な抗体のバリデーション方法には、ウェスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリー、IHCがあります。 ほとんどの研究者は、これらの試行錯誤を経た手法に慣れています。 研究者やメーカーは、それぞれの用途に応じて抗体の検証を行わなければならないため、検証プロセスには時間がかかることがあります。 それぞれのアッセイで条件が異なるため、この困難さはさらに増します。 例えば、ウェスタンブロットでは、タンパク質の変性に依存します。 同様に、ネイティブなタンパク質親和性で検証された抗体が、変性や固定化によって同じ抗原に結合しない可能性もあります

上記の方法は、抗体を検証する上で必要な役割を担っています。 しかし、これらの方法だけに頼ることはできない。なぜなら、これらの方法は、拡大し続けるアプリケーションを代表していないからである。

Old Techniques, New Uses

基本的な抗体バリデーションの欠点に対処するため、科学者のグループが最近集まり、「抗体バリデーションのための標準ガイドラインを提案」2しました。 2

• Genetic Strategies（遺伝学的戦略）。 CRISPR-Cas9 and More

  遺伝的戦略は、CRISPR-Cas9、RNAi、siRNAノックダウンなどの技術からなり、タンパク質検出アッセイと組み合わせて使用されます。 これらの方法は、適切な遺伝子をノックアウトまたはダウンした後、問題の抗体による非特異的な結合を検出するものである。 抗体が特異的であれば、ノックアウトまたはダウンした細胞株では、それぞれ抗体からのシグナルが検出されないか、減少するはずです。

• 独立抗体法

  独立抗体の使用は、非特異結合を検出できる別の方法である。 独立抗体法では、同じ抗原に結合するがエピトープが異なる2種類の（独立した）抗体を用います。 この手法では、標的タンパク質の発現量にばらつきがあるため、複数のサンプルを用いて検証する必要があり、コストと時間がかかる可能性があります2。 GenScriptは、タンパク質抗原の「独立抗体」を含むMonoExpress™ mAbサービスでエピトープビニングを提供しています。

• タグ付きタンパク質発現

  タグ付き標的タンパク質の検出を分析することは、抗体の非特異結合を測定する方法となる可能性もあります。 この方法では、標的タンパク質をアフィニティタグ（すなわち、FLAG）または蛍光タンパク質（すなわち、GFP）のいずれかで修飾する。 そして、独立した抗体のアプローチと同様に、検証対象の抗体の検出パターンをタグ特異的な抗体の検出パターンと比較する。 2

  Recombinant Antibodies as an Alternative to Monoclonal Antibodies?

  抗体のバリデーションに関する最近の呼びかけでは、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体ではなく、リコンビナント抗体のみを使用するよう提案されています。 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株を用いて生産される。 残念ながら、ハイブリドーマ細胞株は、凍結保存から取り出すと、死滅したり、抗体をコードする遺伝子を失ったり、増殖しないことがある3。 そのため、ハイブリドーマがコードする抗体の配列を決定し、組換えで抗体を作製することで、これらの問題を克服することができる。 また、配列が確定しているため、上記の手法だけでなく、組換え抗体を用いることで、もう1つの検証を行うことができます3。

  これらの追加のバリデーション方法は、「抗体がターゲットと結合することを証明し、ほとんどの場合、試験した条件下での潜在的な交差反応性の評価も可能にする」ことを提案しています2。しかしながら、抗体を適切に検証するには、古い方法と新しい方法を組み合わせて行う必要があると思われます。

適切な抗体バリデーション法の選択

抗体を取り巻くこのような問題がある中で、どのように適切な方法を選択すればよいのでしょうか？

まず、どのアッセイで抗体を使用するかを決定する必要があります。 例えば、CRISPR-Cas9法では、標的タンパク質の改変を伴わず、抗体が他のタンパク質との交差反応性を欠くことを検証しています。 そのため、ウェスタンブロット、IHC、免疫細胞化学（ICC）、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降（IP）、クロマチン免疫沈降（ChIP）、逆相タンパク質アッセイなど、さまざまなアッセイで抗体のバリデーションを行うことが可能です※2。 しかし、修飾タンパク質の発現は困難であるため、タグ付きタンパク質の発現を用いた抗体のバリデーションは、ウェスタンブロット、IHC、ICC、フローサイトメトリーでのみ推奨されています

次に、研究者はこうしたバリデーション方法のサンプル制限を認識しておく必要があります。 例として、CRISPR-Cas9/KOおよびタグ付きタンパク質発現技術はいずれも、ヒト組織サンプルおよび血漿や血清などの体液中の抗体のバリデーションには使用できません(2)。 2

最後に、抗体プロバイダーが使用する抗体およびそれぞれのバリデーション手法にかかわらず、研究者は、特定の用途またはサンプルコンテキストで少なくとも1つのバリデーション戦略を実行する必要があります。 この情報は、お客様のラボで使用する適切な方法を決定するための指針になります。 抗体のバリデーションやその他の用途については、GenScript Antibody Technical Resourcesをご覧ください。

GenScriptに代わってBitesizeBioが作成したコンテンツから引用しています。