指標菌Escherichia coliとEnterococci spp.の薬剤感受性 の抗生物質感受性を調べた。

方法

調査地域とカモのサンプリング

この横断的研究は、2014年11月から2015年3月の間にモロゴロ市において実施し、26の裏庭の群から100羽のMuscovy duck (Carina moschata) をサンプルに採取した。 調査対象のアヒルは、各群からランダムに選択され、群れサイズの5～10％がサンプリングされた。 調査対象は、メス86羽、オス14羽である。 調査前に、管理、給餌、使用、未使用抗生物質の廃棄に関する基本情報を質問票により収集した（Additional file 1）。 採取したアヒルを拘束し、滅菌綿棒を肛門に挿入して糞便を採取した。 採取した糞便は氷嚢とともにクールボックスに保管し、分析のためにソコイネ農科大学の研究室に輸送した。 大腸菌と腸球菌の分離と同定

糞便サンプルはMacConkey agar (Oxoid, Basingstoke, UK) にプレートし、好気的条件下で24時間培養し、大腸菌の分離を行った。 さらに、コロニー形態、グラム染色、生化学的検査に基づいて、疑わしいコロニーを同定した。 腸球菌の分離には、サンプルをSlanetz-Bartley寒天培地（Oxoid, Basingstoke, UK）にプレーティングし、好気的条件下で48時間培養し、コロニーの形態と生化学的検査に基づいて同定した。 大腸菌と腸球菌は，ディスク拡散法を用いてCLSIに準拠した抗生物質感受性の検査を行った． 抗菌薬感受性試験は，タンザニアの医療現場で一般的に使用されているいくつかの抗菌薬に対して実施した。 アンピシリン10 μg，セフォタキシム30 μg，トリメトプリム・スルファメトキシン25 μg，テトラサイクリン30 μgの4種類の大腸菌用抗菌薬について，濃度を変更して試験を行った。 腸球菌は、アンピシリン10 µg、エリスロマイシン15 µg、リファンピン5 µg、テトラサイクリン30 µg、トリメトプリム・スルファメトキシン25 µgに対してテストされました。 すべての抗生物質ディスクはOxoid, Basingstoke, UKから入手した。

倫理的配慮

この研究を実施する許可はMorogoro Municipal Livestock Officerによって与えられ、研究の倫理承認はSokoine University of Agriculture, Tanzaniaの倫理委員会によって行われた。

Results

培養した100の糞便サンプルのうち91%に大腸菌が存在し、そのうち64 (70.3%) が異なる抗生物質に耐性を示した (Table 1)． 大腸菌が示した複数の抗生物質耐性は以下の通りであった。 大腸菌の抗生物質耐性は，4種類28株（30.8％），3種類35株（38.5％），2種類13株（14.3％），1種類11株（12.1％）であった． 腸球菌は全検体から分離され，42％が異なる抗生物質に対して耐性を示した． 腸球菌の5％はすべての抗生物質に耐性を示し，13％は4種類の抗生物質に，21％は3種類の抗生物質に，26％は2種類の抗生物質に，28％は1種類の抗生物質に耐性を示した． アヒルの管理と残留抗生物質への接触の可能性についての結果を表2にまとめた。 26軒の農家のうち、92.3％がアヒルの飼育を広く行い、アヒルがゴミ捨て場に出入りしていた。 アヒルへの動物用医薬品の投与は報告されていないが、回答者はテトラサイクリン/オキシテトラサイクリンを使用して他の動物を治療していることを報告した

Discussion

今回の研究では、大腸菌分離率が91％、すべての鴨に腸球菌が生息し、分離株は高い割合で複数の抗生物質に抵抗性があったことが判明しました。 本研究は，タンザニアで放し飼いにされているアヒルからの指標菌が，抗生物質耐性の研究に利用できることを明らかにした。 このことは、抗生物質治療を受けていない動物から分離された細菌にも、抗生物質耐性の問題が広がっていることを示唆している。 このことは，アヒルが家畜の飼料を漁り，糞便を撒き散らすため，耐性菌が食物連鎖に入り込んでヒトに影響を及ぼしたり，耐性遺伝子が病原性細菌に移行したりする可能性があり，公衆衛生上も影響がある． ナイジェリアでは、8.6%という低い有病率が報告されているが、これはおそらくofloxacin、nalidixic acid、gentamycinといった異なる抗生物質を使用しているためであると考えられる。 本研究で観察された高い抗生物質耐性率は、アヒルが広く使用されているため、動物や人の排出物から常に残留する抗生物質にさらされているためと考えられる。 食用動物に使用された抗生物質は腸管での吸収が悪く、親成分は糞便中に排泄されるという研究報告がある。 このことは、下水や家畜排泄物中に高レベルの抗生物質が残留していることを報告したいくつかの研究によって裏付けられている。 本研究では、大腸菌のアンピシリンに対する耐性が81％と他の抗生物質に比べ最も高く、スロバキアでの報告でも87.8％が耐性であった。 一般に，大腸菌の60～70％がアンピシリンに対して耐性を獲得しているとされている． これは、アンピシリンの使用量が多すぎるため、その残留物がアヒルの餌となる環境汚染源となる可能性があるためと考えられる。 スルファメトキシンの耐性率は76％であり、Van Tuatが以前に報告した値と同じであった。 テトラサイクリンの耐性は，スロバキアでは37.5％，ナイジェリアでは75％であったが，本研究では59％であった． また，大腸菌はセフォタキシムに対して63％の耐性を示したが，この抗生物質はタンザニアでは動物の治療にはあまり使用されていない． カモ類は、人糞や廃棄された薬剤の残骸があるゴミ捨て場からセフォタキシムの残留物を入手する可能性がある（表2）。 しかし，異なる医療施設の下水道から分離された細菌では，cefotaximeに対する高い耐性が観察された。

本研究では，大腸菌の複数の抗生物質に対する多重耐性も観察された。 この結果は，ベトナムで実施された大腸菌の抗生物質4剤耐性が16.7％，3剤耐性が20％，2剤耐性が23.3％であったことと比較すると，高率であることがわかった。 このような多剤耐性菌の出現は、家畜が耐性菌のリザーバーとして環境汚染に関与していることを示唆するものであった。 また、抗生物質に暴露された動物の腸内から分離された細菌集団は、任意の抗生物質に対して5倍以上の耐性を持つことが判明している。 非耐性菌は、通常、接触することで染色体外にある抗生物質耐性プラスミド（Rプラスミド）を耐性菌から獲得する。 このような耐性菌の出現は、環境中に大量の残留物を排出する抗生物質の不合理な使用が原因である可能性がある。 また、医療機関においても、感染症の推定治療に広域抗生物質が容易に入手でき、広く使用されていることも、耐性菌の発生を引き起こす要因のひとつと考えられる。 また、感染管理プログラムの一環として抗生物質の使用に関する規制が施行されていないことも、耐性結果のパターンにかなりの影響を及ぼしている可能性がある。

腸球菌属はヒトおよび動物の腸の自然常在菌である。 すべてのカモの腸内にはEnterococci spp.が存在し、試験したさまざまな抗生物質に対して42％の耐性率を示した。 しかし，本研究で得られた知見では，rifampin（62％），ampicillin（62％），tetracycline（42％）に高い耐性が認められた． また，65％以上の菌株で多剤耐性が確認された。 このように、アヒルに医薬品が使用されていないにもかかわらず、さまざまな抗生物質に対する耐性菌が認められたのは、アヒルが捕食する環境に排出された残留物が、抗生物質や他の耐性菌に容易に曝露されるためであると考えられる。 耐性菌が非耐性菌と接触すると、遺伝物質の交換が起こり、耐性遺伝子が獲得される可能性がある。 その他にも、鴨から分離された腸球菌がマクロライド系やリンコサミド系の抗生物質に対して耐性を示したという研究報告もある . しかしながら、腸球菌属はセファロスポリンやアミノグリコシドを含むいくつかの抗生物質群に対して本質的に耐性である。 さらに、多くの株はテトラサイクリンのような様々な抗生物質に対する後天性耐性を獲得するための伝達性遺伝要素を保有している。 アヒルから分離された腸球菌の抗生物質耐性研究は，バンコマイシンを用いて行われている。 また，腸球菌のバンコマイシンはタンザニアでは一般的な薬剤であることから，今後さらなる感受性の研究が望まれる． アンケート調査の結果，大腸菌や腸球菌の高い耐性率が実験室で確認された． 動物用医薬品を使用していないにもかかわらず，ダチョウは広範な清掃管理システムにより，抗生物質の残留物や，抗生物質を投与された動物やヒトの他の細菌に環境にさらされている。 このことは、観察された耐性菌がヒトや動物によく使用されている抗生物質に対するものであったという知見からも裏付けられる（表2）。 耐性菌は、下水道排出物や環境などさまざまな場所から分離されている . また、家庭内では薬剤の残骸や容器が無造作に捨てられ、アヒルに抗生物質が付着している可能性がある。 本研究では，大腸菌と腸球菌の抗生物質耐性が高いことが示された． このことは，アヒルから分離された細菌の抗生物質耐性遺伝子の主要な供給源として，常に抗生物質を投与されている家畜や鶏が担っている可能性を示している。 本研究では，モロゴロ市から採取した100羽のアヒル試料のみを用いたため，タンザニアのアヒルにおける大腸菌および腸球菌の抗菌薬耐性状況について，一般化には限界があった． また，検査した抗菌薬の種類も少なかった。 ディスク拡散試験法による菌の抗菌薬感受性検査は，ブロス微量液体希釈法より劣る可能性がある。 また，大腸菌や腸球菌の耐性遺伝子型については，異なる種類の抗生物質に対する耐性は明らかにされていない。 しかし，アヒルのサンプリング現場では，他の動物の存在が，アヒルから分離された細菌の耐性率に交絡因子として作用していた

．