漢方薬の新粕の内皮保護機能を介した抗血液凝固作用
Abstract
漢方薬を含め、補完代替医療（CAM）は世界中で盛んに行われている． 中国では伝統的な漢方薬である心桂枝湯が冠動脈疾患の治療に広く使用されている。 本研究では、ウサギの動脈硬化性心筋虚血に対する真菌錠の保護効果とその推定される機序について検討した。 ウサギを4群に分け、それぞれ異なる飼料を12週間摂取させた。 コントロール（標準食）、モデル（高コレステロール食）、XKS（高コレステロール食、184.8 mg/kg/dの秦粕）、アトルバスタチン（高コレステロール食、5.0 mg/kg/dのアトルバスタチン）である。 血漿リポ蛋白、心電図、内皮依存性血管弛緩、組織形態学的研究、および冠動脈のeNOSとVCAM-1の発現を評価した。 その結果、新槐はアトルバスタチンと同様に、内皮依存性血管弛緩作用、動脈硬化進行抑制作用、心筋虚血抑制作用、eNOSおよびVCAM-1発現変化作用に有意な効果を示した。 しかし、高コレステロール血症のウサギでは、シンケシはリポ蛋白の低下作用を示さなかった。 本研究の結果は、動脈硬化性心筋虚血ウサギに対して、心筋梗塞の予防と抗虚血作用があることを示唆している。 そのメカニズムには抗高脂血症作用の他に内皮保護作用が関与している可能性が示唆された。 はじめに
冠動脈疾患（CHD）は主に動脈硬化によって引き起こされ、この疾患の発症には高コレステロール値が重要な役割を担っている. 動脈硬化の原因は脂質の滞留、酸化、修飾と考えられ、すべての主要な導管動脈の壁の感受性部位に慢性炎症を引き起こす。 CHDによる死亡率の減少には大きな進歩があったが、この疾患は依然として世界の主要な死亡原因である。 スタチンは、この分野で最も強力な薬物である。 スタチンは、低比重リポ蛋白（LDL）を低下させるだけでなく、高比重リポ蛋白（HDL）を上昇させ、血管内皮機能を高めることが研究で明らかにされている ……。 しかし、スタチンの副作用である肝機能障害や筋融解により、治療から離脱する患者もいました。 漢方薬を含む補完代替医療（CAM）は、世界的に一般市民に普及している。 高脂血症、抗酸化作用、抗動脈硬化作用など、強力な治療成分を持つ多くのハーブや植物が研究されています。 心臓病を含む様々な疾患の治療に漢方薬が使用されてきた歴史は長く、広範囲に及んでいる。
中国では、副作用の少ない漢方薬がCHDのCAM療法として高い関心を集めています。 漢方薬の心桂枝湯（XKS）錠剤は、中医学の経絡理論に基づいて処方された複合処方で、2005年に中国国家食品薬品監督管理局から狭心症や不整脈患者の治療薬として承認されています。 ここでは、さらに動脈硬化のウサギにXKS錠を投与し、その治療メカニズムを検討した。 血漿中リポ蛋白濃度、心電図検査（心筋虚血の重症度の指標）、内皮依存性血管弛緩（EDVR）、組織形態学的研究、内皮機能マーカーである冠動脈上の内皮一酸化酵素（eNOS）および血管細胞接着分子1（VCAM-1）の発現。 材料および方法
2.1. 薬物と試薬
XKS tablets were from Wo Hua Pharmaceutical Co, CHN. コレステロールはTian Qi Chemical Engineering Co, CHNから得たものである。 アトルバスタチンはJia Lin Pharmaceutical Co, CHNから入手した。 バソプレシン（VP）、フェニレフリン（PE）、アセチルコリン（Ach）は、Sigma, USAから得たものである。 ポリクローナル免疫組織化学ヤギ抗ウサギeNOSおよびVCAM-1抗体は、Santa Cruz, USAから得た。 Streptavidin/peroxidase kitとbiotinylated mouse anti-goat IgGはBoster, Chinaからであった。 動物および実験デザイン
日本大耳ウサギ( kg、3週齢、雄)は中国医学科学院実験動物研究所から購入した。 12時間明暗サイクル、温度(℃)・湿度()制御された病原体のない環境下で、水を自由に飲めるように単飼育した。 すべての動物飼育および実験プロトコルは、中国衛生部の動物管理規則に準拠し、本研究は中国医学科学院動物倫理委員会の承認を受けた。 ウサギ用標準飼料ペレットおよびコレステロール2％含有高コレステロールエステル（H-ChE）飼料ペレット（240-280 g/d）は北京科学動物飼料有限公司で調製した。
ウサギを4群に分け(1群あたり)、実験デザインを図1に示した。 H-ChE、2％コレステロールエステル；XKS、シンケシュウ；VP、バソプレシン；ECG、心電図；EDVR、内皮依存性血管緩和；eNOS、内皮一酸化窒素合成酵素；VCAM-1、血管細胞接着分子1＜422＞＜1823＞＜9469＞対照＜422＞ウサギは標準ペレットで12週間継続的に給餌された。 ウサギには通常生理食塩水を胃内投与した（10 mL/kg/d）。
Model
ウサギにはH-ChE飼料ペレットを継続摂取させた。 2216＞＜9469＞XKS＜422＞ウサギに184.8 mg/kg/d（平均体重60 kgの成体の等量）のXKSを生理食塩水（10 mL/kg/d）で消化管内投与した． その他は「モデル」と同様とした。
アトルバスタチン
ウサギにアトルバスタチン5.0 mg/kg/dを通常食塩水（10 mL/kg/d）で経口投与した。 その他はModelと同様であった。 血漿リポ蛋白分析
12週間の実験前後にヘパリンで絶食静脈血を末梢静脈から採取した。 血漿を分離し、-20℃で保存した。 血漿中の総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、LDL、HDLなどのリポタンパク質濃度は、自動生化学分析装置（Dimension AR、DuPont、USA）を用いて測定した
2.4. VP誘発心筋虚血モデルの心電図試験
12週間の実験期間終了後、Serradeil-Le Galらの方法に従い、VPによる冠血管性心筋虚血の実験的誘発を行った。 心電図の標準辺縁IIリードは、Powerlab 30システム（AD Instruments, Castle Hill, Australia）を用いてVP（2.0 IU/kg、iv.）投与前と投与25分後に連続記録した＜2216＞＜3309＞2.5. EDVRの評価＜2988＞＜9469＞心電図検査終了から1週間後、ウサギ（1群あたり）を10％抱水クロラール（25mg／kg、ip）により麻酔した。 Leeらの方法に従い、直ちに新鮮な心臓を採取し、冷PBSに保存した。 次に、腹部大動脈を解剖し、3 mmの輪切りにした。 リングを1.5 gの張力に伸ばし、Krebs-Henseleit溶液（mMの組成：115 NaCl, 25 NaHCO3, 1.38 NaH2PO4, 2.51 KCl, 2.46 MgSO4, 1.91 CaCl2, 5.56 dextrose）の入った10 mL組織浴（38.6℃）で60分間平衡させ、95% O2 と5 % CO2で換気した。 力発生は，Powerlab 30システムに接続した等尺性変換器を用いてモニターした． 平衡化後、10-6 M PEで血管収縮を誘導した。 最大収縮がプラトーに達した後、EDVRは10-9から10-4M Achへの反応として決定された。 弛緩率は、PEによる最大前収縮値に対する張力の変化に基づいて計算した。 組織形態学的研究
他のウサギ（各群）は10％抱水クロラール（25mg／kg、ip）により麻酔された。 大動脈カテーテルを用いて、左総頸動脈からヘパリン化生理食塩水（70 mL/kg）と4%パラホルムアルデヒド（140 mL/kg）を0.1Mリン酸緩衝液で灌流固定（約100 mmHg）し、外頸静脈は残血除去のために切断した。 2時間後、4.0℃で心臓と大動脈を取り出し、10%緩衝ホルマリンで一晩固定した。
大動脈を後面に沿って縦に開き、動脈硬化斑を可視化するためにスーダンIVで染色した。 染色後、大動脈をピンセットで開いて平らにし、写真撮影を行った。 大動脈の総面積（）とプラーク面積（）をImage-Pro Plus 7.0 morphometric analysis system (Media Cybernetics, USA) を用いて形態学的に解析した． 動脈硬化性プラークの比率は，.
左回旋冠動脈（長さ2cm）を隣接する心筋組織とともに注意深く切断し，動脈硬化性プラークの面積を算出した． 標本はパラフィンに包埋し，ミクロトームで5μmの切片に切断し，断面をヘマトキシリン・エオジン染色し，ナノズーマーデジタル病理画像解析システム（Hamamatus，Olympus，JAP）を用いてスキャンを行った． Image-Pro Plus 7.0解析システムを用いて200倍の倍率で内腔面積（）と内弾性層面積（）を形態学的に解析し，内腔面積と内弾性層面積を算出した． 冠動脈狭窄比は、.
2.7 と算出した。 冠動脈におけるeNOSおよびVCAM-1の免疫組織化学的研究
eNOSおよびVCAM-1の発現は、製造者の指示に従ってストレプトアビジン/ペルオキシダーゼキットを使用して冠動脈の免疫組織化学的評価を行った。 切片は脱パラフィン後，再水和し，抗原賦活用緩衝液（0.01M Tris-base, 1.0M EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.0）に95℃で3分間浸漬させた． 3%過酸化水素水溶液中で切片を室温で1時間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。 切片をPBSで3回洗浄し，100 μL goat anti-rabbit eNOS or VCAM-1抗体とインキュベートした． 切片をPBSでリンスし、100μLのビオチン化マウス抗ヤギIgG（PBSで1：100希釈）とインキュベートした。 タンパク質はジアミノベンジジン基質溶液で可視化した。 陰性コントロールでは、一次抗体は PBS で置換した。 eNOSまたはVCAM-1染色面積（）と観察面積（）は、Image-Pro Plus 7.0解析システムを用いて400倍の倍率で形態学的に解析した。 eNOSまたはVCAM-1の総存在量は、.
2.8 として半定量的に算出した。 統計解析
統計解析にはSPSS, v13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)を使用した。 定量的変数は、平均値±SEMとして表される。 複数グループ間の連続変数の比較はANOVAによる分散分析で行い、ポストホック比較はLSD検定で行った。 結果
3.1. 血漿リポ蛋白分析
12週間の実験前、血漿リポ蛋白レベル（TC、TG、LDL、HDL）の基準値は、4群間で有意差はなかった。 12週間の実験後、モデル群ではControl群に比べ、TC（）、LDL（）、TG（）の値が有意に上昇し、HDL（）の値が有意に減少した。 アトルバスタチン12週間投与により、Model群に比べTC（）、LDL（）、TG（）値は有意に減少し、HDL（）値は有意に増加した。 しかし、XKS投与では、Modelと比較して、TC、TG、LDLレベルがわずかに減少（）し、HDLレベルがわずかに増加（）した（表1）。
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| データは平均±SEM、 、a aa対コントロール； bb対モデル； cc対XKSとして表現されています。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. VP誘発心筋虚血モデルの心電図試験
VPを意識下ウサギに静脈注射すると、各群で心電図に一過性のST上昇を誘発した。 対照群では投与後5-10分で最大のST上昇を認めた。 モデル群ではControlに比べ有意に高い（）ST上昇を示した。 XKS投与はModel群に比べ有意な（）抗虚血作用（VPによるST上昇の抑制）を示した。 アトルバスタチンも有意な抗虚血効果を示したが、XKSはアトルバスタチンより有効であった（表2および図2）。
表2
バソプレシン投与後の心電図におけるSTセグメント上昇（mV）。
図2
バソプレシン投与後の心電図の最大STセグメント上昇量 VP投与後に各群で一過性の心拍数（HR）低下が発生した。 Controlでは10-15分後に効果がピークとなった。 モデル群ではControlと比較してより明らかなHR低下()が認められた。 XKSはModelと比較して有意にHR低下を抑制した（）。 しかし、アトルバスタチン投与では、Modelと比較して有意な抑制効果（）は認められなかった（図3）。 EDVRの評価 Ach (10-9 to 10-4 M)は前拘束した腹部大動脈輪に濃度依存的な弛緩を引き起こした． モデル群ではControl群に比べ，最大EDVRが有意に低下した（）． XKSおよびアトルバスタチン投与により，モデル群に比べ有意に（ ）に障害が軽減された． また、AtorvastatinはXKSよりも効果的（）であった（図4）。 
図4
腹部大動脈輪の内皮依存性血管弛緩曲線 3.4. 組織形態学的研究Control群ウサギのいずれも大動脈に異常な組織学的変化を認めなかった。 モデルウサギでは、大動脈の内膜表面に典型的なマクロな動脈硬化性プラークが明瞭かつ普通に観察される。 スダンIV染色により動脈硬化斑は赤色を呈した。 XKSとアトルバスタチン投与により、モデルウサギと比較して動脈硬化プラーク面積が有意に減少した。 その効果は2つのグループ間で同様であった（図5）。  (a)  (b) (a) (b) 図5
スダンIV染色による大動脈内膜表面の動脈硬化性プラーク。 Control群ではいずれの動脈壁にも動脈硬化性の変化は認められなかった。 しかし、モデルウサギでは、心筋内小動脈の一部に、平滑筋細胞周囲の基底膜が不規則に肥厚し、多層化しているなどの著しい動脈硬化性変化を認めた。 中膜にはコラーゲン線維が著しく増加し、肥厚した内膜には多数の脂質が浸潤していた。 冠動脈内腔は狭窄し、泡沫細胞を含む脂質の沈着が見られた。 モデル群ではControl群に比べ有意に（ ）な冠動脈狭窄が認められた。 XKSとアトルバスタチン投与により、モデル群に比べ有意に冠動脈狭窄が抑制された（）。 その効果は両群間で同様（）であった（図6）。  図6
HE染色による冠動脈狭窄（明顕微鏡写真、中央100×、左上400×） 3． 冠動脈のeNOSとVCAM-1の免疫組織化学的研究Control群では、冠動脈内膜領域の細胞質にeNOS陽性染色が観察された。 モデル群ではControl群に比べeNOSの存在が有意に減少（）していた。 XKSとアトルバスタチンの投与は、モデル群に比べ、eNOSの存在を有意に増加させた（）。 また、AtorvastatinはXKSよりも有効であった（図7）。 
図7
免疫組織化学染色による冠動脈のeNOSとVCAM-1の残存（明視野、400倍）。 漢方薬を含むCAMは、過去20年間で世界的に人気を博している。 心血管疾患を含む慢性疾患を持つ患者はCAMを使用する可能性が高いと主張されている。 漢方薬は、薬用植物やハーブを病気の予防や治療に用いる方法で、各国の伝統的な大衆薬から、標準化され滴定されたハーブエキスの使用まで、幅広く用いられている。 臨床研究では、XKSは心拍変動の改善、狭心症のエピソードの減少、動脈の弾力性の改善など、多くの生物学的活性を持っていることが明らかになった。 一方、薬理学的な基礎研究により、XKSの投与は心筋の酸素消費量の減少、脂質の低下、抗アポトーシスなど様々な治療効果を持つことが明らかになった。 本研究では、陽性対照療法としてアトルバスタチンを選択した。 その結果、アトルバスタチン12週間投与は血漿中TC、LDL値の低下、HDL値の上昇、実験的心筋虚血の軽減、EDVRの回復、動脈硬化の進展抑制に非常に有効であることがわかった。 XKSの12週間投与は、アトルバスタチンと同様にEDVRの改善とアテローム性動脈硬化の進展抑制に効果があった。 また、心筋虚血の予防と心拍の維持に関しては、アトルバスタチンよりもXKSの方が効果的であった。 これらの特性は、XKSの狭心症や不整脈治療における主要なメカニズムであったのかもしれない。 一方、本研究で得られた重要な知見の1つは、XKSを投与したウサギの脂質プロファイルに有意な変化が生じなかったことである。 つまり、XKSはH-ChE食によって引き起こされた高コレステロール血症に対して、リポタンパク質の低下作用を示さなかった。 内皮傷害が動脈硬化の発症における重要なイベントであることはよく知られている。 高コレステロール血症で起こるような単純な内皮の機能不全から動脈硬化が誘導されることもある。 内皮細胞の恒常性は、eNOSによって合成される強力な血管拡張物質である一酸化窒素（NO）の合成によって主に維持されている。 eNOSは、低酸素、シアストレス、LDL、動脈硬化の発症と進行など、様々な刺激によって影響を受けますが、その中でも特に、血管の緊張と局所血流の調節、血管平滑筋細胞の増殖の抑制に重要な役割を担っています。 eNOSの発現低下や不活性化は、内皮機能障害の発症に重要な因子であると認識されています。 動脈硬化における血管接着分子の重要な役割が発見され、これらの分子は動脈硬化の開始の最初のステップである循環白血球の内皮への接着に重要な役割を担っている . VCAM-1は膜貫通型糖タンパク質であり、動脈硬化が進行した病変では持続的に発現し、肉眼的な疾患が現れる前から動脈硬化の起こりやすい部位で発現が上昇している。 アテローム性食事は、大動脈器官培養において大動脈内皮のVCAM-1の発現を急速に誘導することができた。 XKSには、Salvia miltiorrhiza Bunge, Panax notoginseng (PN), Fructus Crataegi, Radix Puerariae, Radix Aucklandiaeという5つの生薬成分が含まれている（表3）。 原料はマイクロナイザーで微粉末にし、中国薬局方2010のマーカー化合物に基づいて認証・標準化された錠剤を調製した。 例えば、PNエキスは肺線維症の抑制、サンザシエキスは血漿コレステロールの低下、プエラリンエキスはインスリン抵抗性の改善、オウゴンエキスは特発性浮腫の抑制など、それぞれの単一成分から特別な生物活性を持ついくつかのモノマー群が抽出された。 中医学の理論では、XKSの成分のうち、サルビア・ミルティオリザ・ブンジを「主薬」、田七人参を「副薬」とし、他の3成分を「補助薬」として位置づけている。 タンシノンIIAはサルビアミルティオリザ文芸エキスの最も重要なモノマー成分の1つであった。 タンシノンIIAの生物学的活性は、心筋酸素消費量の減少、冠動脈の拡張、神経細胞の再生改善、抗高血圧、抗酸化に関するものであった。
Table 3
Xinkeshu tabletの処方について。
今回の研究では、XKSを一つの「薬」としてとらえ、すべての成分を合わせて薬理作用を検討しました。 本研究の結果は、XKSの治療作用に関するさらなる研究の契機となったが、これらの成分の関係や相互作用については、まだ明らかにされていない。 そのため、本研究の限界でもあった。 したがって，XKSの詳細な分子機構や有効成分および代謝物の薬理作用について，動物を用いた更なる研究が必要である． 結論＞＜9469＞結論として、中医薬XKSは動脈硬化性心筋虚血ウサギモデルに対して強力な抗動脈硬化および抗虚血特性を発揮することが明確に示された。 そのメカニズムには、抗高脂血症作用のほかに、内皮保護作用が関与している可能性がある。 XKSが内皮を保護するメカニズムや有効成分の相互作用をより深く理解することで、CHD患者への新たな薬理的CAM介入につながると考えた。 謝辞この研究は、中国主要国家基礎研究発展計画（G2000056905）、国家自然科学基金（第81073021号）および教育部科学財団（108019）によって支援されました。 Xu TaoとPeng Jing-boはこの研究に等しく貢献した。 |
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