A lateral flow strip based on gold nanoparticles to detect 6-monoacetylmorphine in oral fluid

Introduction

Opioid abuse is dramatically rise in recent years and is major cause of morbidity and mortality. 国連薬物犯罪事務所が発表した世界薬物報告2017によると，アヘンや処方オピオイドの使用は大麻ほど普及していないかもしれないが，オピオイドは依然として潜在的な害と健康被害をもたらす主要な薬物である 。 したがって、オピオイドの容易かつ迅速な検出は急務です。

Illicit heroin abuse is one of the most common forms of opioid addiction（違法ヘロインの乱用は、オピオイド中毒の最も一般的な形態の1つです）。 ヘロイン（ジアセチルモルヒネ、ジアモルフィン、Diagesil®）は半合成のモルヒネ誘導体で、強力なオピオイド鎮痛剤です。 ヘロインの代謝を図1に示す。 ヘロインは速やかに6-モノアセチルモルフィン（6-MAM）に加水分解され、最終的にモルヒネに変換されます。 ヘロインは投与後速やかに加水分解されるため、通常、その代謝物が使用の確認に用いられます。 さらに、6-MAMはモルヒネに対する最近のヘロイン乱用の唯一の特異的な指標であり、研究コミュニティから大きな関心を集めている。 ヘロインの加水分解とin vivo代謝。 ヘロイン、6-MAM、モルヒネの構造を示す。

6-MAM を検出するいくつかの方法が記載されており、これらは以下のカテゴリーに分けることができる。 (1)ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分析、(2)ラーメン分光法、赤外分光法、化学発光法などの分光分析、(3)キャピラリー電気泳動、(4)免疫測定（抗原・抗体）法、に分けられる。 複雑な機器構成は、高度な機器と専門的なオペレーターを必要とするため、基礎的な薬物スクリーニングに多大なプレッシャーを与えている。 検査室は閉鎖されていたり、遠方にあったりする。 警察署でさえ、この複雑で高価な機器を置くことはできない。 しかし、警察官は、ヘロインが含まれているかどうかを即座に判断しなければならず、迅速に対応する必要がある。 このように、生体試料中の違法薬物を特異的かつ信頼性が高く、簡便に検出する方法の開発が急がれている。

迅速な検出方法のうち、コロイド状金ナノ粒子（AuNP）を用いたラテラルフローストリップ（LFS）は、AuNPのサイズ依存性および距離依存性の光学特性により迅速スクリーニングに広く採用されているが、その最初の報告はMirkin and co-workers によるものだった。 半定量的ラテラルフローアッセイの原理は、数分で抗原と抗体の組み合わせからAuNPsの赤色を肉眼で確認することができることです . ヘロイン乱用検出のための様々な市販のテストキットは、NovaBios社やWondfo社のものを含めて入手可能である。 しかし、ほとんどのヘロインスクリーニングキットは、6-MAMとモルヒネの識別が困難であるため、モルヒネのみを測定し、6-MAMは測定していない。 モルヒネは他の薬物から代謝された可能性もあるし、処方された可能性もある。 6-MAMはヘロインと一意に追跡可能です。

サンプルは、血液、血漿、尿、毛髪、口腔液、さらに呼気、汗、母乳、歯などです。 不正ヘロイン検査に最もよく使用されるサンプルは、血液、尿、および口腔液です。 これらのうち、血液検査は最も正確で信頼性が高いが、侵襲的でもある。 尿検査は最も簡便で、乱用薬物のスクリーニングに広く使用されている。 口腔液は、人前で簡単に採取できるため、ポイントオブケア検査で使用されることが多くなっています。 しかし、口腔液は非常に粘性が高く、標的物質の濃度が低いため、ほとんどの検査では6-MAM検査に尿を使用しています。 そのため、尿を用いる検査が主流である。すべての口腔液検査の開発において、検体の採取と感度の向上は同じ問題に直面することになる。 以前の研究で、6-MAMは口腔液から頻繁に検出されることが示された。 LFSの口腔液6-MAMの検出基準は4 ng ml-1 である． ここでは，口腔液試料中のヘロインのラテラルフローテストを開発した。

我々は，6-MAMを比色シグナルにより迅速かつ高感度に検出するラテラルフローアッセイにおける抗体ラベルとしてのAuNPsについて検討した。 まず、6-MAMを合成し、ウシ血清アルブミン（BSA）と結合させ、Tライン上にコーティングできるようにした。 さらに，口腔液試料を扱う難しさを克服するために，ニトロセルロース（NC）膜の種類，試料パッドの溶液処方，スポンジ吸着剤パッドの選択を行い，口腔液LFSに最適な条件を探索した。 最後に，6-MAM LFSを検証し，優れた感度と特異性を有することを示した． 材料

6-MAMに対する抗体はBioventure社（上海）から提供された。 BSAとポリビニルピロリドン(PVP)はシグマ社(スペイン、バルセロナ)から購入した。 Triton X-100、Tetronic 1307（S9）、Ohodasurf On-870（S17）およびSTANDAPOL ES-1（S7）はBASF（Germany）から購入した。 蒸留水（抵抗率18.2MΩcm-1）は、RephiLe PURIST UV Ultrapure water system（中国）により作製した。 Reel分散システムは、Doyesgo社製（中国）を使用した。 Vion IMS Q-Tof質量分析計はWaters（米国）製であった。 6-MAM やモルヒネなどの標準物質はすべて国家食品薬品監督管理局（中国）より入手した． 顕微鏡は Motic AE2000 (Xiamen, China) 製であった． ここに明記されていない他のすべての化学的および免疫学的試薬は、分析/試薬グレードの標準的な市販品であった

2.2. lateral flow stripの構成要素

LFSは、プラスチック裏打ち、スポンジ吸着剤ストリップ（スポンジパッド）、サンプルパッド、共役パッド、NC膜、吸収パッドから構成されている。 スポンジ吸着片は、口腔液採取用に特別に設計されており、口腔液を素早くサンプルパッドに運ぶことができる。 サンプルパッドには、バッファーシステムといくつかの界面活性剤が含まれています。 抗体-AuNPコンジュゲートはコンジュゲートパッドに噴霧され、サンプルと反応してパッドから放出され、T線に6-MAM-BSA、C線にヤギ抗ラビット抗体をコートしたNC膜に入る。 吸収パッドはストリップの端にある濾紙で、毛細管現象を維持する。 LFSは、口腔内に入れるか、口腔液採取用カップに挿入するだけで使用できます。 図2にLFSの概略図を示します。 図3は、6-MAM検出用LFSの模式図である（

2.3. 6-モノアセチルモルフィン-ウシ血清アルブミン結合体の合成

6-MAMは、以前の研究成果で述べたように調製された。 簡単に説明すると、まずモルヒネをヘロインのアルカリ加水分解で製造した。 次に、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル基を6-MAM分子に付加し、キャリアタンパク質に結合させた（図4）。 活性化された6-MAMはWaters® Vion IMS Q-Tof質量分析計で保証されました。 次に、いくつかの変更を加えて、記述したように合成を行った (図5)。 まず、80 mgのBSAを6 mlの50 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH = 7.5) に入れ、0℃まで冷却した。 次に、1mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF）中の20mgの活性化6-MAMを、0℃で滴下して加えた。 混合物を室温に温め、一晩攪拌した。 得られた6-MAM-BSA結合体を、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH＝7.5）に対して、6回の緩衝液交換（4℃でそれぞれ少なくとも6時間）により透析した

2.4. 金ナノ粒子-抗体コンジュゲートの調製

20nmのAuNPsはクエン酸還元法を介して調製された 。 ここで、2mlの1% HAuCl4溶液を100mlの沸騰水中に激しく攪拌しながら加え、すぐに2mlの1%クエン酸ナトリウム溶液を加えた。 溶液が赤くなったら、さらに15分間沸騰させた。 6706>

0.1 M K2CO3によってAuNPs溶液のpH値を9.0に調整した後、6-MAM抗体30μgをAuNPs溶液10mlに加え、30分インキュベートした。 その後、20μlの100.0 g l-1 BSAを15分間添加し、反応部位をブロックした。 この溶液を3740gで15分間遠心分離し、上清を12 100gでさらに30分間再遠心分離した。 すべての金沈殿を混合し，紫外可視分光法で最大吸光度を特定するために測定した。 その後、さらなる使用のために4℃で保存した。

同じ方法で、AuNPsとウサギIgG抗体とのコンジュゲーションも行った。 コンジュゲートパッドを作る際、抗体コンジュゲートを緩衝液（10.0 g l-1 BSA、0.4% Triton X-100、5% トレハロース、10% ショ糖、pH 8.2 を含む 0.05 M Tris-HCl ）で吸光度5まで希釈した。 最後に、500μlの混合AuNPs-抗体結合体を20mm2のファイバーグラスに噴霧し、37℃で一晩乾燥した

2.5. コーティングされたニトロセルロース膜の調製

ラテラルフローテストストリップを作るために、テストライン（Tライン）として6-MAM-BSA抗原（0.6 mg ml-1）をNC膜に分注した。 コントロールライン(Cライン)にはヤギ抗ウサギポリクローナル抗体(0.15 mg ml-1)を塗布した。 コーティングされたNC膜は37℃で一晩乾燥させた。 4社からの9つの市販NC膜を評価した。 ミリポア（HF90、HF135、HF180）、GE-ワットマン（FF120HP、AE100）、サルトリウス（CN95、CN150）、ポール（Vivid90、Vivid170）

2.6. 感度と特異度

ストリップは競合アッセイで、両ポジションとも6-MAMストリップを持っていました。 サンプルに6-MAMが含まれると、コンジュゲートパッド上のナノゴールド標識抗体に結合する。 余分な抗体は毛細管現象によりクロマトグラフィー方向に進み続け、Tライン上の6-MAM抗原に結合する。 Tラインのシグナル強度は、サンプル中の6-MAM濃度に直接関連します。 6706>

6名から採取した陰性の口腔液に6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0.4, 0.1 ng ml-1) をスパイクし、感度検出を行った。 LFSの特異性を検証するために，一般的に乱用される10種類の薬物を使用した。 これらの薬物は，モルヒネ（MOP，100 µg ml-1），コデイン（COD，100 µg ml-1），テトラヒドロカンナビノール（THC，10 µg ml-1），メチレン ジオキシメタンフェタミン（MDMA，100 µg ml-1），ケタミン（KET． 100μg ml-1）、メチルアンフェタミン（MET、100μg ml-1）、コカイン（COC、100μg ml-1）、メタドン（MTD、100μg ml-1）、エフェドリン（EPH、100μg ml-1 ）、プソイドエフェドリン（PEPH、100μg ml-1 ）である。

Results and discussion

3.1. 6-monoacetylmorphine-bovine血清アルブミンコンジュゲートの合成

NC膜は通常、抗体を結合させる前にまずキャリアタンパク質でコーティングされます。 リンカーは構造特異性を維持するために使用される。 ここでは、まず6-MAM分子にNHSエステル基を付加し、キャリアタンパク質のリンカーとした。 これをWaters® Vion IMS Q-Tof質量分析計で検証しました。 活性化した 6-MAM の超高速液体クロマトグラフィー (UPLC) のクロマトグラムで、8.8 分に 706.27645 の m/z (予測 m/z の 706.2758 に対して、図 6) の幅広いピークを確認しました。 これは、リンカーが6-MAMにうまく結合したことを示している。 構造が正しく確立されているだけに、精密合成の意義は自明であり、6-MAM抗体とのペアリングにつながる可能性がある。

生成物が可溶性であり、以前のコンジュゲーションプロトコルが複雑すぎたため、ジメチルスルホキシドの勾配透析は使用しませんでした。 BSAは、さまざまな類似体により、UPLCクロマトグラムにいくつかのピークがありました（データは示されていません）。 このため、コンジュゲーション比に幅があった。 したがって、UPLCクロマトグラムには、異なるコンジュゲーション比に対応するさまざまなピークが存在した。 コンジュゲーション比よりも抗原抗体対の方が、より効果的にコンジュゲーション結果を確認することができました。 ニトロセルロース膜の種類選択

NC 膜は、硝酸エステルの強い双極子とタンパク質のペプチド結合の強い双極子との相互作用により静電的にタンパク質を結合させる。 LFSの最終的な性能に影響を与える可能性のある、キャピラリー流速、シグナル強度、バックグラウンドなどの特性を評価した。 さらに、流速はタンパク質の吸着量、さらには感度に影響を与えるため、より注目されるようになった。 膜の流速は，孔径，孔径分布，空隙率といった多孔質構造の集合的な特性に依存する。 細孔径が大きいとタンパク質の吸着力は弱くなる。

9種類のNC膜を比較した（表1）。 各試験は3回繰り返し、その平均値を記録した。 LFSの結果は3分間で測定し、サンプル流量は20 s cm-1以下が最適であった。 また，T線での信号強度は正常値が必要であった． 背景色が濃いと精度が落ちる。 6706>

3.3. サンプルパッド

サンプルパッドを処理する溶液は、口腔液サンプルがパッドに水分を補給する際の反応緩衝系として機能するため、試験にとって非常に重要である。 この溶液には、通常、適切なイオン強度とpH値を持つ緩衝系が含まれ、一部のブロッキング材や界面活性剤は、膜上での口腔液の流速を速めることができる。 サンプルパッドは、口腔液の複雑なマトリックス効果に対応し、NC膜と適合させる。 さらに、バッファシステムは分析物の放出を保証し、口腔液の粘性が高いため流速を安定化させる。

4種類の処方を検討した。 溶液の処方は表2に示すとおりである。 その結果、界面活性剤STANDAPOL ES-1（S7）を用いた緩衝系4が、試料流速17 s cm-1で、シグナル強度は正常、バックグラウンドは白色で、最高の性能を発揮することがわかった。 界面活性剤S7は強い陰イオン界面活性剤で、S17やS9よりも強い洗浄力を発揮する。

3.4. 口腔液の採取

口腔液は粘度が高いため、尿よりも採取が困難である。 口腔液採取器具には、綿棒、スポンジ、プラスチックチューブ、コップなど多くの種類がある。 また、酢や洗口液、トローチなどで口腔液を刺激する方法もある。 しかし，このような刺激は，口腔液中の分析物濃度を変化させる可能性があり，より複雑で時間のかかる方法である． そこで最終的には，適度な細孔径を持つ高分子繊維をブレンドしたスポンジ吸着剤（ESSENTRA, UK）により口腔内の液体を直接採取することにした

2種類のスポンジ吸着剤（K1，K2）をカスタム設計し，両者の構造を図7に示す． K2はK1に対してかなり緩く、規則的であった。 両者とも、スポンジパッドに水を落とす、最終的なLFSを陰性のリン酸カリウム緩衝液（pH=7.0）に入れる、最終的なLFSを口に入れるなどの液処理性能をテストすることで評価した。 K2スポンジは，水，PBS緩衝液，実際の口腔液に対して，K1スポンジの2倍の試料流速（平均20s cm-1）を示した． これは、口腔液の試験において非常に重要な問題である。 結論として、口腔液サンプルを扱う上で際立った性能を持つK2が選ばれた。

3.5。 感度と特異度

低分子は通常LFSの競合アッセイで検出される。 ここでは、T線にシグナルがない（赤線）。 これは、サンプル中の6-MAMの濃度がカットオフ値以上であることを表しています。 口腔液中の薬物代謝物の濃度は低いため，口腔液検査の感度は尿検査よりもはるかに高くなるはずである。 ここでは，一般的な口腔液の検出限界の要件を満たす感度4 ng ml-1の6-MAMの定性LFSを作製することに成功した。 その結果を図8に示す。 また，図9に一般的に乱用される薬物に対する特異性を示す． 6-MAM LFSは6-MAMに特異的であり，特にモルヒネやコデインとは交差反応を示さなかった

以上の利点から、口腔液サンプル用の6-MAM LFSは研究用と産業用の両方に応用できるだろう。 警察の事前スクリーニングにおける人員と時間/コストの節約に役立つだろう。 口腔液は便利で侵襲性が低く，交通検診に適している。 結論として、6-MAMを対象としたヘロイン乱用のための経口液LFSは、薬物運転と戦うための有望な製品である。

Ethics

研究のためのヘロインサンプルの使用は、中国公安部第三研究所の監督を受けた。 6706>

Data accessibility

Data is deposited in the Dryad Digital Repository.全ての著者は倫理基準を遵守していることを宣言している。 https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

著者の貢献

L.Z.はこの研究を構想し、X.H.とJ.Z.は図4と5の実験の実施に協力した。 F.C.とY.Z.は、図6の研究を行った。 J.L.はデータを分析し、論文を執筆した。 6706>

Competing interests

We declare we have no competing interests.

Funding

No funding received for this article.

Disclaimer

ここで表明した意見、発見、結論または勧告は、著者のものです。

脚注

この記事は、依頼、ピアレビュー過程および受理までの編集面も含めて、Royal Society of Chemistryによって編集されたものです。

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