A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: in situ Congo Red染色と免疫組織化学の組み合わせ

Abstract

アミロイドーシスは、様々な、異なるアプローチによる疾患の結果である。 そのため、アミロイド沈着物のサブタイプ分けは、基礎疾患を特定し、最終的に適切な治療を行うために極めて重要である。 分類にはコンゴレッドによる古典的な染色のほかに，免疫組織化学的染色のようなさらなる処置が必要である。 ここでは、日常的な診断に簡単に適用できるCongo red/免疫組織化学的二重染色を用いた、より正確なアプローチを紹介する。 1枚のスライドに2つの染色法を組み合わせるためには、Congo red染色法と免疫組織化学的手法の改良が必要であった。 評価は、従来の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いて行った。 Congo redの染色時間を10秒に短縮し、内因性ペルオキシダーゼの遮断に関する修正を行うことにより、蛍光顕微鏡を用いたCongo red/免疫組織化学二重染色の評価において、正確な結果を得ることができるようになった。 また、切片の厚さは4μmではなく2μmの方が、染色の特異性が高く、評価上優れていた。 1枚のスライドにコンゴレッドと免疫組織化学をin situ二重染色として組み合わせることは、アミロイドーシスの診断において実行可能なアプローチである。 免疫組織化学を評価する際に、蛍光性のCongo red陽性領域に焦点を当てることができるため、偽陽性の結果を示すことを回避することができる。 さらに、従来の顕微鏡で免疫組織化学的に染色された切片のS/N比を向上させます。

© 2016 S. Karger AG, Basel

Introduction

アミロイド症は、多くの異なる組織タイプで見られる、間違って折り重なったタンパク質の堆積の形態的説明である。 アミロイドを形成するタンパク質は、形質細胞新生物や甲状腺髄質癌などの腫瘍から慢性感染症、あるいは加齢の結果として見られるものまで、多くの原因に由来しています。 まれに、遺伝的に受け継がれたタンパク質のミスフォールディング障害に起因するアミロイドーシスもあります。 アミロイドーシスの臨床的重要性は、剖検時の偶発的な発見から生命を脅かす疾患まで多岐にわたります。 病理医が組織標本を検査する際には、アミロイド沈着の可能性を念頭に置くことが重要です。これは、まだ知られていない重大な基礎疾患の最初の手がかりとなるかもしれないからです。 アミロイド沈着そのものを標的とした治療法については有望な結果が得られていますが、アミロイドーシスにおける治療法は、依然として基礎疾患を対象としたものが多く、ほとんどの場合、アミロイドの亜型分類に基づいて決定することができますし、そうしなければなりません。 コンゴレッド染色の感度と特異性を高めるために、コンゴレッドの蛍光特性から、コンゴレッド染色切片を蛍光灯で評価するなどの方法が用いられてきた。

アミロイドのサブタイプ分類のゴールドスタンダードは免疫組織化学であり、いくつかの確立されたプロトコールがある；しかし、特にアミロイド生成軽鎖ラムダに対する抗体の特異性が低いことを考えると、いくつかの欠点がある。 しかし、残念ながら、コストや入手の問題から、この有望な方法は今のところ広く使われておらず、さらに、入手できる組織が少ない場合や、沈着したアミロイドの量が限られている場合には、明らかに限界があることが欠点である。 もう一つの最近の成果は、腹部脂肪吸引の免疫電子顕微鏡によるアミロイド沈着の分類であるが、これは高度な方法である。

いくつかの先行研究では、蛍光と免疫組織化学の組み合わせに焦点を当てている。 ここでは、このようなアプローチの実用性を示す新たな証拠を提示し、ルーチンに簡単に組み込めるプロトコルを報告することで、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織のアミロイド亜型分類に正確に対処することが可能になった。 コンゴレッド/免疫組織化学二重染色は、免疫組織化学を評価する際にコンゴレッド陽性領域に焦点を当てることができ、従来の光学顕微鏡評価において免疫組織化学的に染色された切片の信号対雑音比を高め、手順の特異性と感度の両方を改善するとともに、診断に必要な組織の量を削減することができます。

Materials and Methods

Selection of Cases

新しい技術を確立するために、我々のアーカイブからアミロイドーシスと診断された検体が使用されました。 表1には、それぞれの組織がどのような手順で使用されたかを示しています。

コンゴレッド染色アプローチ

コンゴレッド染色はまず当院の既定のプロトコルに従い行われました。 ホルマリン固定・パラフィン包埋組織を6μm厚の切片に切り出し、脱パラフィン後、コンゴレッドで30分間染色 – 2.5gのコンゴレッド（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）と1gの水酸化カリウム（Merck Millipore）を500mlの80％エタノールに溶かし、その後、切片を水道水で洗い、ヘマトキシリン（Merck Millipore）で4分間カウンターステインした後、切片を染色する。 次のステップで、切片は0.5% HCl/エタノール溶液に分化され、水道水で10分間再度洗浄した後、脱水してマウントする。

免疫組織化学染色と内因性ペルオキシダーゼ阻害

様々なアミロイド亜型の免疫組織化学染色条件は、表2に記載したとおりです。 製造元の提案により、アミロイド原性軽鎖κおよびλの検出には、それぞれ2つの異なるクローンが使用された。 免疫組織化学は、コンゴレッド染色手順の後に行った。 簡単に言えば、脱パラフィンし内因性ペルオキシダーゼでブロックしたスライド（後述）を、正常ウマ血清（AAアミロイド染色用）または正常ヤギ血清（他のすべての染色用）／トリス緩衝生理食塩水（TBS）溶液（900μl血清／60ml TBS）中で室温で30分間インキュベートした（両方の血清はVector Lab.、 Burlingame、 Calif, 米国）、そして一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、リンスし、ビオチン化抗マウスIgG（アミロイドAA染色用）またはビオチン化抗ウサギIgG（他のすべての染色手順用）溶液（300μl IgG／900μl正常馬またはヤギ血清／60ml TBS；両方ともIgGフォーム Vector Lab.を室温で30分間インキュベートし、最後に、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼキット（Vectastain from Vector Lab.）で30分間リンスし、すぐに使える3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC；Dako, Glostrup, Denmark製）を発色剤として（瞬間光学制御下で10〜20分間）、マイヤーのヘマトキシリン（Medite, Dietikon, Switzerland製）により可視化することができた。） 以前の実験では、ジアミノベンジジン可視化よりもAEC可視化の方がS/Nが良かったので、AECが好まれた。 AECは水とアルコールに溶けるので、スライドはカバースリップの前にMedi-Mount（Medite, Burgdorf, Germany製）で30分間覆われた。

コンゴレッド染色終了後に組織の内因性パーオキシダーのブロック（70%エタノールに3%H2O2溶液）処理を通常行うとコンゴリッチが失われるので、この処理は行わないようにした。 内因性ペルオキシダーゼ遮断のための更なる方法として、次のようなものがテストされました。 例えば、コンゴレッド染色の前にこのステップを移動する、70％エタノールを蒸留水に置き換える、などである。

評価

コンゴレッド／免疫組織化学二重染色切片は、主として従来の光学顕微鏡を用いて、それぞれの免疫組織化学クロモゲン産物が、診断ルーチン染色（コンゴレッド予備染色なし）に比べて期待通りに、悪化または改善されて可視化されたかどうかを推定するために、評価された。 その後、ローダミンフィルター付きの蛍光顕微鏡（Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Germany）を使用して、コンゴレッド色素の蛍光を評価した。 特異的な強い蛍光を示した領域をさらに光学顕微鏡で評価し、これらの領域においてアミロイド沈着が免疫組織化学によっても検出され得るかどうかを確認した＜8065＞ ＜8238＞ 結果＜4881＞ ＜8272＞ ステップ1：コンゴレッド染色手順の変更＜9196＞ ＜8757＞コンゴレッド染料の数回の染色時間を試験した。 これは、免疫組織化学にはコンゴレッドと同色の赤色発色剤（AEC）が使用されるため、コンゴレッド染色手順によって抗原に対する抗体の結合能力が低下し、コンゴレッドのフルインテンシティによって併合評価が困難になるために必要なことであった。 本来の染色時間である30分であれば、通常の光学顕微鏡で偏光フィルターを用いてアミロイド沈着物の複屈折を検出することが可能であった。 Congo redの染色時間が5秒、10秒、20秒の場合、蛍光顕微鏡のローダミンフィルターを用いると常に陽性信号が検出され、通常の顕微鏡では偏光フィルターを用いてコンゴフィラメントと複屈折が時々検出されるだけであった（図1）。 さらなる分析のために、コンゴレッド染色時間は、過剰染色を避けるために、好ましくは10秒に短縮された。10秒は、ウェットラボでの実用性の理由（5秒と比較して着実に遵守しやすい）から選択された。 染色時間の短縮により、コンゴレッドの染色強度は明らかに低下しているが、染色時間10秒でもコンゴレッドの蛍光は容易に検出できる（挿入図参照）。

ステップ2：コンゴレッドと免疫組織化学的染色を一つのスライドに組み合わせるための免疫組織化学的プロトコルの修正

第一段階として、この研究に用いた組織の抗原性を確認するために別々の切片で免疫組織化学染色を行い、表2に詳細に示すように確立したルーチンプロトコルで満足な染色結果を示した。

同じ切片にコンゴレッド染色（コンゴレッド染色時間10秒）と免疫組織化学的染色を組み合わせた場合、組織の内因性ペルオキシダーゼ遮断の一般的処理（70%エタノール中の3%H2O2溶液）を用いて免疫組織化学的手順を完了すると、コンゴレッド色素が洗い流されたため、コンゴフィラが消失したことが確認されました。 そこで、第三段階として、内因性ペルオキシダーゼ遮断の処理を変更した。 従来の方法で内因性ペルオキシダーゼ阻害を行ったが、Congo red 染色手順の前に適用し、また、Congo red 染色後に内因性ペルオキシダーゼ阻害を行う場合は、70%エタノールを蒸留水に置き換えることで、Congo red 染色の評価と免疫組織化学的染色の両方で満足な結果を得ることができるようになった。 また、通常のウェットラボのワークフローにできるだけ沿うように、エタノールを蒸留水に置き換える方法をさらに適用した。 内因性ペルオキシダーゼの遮断を省略しようとすると、AEC可視化のためのS/N結果が適度に低下する（遮断されていない内因性酵素がAECを利用し、一方ではわずかに背景染色され、他方では適切な可視化のためのABC-ペルオキシダーゼ複合体の発色が奪われると仮定）ので、それ以上の利用は行わなかった。 コンゴレッドで前染色した後の免疫組織化学的染色の品質は、コンゴレッドで前染色しない免疫組織化学的染色の品質と同じであった。したがって、コンゴレッドで10秒間前染色した切片に免疫組織化学を実施しても、抗原性の喪失や非特異的染色の結果にはつながらないと結論付けられた。

ステップ3：切片厚さの変更

最後に、異なる切片厚さ（2および4μm）の役割について検討した。 一般に、免疫組織化学的染色の特異性と評価性（S/N比）は、薄い切片の方が優れていた。さらに、染色手順の間にスライドから組織が剥離することによるアーチファクトも少なかった。 8065>

Example of Implementation of the Described Approach into Routine Diagnostic Procedures

Figure 2 and 3 is two routine cases in which amyloid subtypization could be achieved using the new algorithm proposed in this study; applying the conventional technique only, no interpretable results were obtained.

Discussion

ここでは、コンゴレッドと免疫組織化学を組み合わせた二重染色法を提示し検証した。これは、免疫組織化学の評価時にコンゴレッド陽性部位に焦点を当て、in situベースのアミロイド亜型分類の特異性を改善するものである。 また、細針コアや生検フォーカスを用いた診断方法の変化により生検材料が限られてきているため、組織を温存することができる。 必要なものは、コンゴレッド染色、アミロイド免疫染色、ローダミンフィルター付き蛍光顕微鏡だけである。 理想的には、蛍光顕微鏡と通常の光学顕微鏡の両方が装備された顕微鏡を使用することで、光源とフィルターを切り替えるだけで、免疫組織化学の評価時にアミロイド沈着の同じ（蛍光）関心領域での検証プロセスを簡略化することができます。 しかし、2つの異なる顕微鏡を使用することも可能であるが、難しい場合には、蛍光顕微鏡と光学顕微鏡でそれぞれの部位の写真を撮ることで、より簡単に評価することができるかもしれない。 さらに、これまでの多くの研究で使用されている4～6μmの切片の厚さに比べ、免疫組織化学に有利な2μmの薄い切片を使用すること（より良いS/N比、剥離アーチファクトが少ない）、蛍光顕微鏡で読み取れば、コンゴレッド染色についても満足できる結果につながることを証明することができる。

最近、アミロイド沈着物の評価に蛍光を使用することを宣伝する論文がいくつかあり、偏光顕微鏡よりも特異性と感度が優れていることを実証しています。 本研究では、染色時間、染色手順、切片の厚さなどプロトコルを工夫することで、この方法を改良・最適化した。 これらの変更により、アミロイド沈着物の高感度かつ特異的な検出と、アミロイド沈着につながる基礎疾患を識別するために重要なこれらの沈着物の亜型分類のためのin situ二重染色を行うことができるようになりました。 この二重染色法は、アミロイドを蛍光で高感度に検出すると同時に、アミロイド沈着物を正確に分類することを可能にします。 この二重染色の確立以来、他の方法では最終的な診断に至らなかったいくつかの症例で、すでにこの方法を使用しています。 図2と図3は、そのうちの2つのケースを示したものです。

しかし、まだまだ完成の域には達していないかもしれない。 内因性ペルオキシダーゼの阻害を必要としないイムノアルカリン-ホスファターゼベースの検出系は、現在我々の免疫組織化学ワークフローでは用いられていないため、イムノペルオキシダーゼベースの検出系を前者に置き換えると、結果がさらに改善しラボワークフローがスリムになる可能性がある。 このアプローチは、特異性、コスト、必要な組織の量に関して有益である。 その要件は最小限であり、広く使用できるはずである。

Acknowledgements

Thomas MenterはNuovo-Soldati Cancer Research Foundation, Vaduz, Liechtensteinから支援を受けている。

倫理に関する声明

この研究ではバーゼルの病理研究所のアーカイブヒト材料のみを含み、北西・中央スイスの倫理委員会によって承認されている (EKNZ 2014-252)。 動物は関与していません。

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著者は利益相反がないことを宣言する

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