Alpha-2 Adrenergic Receptor Agonists Block Stress-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking

Experiment 1: フットショックによるNE放出に対するクロニジン、ロフェキシジン、グアナベンズの効果

被験者

被験者は実験開始時に300-350gの雄のロングエバンスラット（Charles River, Quebec）であった。 実験中、動物は湿度と温度がコントロールされたコロニールームで、逆明暗スケジュール（1730～0530時間点灯）で飼育され、標準的な実験用ラット飼料と水を自由に摂取することができた。 実験手順はCCACガイドラインに従い、コンコルディア大学の動物ケア委員会の承認を得た。

手術

手術前に、ラットはペントバルビタールナトリウム（65 mg/kg、i.p.）で麻酔し、硫酸アトロピン（0.6 mg/ml; 0.2 ml/ラット、SC）および抗生物質（ペンロング、ロガール／STB Inc.、0.1 ml/ラット、i.m）を注射された。 その後の透析プローブ挿入のためにガイドカニューレ（20ゲージ；Plastics One）を植え込んだ；1本はPFCに、1本はAMGに、反対側の半球に設置した。 グアナベンズの効果を調べるために使用した動物には、PFCに向けた1本のガイドカニューレを挿入した。 それぞれのガイドカニューレを埋め込む半球は、治療間でカウンターバランスさせた。 使用した脳定位座標（ブレグマと頭蓋骨表面との関係）は以下の通りである。 AMG, AP -3.0 mm, ML ± 4.5 mm, DV -6.7 mm; PFC, AP + 3.2 mm, ML ± 0.5 mm, DV -1.5 mm (Paxinos and Watson 1997)。 挿入時、透析用プローブのシャフトはガイドカニューレから1mm伸びた。 植え込んだガイドカニューレは、ステンレス製のネジと歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。 ガイドカニューレはねじ込み式オブデュレータで閉じた。 6671>

Microdialysis

Microdialysisは、木製の天井とステンレス棒の床を持つプレキシガラスで作られた4つの六角形の試験室（42×39×33.5cm）で実施された。 各部屋の周囲には暗幕が張られ、照明はオーバーヘッド電球（15W）を用いて逆回転で点灯させた。 透析プローブは、1.8mm（AMG）または3.5mm（PFC）の半透膜（Spectra/Por、外径240μm、カットオフ13000MW）の一端を閉じ、他端を19mm長の26ゲージステンレスチューブに取り付けて構成されている。 40～50cmのPE-20チューブでステンレスシャフトの他端を試験室の上部に設置された注入スイベルに接続し、PE-20チューブを介して可変速注入ポンプに接続した。 プローブの内部には小径の溶融シリカチューブが伸びており、一端はプローブ先端から0.5mmの位置にあり、他端は注入スイベルの35cm下のPEチューブから出た。 PE-20チューブの外側の長さは、スチール製スプリングケーシングで損傷から保護されていた。 プローブは、半透膜の全長がガイドカニューレ先端より下に伸びるように設計された

動物の別々の分隊が、試験した各薬剤の効果を調べるために使用された。 各隊の中で、各動物は無作為に治療条件に割り当てられた。 ビークル注射を受けた動物は各班で実行されたが、統計解析のために1つのグループにまとめられた。 最終的な群サイズ（PFC／AMG）は以下の通りであった：ビヒクル（n＝15／17）、クロニジン20μg／kg（n＝7／6）、クロニジン40μg／kg（n＝9／5）、ロフェキシジン75μg／kg（n＝6／6）、ロフェキシジン150μg／kg（n＝5／6）、グアナベンツ640μg／kg（n＝4、PFC）。 グアナベンズ投与動物を除き、すべての被験者にPFCとAMGの2回の透析を行い、検査間隔は3〜4週間とした。

プローブは微量透析検査開始の前日に挿入した。 閉塞を防ぐため、人工CSF（145 mM Na+, 2.7 mM K+, 1.22 mM Ca2+, 1.0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0.2 mM ascorbate, 2 mM Na2HPO4, pH 7.4 ± 0.1）0.06 μl/minで夜通し灌流させた。 翌朝、透析液のサンプリングと活性のモニタリングを開始した。 透析液流速を0.6μl/minに上げ、ベースライン透析液サンプル（約12μl/サンプル）を20分おきに採取した。 透析液NE濃度の変動幅が±10％以上となる連続3回以上の安定したベースラインが得られるまで、サンプルを採取した。 安定したベースラインNEレベルの確立後、全ての動物に、10分間のフットショックの40分前に、適切な薬物またはビークルのi.p.注射（1ml/kg）を行った。 ショックは、平均40秒（10-70秒の範囲）の間隔で、可変のタイムスケジュールで行われた。 サンプルはさらに120分間収集された（6サンプル）。 サンプルは、電気化学検出器付き高速液体クロマトグラフィーシステム（HPLC-EC）2種のうちの1種を用いて直ちに分析された。 サンプル（10μl）を逆相カラム（15×0.46cm；HAISIL C18，5μm；Sci.Lab）にロードした。 Products & Equipment, Concord, Ontario）に手動注入ポート（Reodyne 7125; 20μlループ）を通してロードし、NE、ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、5-ヒドロキシインドール酢酸（5-HIAA）およびホモバニリック酸（HVA）の還元および酸化電流はデュアルチャネルESAクーロメトリック検出器（Coulochem 5100, model 5021 conditioning cell and a model 5011 analytical cell, Science Products & Equipment）で測定された。 NEの電流は、DOPACおよびHVAの電流とは独立して、クーロケム検出器の別々のチャンネルを使用して測定された。 移動相（酢酸ナトリウム36 mM、SOS 3.1 mM、EDTA 100 μM、5%アセトニトリル、氷酢酸を用いてpH 3.7に調整）はWaters 510 HPLCポンプにより1.4 ml/minの流量でそれぞれの閉鎖系に循環させて使用された。 NE、DOPAC、HVAについて得られたピークをEZChrom Chromatography Data System（サイ・プロダクツ＜6038＞装置）で積算し、定量した。 個々のラットの透析液サンプルは常に同じHPLC-ECシステムで分析し、各システムへの動物の割り当ては、すべての処理群にわたってカウンターバランスさせた。 サンプリング前にチャンバーから餌は取り除かれたが、水飲みチューブは用意された。 実験2：フットショックおよびコカイン誘発性再活性化に対するクロニジンの効果＜7513＞＜7799＞被験者＜9761＞＜6284＞被験者は、実験開始時に体重350-425gの雄のロングエバンスラット（チャールズリバー、ケベック州）25匹であった。

手術

動物は実験1に記載されたように手術のために準備された。 静脈内カテーテル（Dow Corning）を右頸静脈に留置した。 静脈に3cmのシリコンチューブ（内径0.30mm、外径0.64mm）を挿入し、熱収縮チューブで9cmのシリコンチューブ（内径0.51mm、外径0.94mm）に接続し、皮下から頭頂部まで通過させた。 カテーテルは絹糸で静脈に固定し，宝石用ネジと歯科用セメントで頭蓋骨に取り付けたコネクタ（修正22ゲージカニューレ；Plastics One, Roanoke, VA）に出した；カニューレの開口部にはプラスチックキャップをかぶせた． 6671>

実験装置

実験に用いた自己投与チャンバーには、格納式レバー（Med Associates, St Albans, VT）と非収縮式「ダミー」レバーが設置されていた。 両レバーは床から9cmの高さに設置された。 可動レバーの反応により輸液ポンプ（Razel Scientific Instruments, Stamford, CT）を作動させた。 ダミーレバーの反応は記録されたが、ポンプの作動には至らなかった。 薬液は10秒間に65μlの容量で供給された。 薬液注入期間中、アクティブレバーのすぐ上の白色刺激灯が点灯し、この間の追加反応が記録されたが、ポンプの再作動には至らなかった。 各自己投与チャンバーは、スクランブラーを通してグリッドフロアに定電流、間欠的、脱出不能の電気フットショックを与えるように装着した（Grason-Stadler Generator #E1064GS or Med Associates）。 フットショックは、平均40秒（10-70秒の範囲）の間隔で、可変のタイムスケジュールに従って、15分間行われた。 各ショック（0.6 mA）の持続時間は0.5秒であった。 6671>

薬剤

Cocaine HClはBDH Chemicals (Toronto, Canada)から入手し、生理食塩水に溶解させた。 クロニジンHClはシグマ（ミズーリ州セントルイス）から購入し、生理食塩水に溶解し、i.p.（0、20、40μg/kg）注入した。

手順

フェーズ1：トレーニング。 ラットを、1日3時間の自己投与セッションの間、強化の固定比率-1スケジュールでコカインHCl（0.5mg/kg/注入、i.v.）を自己投与するように訓練した。 毎日、半数の動物を消灯から約3時間後の午前中にオペラントチャンバーに連れてきて自己投与セッションを行い、半数の動物を消灯から約7時間後の午後にオペラントチャンバーに連れてきて自己投与セッションを行った。 午前と午後のセッションを担当する動物群は毎日交代で、トレーニング終了時にはすべての動物が両方の時間帯で同数の自己投与セッションを受けたことになる。 Phase 2では、すべての動物が午前中に絶滅セッションを受け、その後、通常午後に行われるテストセッションを受けるため、すべての動物が一日の早い時間と遅い時間に同様の自己投与を経験することが重要であった。 各セッションの開始時、ケージに格納式レバーを導入する前に赤色ハウスライトを10秒間点灯させた。 レバー提示後30秒間はレバーのすぐ上のライトを点灯させた。 家屋灯はセッション中点灯していた。 前述したように、アクティブレバーの反応により輸液ポンプが作動し、10秒間の薬物投与中はレバー上部の照明が点灯した。 薬物投与中にレバーを押した回数も記録されたが、ポンプの再作動には至らなかった。 訓練条件は10日から12日間実施された。 訓練終了後、動物は7日から13日間コロニー室に放置され、邪魔されることはなかった。 その後、絶滅と試験が行われた。 本実験および実験3Bでは、動物群に試験薬物の投与量を変えて実施した。 その後、各群の全動物に生理食塩水、コカイン、フットショックの3つの試験条件を与えた

Phase 2: Extinction and testing(絶滅と試験)． 4日間連続して行われた絶滅と試験の間、動物は自己投与室に1日24時間収容された。 餌および水は、毎日の絶滅および試験セッションの間以外は、動物が自由に利用できるようにした。 動物たちは、絶滅および試験の初日の前日の夕方にチャンバーに運び込まれた。 訓練期には毎日2群のラットを走らせたので、1群の動物をPhase 2の最初の4日間に試験し、もう1群の動物を次の4日間に試験した。 6671>

この実験とその後のすべての復動実験において、動物にはレバーを引く期間を挟んで毎日1時間の復動セッションが数回行われた。 1日目は4回、2～4日目は2～3回、1時間で15回以下の反応というベースラインレベルを確立するのに十分な回数の絶滅セッションを行い、その後180分のテストセッションを行った。 この間の期間は各実験で一定とし、前処理注射から試験開始までの薬物吸収に必要な遅延時間に対応させた。 6671＞＜6284＞試験時、別々の動物群に0、20、40μg/kgのいずれかのクロニジンを前投与し、連日、カウンターバランスの順序で行われた3つの復動性試験（食塩水、コカイン、フットショック）のそれぞれを実施した。 クロニジンはレバーを挿入する40分前に注射した。 生理食塩水とコカインのプライミング試験では、レバー挿入の5分前に生理食塩水またはコカイン（20 mg/kg）を非拘束でi.p.注射した。 フットショック試験では、レバー挿入の直前に15分間の短時間間欠的フットショックストレスを負荷した。 試験時間は3時間であった。 コカインの用量とフットショックのパラメータは、この研究室での過去の研究に基づいて選択した（Erbら、1996；Erbら、1998；Shahamら、1998）。 クロニジンの用量は、我々がヘロインで訓練したラットで行った復調実験に基づいて選択した（Shahamら、2000年）。 スクロースに対する高い反応率に対するロフェキシジンの効果

ロフェキシジンの薬理学的プロファイルはクロニジンのものほど十分に特徴づけられていないため、ロフェキシジンがパフォーマンス障害を誘発するか、またどのような用量で誘発するかを確立するための実験が実施された。 6671>

被験者

被験者は、実験開始時の体重が400-550gの雄のロングエバンスラット（Charles River, Quebec）8匹であった。 ラットは以前、足衝撃によるショ糖探索の再上昇を研究することを目的とした実験に使用した（Buczekら、1999）。 6671＞＜7799＞装置＜9761＞＜6284＞各自己投与室には、床上5cmの片側パネルに対称的に2本の固定レバーが設置されていた。 一方のレバー（「アクティブ」レバー）の反応はポンプ（Razel Sci. Stamford, CT）を作動させた。 もう一方のレバー（「ダミー」レバー）の反応は記録されたが、結果は伴わなかった。 ポンプを作動させると、2つのレバーの間にある液滴受けに0.18 mlのショ糖液が20秒間供給された。 スクロース供給期間中、アクティブレバーのすぐ上にある白い刺激光が点灯し、この間の追加の反応が記録されたが、ポンプの再活性化には至らなかった。

薬剤

ロフェキシジンHClは、英国Britannia Pharmaceuticals Ltd. Keith Daviesから寛大な提供を受けた。 この薬剤を生理食塩水に溶解し、i.p.注射した（0、80、120、160または200μg/kg）。

手順

別の研究（Buczekら1999）において以前にショ糖を自己投与することを学習した動物に、その後連続5日間で5セッション与え、30％ショ糖液を自己投与し、FR-1のスケジュールで投与された。 その後の毎日のセッションにおいて、動物に、自己投与セッションの開始の60分前に、ビヒクル（0μg／kg）またはロフェキシジン（80、120、160または200μg／kg、i.p.）のいずれかを注射した。 すべての動物に全用量のロフェキシジンをカウンターバランスで投与し、最高用量のロフェキシジンを2回試験した。 ロフェキシジンを投与した各セッションでは、薬物のキャリーオーバー効果の可能性を最小にするため、生理食塩水を前処理として投与した。

実験3B:フットショックおよびコカイン誘発性再活性化に対するロフェキシジンの効果

被験者

被験者は、実験開始時の体重350-400gの49匹の雄のロングエバンスラット（34匹：チャールズリバー社、ケベック、15匹：ハーラン・スプラグドーレー、アメリカ）で、実験開始時に、このラットが、コカイン誘発性再帰性覚醒（Reinstatement）に対するロフェキシジン（Lofexidine）の効果について調べた。 動物は実験1に記載したように維持した。 6671>

手順

第1段階：訓練。 動物は実験2に記載された条件下でコカインを自己投与するように訓練された。

第2段階：絶滅とテスト。 この実験では、上述したような間の期間は60分であった。 試験時、動物の別グループを、連続した日に、かつ相殺された順序で与えられた、復元のための3つの試験（生理食塩水、コカイン、および足衝撃ストレス）の各々の前に、0、50、100、150、または200μg／kg、i.p.のいずれかで前処理した（実験2を参照のこと）。 ロフェキシジンはレバー挿入の60分前に注射した。 試験時間は3時間であった。 実験4：フットショックおよびコカインによる再認知に対するグアナベンズの効果

被験者

被験者は、実験開始時に体重350-400gの雄のロングエバンスラット（チャールズリバー、ケベック）18匹であった。 動物は実験1に記載したように維持した。

薬物

グアナベンズはシグマ社（ミズーリ州セントルイス）から購入し、生理食塩水に溶解してi.p. （0、および640μg/kg）注入した。

手順

フェーズ1：トレーニング。 動物は実験2に記載された条件下でコカインを自己投与するように訓練された。

第2段階：絶滅とテスト。 この実験では、上記のような介在期間は60分であった。 試験において、動物は、連続した日に与えられた2つの復動のための試験（フットショックなし、フットショックまたは生理食塩水、コカイン）のそれぞれの前に、0または640μg／kgのグアナベンズでi.p.前処理された（実験2を参照のこと）。 グアナベンズはレバー挿入の60分前に注射した。 テストセッションは3時間であった。 グアナベンズの投与量は、薬物弁別法における40μg/kgクロニジンとの代替性に基づいて選択した (Bennett and Lal 1982)。

統計分析

マイクロダイアリシスデータを、20分透析液サンプル中の細胞外NE濃度について混合因子ANOVAを用いて分析した；被験者間因子はクロニジン（0、20、40μg／kg）、ロフェキシジン（0、75、150μg／kg）又はグアナベンズ（0又は640μg／kg）の用量とした；反復測定は時間としている。 投与量と時間の相互作用が有意な場合は、特定の時点における投与量を要因とする一元配置分散分析に供した。 6671>

復帰試験における2つの従属尺度は、活性レバーでの反応数（注入＋タイムアウト反応）と3時間後の非活性レバーでの反応数であった。 すべての行動データは、平均値±SEMで示した。 6671>

ショ糖試験（実験3A）の従属尺度は、活性レバー（強化＋タイムアウト反応）および不活性レバーでの反応数、および得られた強化回数とした。 被験者内因子として投与量を用いた反復測定ANOVAを実施した。 必要に応じて、ポストホックテスト（フィッシャーのLSD、p < .05）を実施し、ビヒクル（0μg/kg）と薬物条件とを比較した。