AmpR Increases the Virulence of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae by Regulating Initial Step of Capsule Synthesis

Introduction

Classical K. pneumoniae (cKp) とhypervirulent K. pneumoniae (hvKp) は、現在世界的に流行しているK. pneumoniaeの2つのパスタイプである1,2。 北米と欧州では、ほとんどの肺炎球菌感染症はcKp分離株によって引き起こされ、主に医療現場で免疫不全の宿主に感染症を引き起こす日和見病原体であることがほとんどです。 この病原体の最大の特徴は、抗菌薬耐性をもたらす要素をどんどん獲得していくことです。 3,4

台湾からの報告では、健康な人が市中感染で組織侵入性のK. pneumoniaeに感染し、しばしば複数の部位で発症したり、その後、化膿性肝膿瘍などへ拡大するという独特の臨床症候群が報告されています5,6。 hvKpは通常、抗菌薬に感受性ですが、耐性も認められており、hvKpの病原性プラスミドの一部を獲得した広範囲薬剤耐性（XDR）cKp株が、致命的な院内集団感染を引き起こしたことも報告されています12。-15

当初、hvKp分離株の感度と特異性は、ストリングテスト陽性で定義される超ムコ粘性表現型と考えられていた16。しかし、すべてのhvKp分離株が超ムコ粘性と判定されるわけではなく、一部のcKp分離株もこの特徴を有していたため、混乱が生じていた17。 最近、peg-344、iroB、iucA、プラスミドにコードされたrmpAとrmpA2、定量的シデロフォア産生などの複数のバイオマーカーが、hvKp分離株を正確に予測できることが示されている。これらのバイオマーカーは、臨床検査室が患者の最適治療のために用いる診断テストや疫学調査や研究に使用するために開発できると考えられる18。しかし本研究では、ほとんどのhvKp特異的遺伝子を欠く新しい非高粘性CRKP分離株群を同定した。 その結果，AmpRがカプセル合成の開始を制御することにより，これらの菌株の病原性を増大させることが明らかとなった． さらに、本研究でK-locus 47（KL47）株が保有するampRは、KL1超ムコビスカスK. pneumoniaeの毒性を高めることができないことも明らかにした＜7473＞＜8680＞材料と方法＜7714＞＜7465＞臨床分離株とデータ収集＜9250＞＜8307＞非反復性臨床 K. pneumoniae分離株を2018～2019年に広東省と安徽省の5病院検査医学科の日常検出・保管検体から採取した。 すべての分離株は使用前に-80℃で保存した。 患者の臨床情報を入手した。 種の同定および抗菌薬感受性試験は、VITEK-2コンパクトシステム（bioMérieux, Marcy-l’Étoile, France）を用いて実施した。 結果はClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI；文書M100-S26）が発行したガイドラインに従って解釈された19。すべての分離株の同定された菌種は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（bioMérieux, Marcy-l’Étoile, France）により確認された。

Hypermucoviscous Phenotypic Characterization

Hypermucoviscous Phenotypeは，5％羊血を含む寒天平板に接種し，37℃で一晩培養して同定した． 標準的な接種用ループで単一コロニーに触れ、コロニーを上に引っ張ると、5mm以上の粘性のある糸が発生する場合、糸状試験は陽性と判断された2。

Whole Genome Sequencing (WGS)

ゲノムDNA（gDNA）抽出には1 mL培養液（600 nmの光学密度0.6）を用いた（Sangon、上海、中国）。gDNAはIllumina HiSeq 2500 sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA) でペアエンド150 bpリードで配列決定した。 ゲノムアセンブリはde novo SPAdes Genome Assembler (version 3.12.0) を用いて行った20。アセンブリされた配列に対してKaptive (version 0.5.1) を用いてカプセルタイピングを行った21。 多座配列タイピング（MLST）およびコアゲノムMLST（cgMLST）遺伝子型判定はRidom SeqSphere+（version 5.1.0）を用いて行った22．Complex type（CT）はK. pneumoniae cgMLST scheme（www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931) に従って定義した． コアゲノムの一塩基変異（SNV）に基づく系統樹の構築は、Harvest suite（バージョン1.2）を用いて1000ブートストラップテストで行った23。オンラインツールiTOLは、系統樹の表示、操作、注釈付けに使用された24。 Prokka (version 1.13.3) を用いてゲノム配列のアノテーションを行った25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Pan Genome pipeline Roary (version 3.12.0) を用いて、GFF3形式（Prokkaが生成）のアノテーションを入れ、パンゲノムを算出した26。 Scoary (version 1.6.16) を用いて、「https://sanger-pathogens.github.io/Roary/」からファイルを取り出し、形質ファイルを作成し、アクセサリーゲノムの全遺伝子と形質の関連性を計算しました。 Benjamini-Hochberg’s method for multiple comparisons correctionで調整したP値< 0.01の関連強度でソートした遺伝子リストを報告した27

Proteome Analysis

タンパク質抽出には1 mL培養量（600 nmでの光学密度0.6）を使用した。 ライシスバッファー（8M尿素、1%プロテアーゼインヒビターカクテル）中、高強度超音波プロセッサー（Scientz）を用いて氷上で3回超音波処理した。 残った残骸は、12,000 g、4℃、10分間の遠心分離で除去した。 最後に上清を回収し、製造者の指示に従ってBCAキットを用いてタンパク質濃度を測定した。 消化は、タンパク質溶液を5 mM ジチオスレイトールで56℃、30分間還元し、11 mM ヨードアセトアミドで室温、暗黒下で15分間アルキル化した。 その後、尿素を含む100 mM TEABを2M以下の濃度で添加し、タンパク質試料を希釈した。 最後に、一晩の最初の消化のためにトリプシンを1：50のトリプシン対タンパク質の質量比で加え、2回目の4時間の消化のために1：100のトリプシン対タンパク質の質量比で加えた。 トリプシンペプチドは0.1%ギ酸（溶媒A）に溶解し、自家製逆相分析カラム（長さ15cm、内径75μm）に直接ロードした。 グラジエントは、EASY-nLC 1000 UPLCシステムを用いて、400 nL/minの一定流速で、6%から23%の溶媒B (98%アセトニトリル中0.1%ギ酸) まで26分かけて増加、23%から35%の溶媒Bまで8分で増加、3分で80%の溶媒Bまで増加、最後の3分は80%の溶媒Bで保持するように実施しました。 ペプチドをNSIソースにかけた後、UPLCにオンライン接続したQ ExactiveTM Plus (Thermo)でタンデム質量分析 (MS/MS) を行いました。 適用したエレクトロスプレー電圧は2.0 kVでした。 m/z スキャン範囲はフルスキャンで 350 から 1800 で、インタクトなペプチドは Orbitrap で 70,000 の分解能で検出された。 次に、NCE設定28でペプチドをMS/MSに選択し、フラグメントをOrbitrapで17,500の分解能で検出した。 データ依存の手順は、1回のMSスキャンに続いて、15.0秒の動的排除で20回のMS/MSスキャンを交互に繰り返した。 自動ゲインコントロール (AGC) は 5E4 に設定されました。 固定第一質量は100 m/zに設定された。 得られたMS/MSデータは、MaxQuant検索エンジン（v.1.5.2.8）を用いて処理された。 タンパク質ドメインのアノテーションにはInterProScan (version 5.37-76.0)を使用した。 補正p値< 0.05 と fold change > 1.2 を有意とした。

ampR補体変異体の構築

K. pneumonia ampR（補足資料）を合成し、5ʹXbaIと3ʹHindIII制限部位で挟みこんでおくと、ampRの補体変異体が得られた。 この断片を制限消化し、pUC57にクローニングした。 組換えDNAを大腸菌DH5αでアンピシリン選択により回収した。 制限消化後、ampR断片を製造者の指示に従ってpBAD33発現ベクター（Invitrogen）にライゲーションした。pBAD33-ampRを実験室分離大腸菌の標準としてエレクトロポレーションを用いた形質転換に使用した。 ampR相補株はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により確認した（表S1）。 ampRの発現は100μg/mLアラビノースの添加により誘導した。

マウス肺感染モデル

分離株の病原性を調べるために、マウスにおけるK. pneumoniaeの肺炎モデルを使用した。 特定病原体不検出グレードの6〜8週齢の雌性BALB/cマウスを湖南SJA実験動物有限公司から購入した。 ペントバルビタールナトリウム（75 mg/kg）で腹腔内麻酔を行い，直視下で非侵襲的に1.0 × 107 colony-forming units（CFU）のK. pneumoniaeを気管内接種した． 感染後7日間、マウスの生存を観察した。 肺の細菌負荷は，感染マウスの臓器をホモジナイズして1 mLのリン酸緩衝液（PBS）に溶解し，50 μLを液体ブロス（LB）寒天平板に接種してCFUを計数した． 病理組織学的解析のため，肺を10％中性ホルマリンで固定し，パラフィンに包埋してヘマトキシリン・エオジン染色を行い，光学顕微鏡で可視化した． 菌負荷および病理組織学的解析は感染24時間後に行った。

Capsular Polysaccharideの抽出と定量

Zwittergent 3-14 detergentでCapsular Polysaccharideを抽出した。 次に、ウロン酸の量を先に述べた方法に従って測定した28。並行して、細菌培養の連続希釈液をプレーティングしてCFU数を測定し、莢膜多糖の濃度を試料109CFU/mLに対するグルクロン酸量（μg）に従って表した。 各実験は三重で行った。

統計解析

統計解析はGraphPad Prism software version 8 (La Jolla, California) を用いて行った。

結果

分離株の特徴

本研究では非繰り返し性のCRKP (n = 135) 分離株を使用した。 分離株はすべてsequence type 11（ST11）で，K. pneumoniae carbapenemase（KPC-2）を発現しており，1株はOXA-23とKPC-2の両方を有していた（図S1）． 分離株はcgMLSTスキームを用いて16のCTに割り当てられた。 最も一般的なCTはCT1313（n＝35），CT1291（n＝20），CT3176（n＝14），CT1814（n＝13），CT2410（n＝11）であり，その他10株未満で確認されたCTが11株続いた（図1）． すべての分離株は，KL64（n＝86）およびKL47（n＝49）の2つのKL型に分類された（図S2）． また，高粘性菌の分離は認められなかった． また，病原性遺伝子解析の結果，hvKpとcKpの鑑別に必要なすべてのバイオマーカーを有する分離株は過去に報告されていなかった（図1，図S2）18

図1 本検討における135株の系統解析結果． 異なるCT型分離株の枝は色で示した。 各CT型に対応する分離株はCT1291（P1291-1～P1291-20），CT1313（P1313-1～P1313-33，AH1313-1～AH1313-2），CT1689（AH1689-1～AH1689-8），CT1772（AH1772-1～AH1772-4），CT1814（AH1814-1～AH1814-13），CT1819（AH1819），CT2405（P2405-1～P2405-9），であった． CT2410（P2410-1～P2410-11）、CT2418（P2418-1～P2418-4）、CT2444（P2444）、CT2445（P2445-1～P2445-6）、CT3175（AH3175-1～AH3175-2）。 CT3176（AH3176-1～AH3176-14）、CT3178（AH3178-1～AH3178-4）、CT3179（AH3179-1～AH3179-2）、CT3195（AH3195）です。 rmpA，rmpA2，magA iroB，peg-344，iucA は，以前の研究で超強力型 K. pneumoniae と古典型 K. pneumoniae の鑑別に同定されている18．

臨床データ解析

中心静脈カテーテルを除く人口統計、感染タイプ、主な併存疾患、侵襲手術、シャルソン併存疾患指数、Pitt菌血症スコア、全死因院内死亡率はCT間に有意差はなかった（P = 0.035 and P = 0.001, Fisherの正確検定）。 CT3176 に感染した患者の死亡率は，CT1313，CT1291，CT1814 およびその他の CT 群と比較して，それぞれ有意に高かった（78.6% vs 37.1%，P = 0.012；78.6% vs 20.0%，P = 0.001；78.6% vs 7.7%，P = 0.0003；78.6% vs 31.0%，P = 0.004； フィッシャーの正確な検定）． CT1814の中心静脈カテーテルの使用率は、CT1313およびCT1291のそれよりも有意に高かった（84.6% vs 51.4%, P = 0.049; 84.6% vs 35.0%, P = 0.011, Fisherの正確さの検定）（表1）。

表1 人口統計学、併存疾患。 カルバペネム耐性Klebsiella pneumoniae感染症患者の侵襲処置と死亡率

Pan-GWAS Analysis

CT3176の遺伝子基盤を明らかにするために、CT3176グループと非CT3176グループでPan-GWAS分析を実施した。 その結果，CT3176に関連する機能が知られている遺伝子（Benjamini-Hochbergの方法で調整したP < 0.01）39個を同定し（図2），病原性因子，カプセル合成遺伝子，抗菌性遺伝子，多剤排出トランスポーターなどが含まれることがわかった． その中で、ampRはCT3176と最も大きな関連を示した。 しかし，CT3178や一部のCT1689分離株（AH1689-2，AH1689-6）など，他のCTもampR遺伝子を保有していることに注目した（図1）． ampR遺伝子を保有する分離株はすべてKL47に属する。

図2 CT3176と非CT3176群間のPan-GWAS解析。 パンゲノムと関連はRoaryとScoaryで計算した。 プロットマップはggplot2で作成した。

プロテオーム解析

3つのampR+ (AH3176-1, AH3178-1 and AH1689-2) と3つのampR- (AH1689-3, AH1689-4 and AH1689-5) 分離体をプロテオーム解析用に選択した。 36,727個のユニークペプチドに基づき、両グループで合計3093個のタンパク質が同定された。 最終的に、24個の差次的発現タンパク質(DEP)を同定した。 その中で、ampR+の分離株はampR-の分離株と比較して、15個がアップレギュレーション、9個がダウンレギュレーションしていた（図3A-C、表S2）。 WcaJは最も高いフォールド変化を示したため、強調した。

図3 プロテオーム解析とカプセル染色。 (A) ampR+ (AH1689-2, AH3176-1, AH3178-1) と ampR- (AH1689-3, AH1689-4, AH1689-5) Klebsiella pneumoniae 分離株の定量タンパク質発現量の比較を示すVolcanoプロットである。 (B, C) 1.2倍以上の差分発現タンパク質をカラーで表示。

Virulence in Animal Models and Quantification of Capsule

非多孔性CRKP株の毒性におけるampRの役割を明らかにするために、3株（AH3176-1、AH1689-2、AH1689-3）を選び、マウスモデルで毒性試験を実施した。 その結果、AH3176-1とAH1689-2はampR+株、AH1689-3はampR-株であった（図1）。 また，AH3176-1，AH1689-2の2株はampR+株であり，AH1689-3はampR-株であった（図1）。 GM2およびGM6はともにKL1に属し、そのうちGM6はampR遺伝子を持つがGM2は持たない。 しかし，非高粘菌のKL47株と高粘菌のKL1株のampR配列は異なっていたため，本研究ではそれぞれampRKL1およびampRKL47と命名した．

図4Aに示すように、AH3176-1とAH1689-3:ampRKL47にアラビノースを加えたものは感染後4日目に1×107コロニー形成単位（CFU）の接種で0％の生存率だったが、AH1689-2では20％、アラビノースを含まないAH1689-3：ampRKL47で40％、AH1689-3：pBAD33とATCC70721では60％の生存、AH1698-3で感染後7日目の生存が確認された。 AH1689-3ではampRKL47遺伝子で相補化すると生存率が有意に低下し（n = 10; P = 0.033, log-rank Mantel-Cox test），ampRが病原性に重要な役割を果たすことが示唆された． AH3176-1をマウスに感染させると，肺のCFUは他の分離株に比べて約10〜100倍高くなった（図4B）． 肺の病理所見は、感染群によって肺胞壁の肥厚、リンパ球の浸潤、血管内出血の程度が異なっていた。 中でもAH3176-1による肺の病理変化は最も深刻で，広範な肺混濁と肺胞内出血を呈した（図4D-F）。

図4 マウス肺感染モデルにおける非高粘菌肺炎菌分離株の病原性 (A）AH3176-1、AH1689-2、AH1689-3およびAH1689-3 ampRKL47補体変異体の1 × 107コロニー形成単位（CFU）が生存に及ぼす影響を評価した。 (B）感染後24時間（hpi）に、感染マウスの肺を採取し、細菌負担をCFU列挙によって決定した（n = 10; *P < 0.05, **P < 0.01, 一元配置分散分析（one-way ANOVA））。 データは3つの独立した実験の代表値である。 (C)異なる菌株のウロン酸産生量。 両対ともStudent’s t-testを行った。 各データポイントは3回繰り返した(n = 3)。 データは平均値±s.e.m.で示した。 *P < 0.05, ns =有意差なし。 感染していないマウス（D）、またはATCC700721（E）およびAH3176-1（F）に感染したマウスの肺を採取し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 すべての画像は40倍率である。 スケールバー：250μM.

図5Aに示すように、GM6に感染したマウスの生存率は、GM2およびATCC700721のそれよりも著しく低いことが示された。 GM2にampRKL1を相補的に導入すると生存率の低下が観察された。 また、GM6感染マウスの肺の細菌量は、GM2およびATCC700721よりも有意に多く（図5B）、HE染色によりGM6感染により肺の広範囲な圧密と肺胞内出血が認められた（図5E-G）。 しかし，ampRKL47をGM2に導入しても生存率に影響はなかった（図5C）。

図5 マウス肺感染モデルにおける高粘性肺炎菌分離株の病原性。 (A）生存率に対するGM2，GM6およびGM2 ampRKL1補体変異体の1×106コロニー形成単位（CFU）の影響を評価した（n = 10; *P < 0.05, **P < 0.01, log-rank Mantel-Cox test），）。 (B）感染後24時間（hpi）に、感染マウスの肺を採取し、細菌負担をCFU列挙によって決定した（n = 10; **P < 0.01, 一元配置分散分析（one-way ANOVA））。 データは3つの独立した実験の代表値である。 (C) GM2およびGM2 ampRKL47相補変異体の1×106 CFUの生存率への影響を評価した。 (D) 異なる菌株のウロン酸産生量。 対応のない両側Student’s t-testを実施した。 各データポイントは3回繰り返した（n = 3）。 データは平均値±s.e.m.で示した。 *P < 0.05、ns =有意差なし。 感染していないマウス（E）、GM2（F）およびGM6（G）に感染したマウスの肺を採取し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。 画像はすべて40倍率である。 スケールバー：250μM.

莢膜はK. pneumoniaの主要な病原因子であり，プロテオーム解析の結果，WcaJが莢膜合成の初期段階を制御することが明らかになったので，莢膜多糖の生成量について検討した． その結果、ampR相補型株AH1689-3：ampRKL47とGM2：ampRKL1にアラビノースを加えた株は、それぞれAH1689-3とGM2に比べて有意に多くのカプセル多糖（ウロン酸）を生産した（図4C、図5D）。

考察

MLST は K. pneumoniae 集団定義において最もよく用いられる技術となってきた。 高速かつ安価なWGSにより、従来のMLSTのようにいくつかの遺伝子座だけでなく、全ゲノムを比較して分離株のタイピングを行うことが可能になった。 cgMLSTによる遺伝子型判定では、ゲノム全体の数千の対立遺伝子を使用するため、より高度な分離株識別が可能となります。 本研究では，cgMLSTを用いて135株の臨床用CRKPを分類し，臨床情報に基づくCT型の違いを明らかにした． 症例数が少ないため，CT型と臨床転帰の関連性を得ることはできなかった． しかし，死亡率の違いから，CT3176に属する分離株についてさらに検討することができた． GWAS解析の結果，ampR遺伝子がCT3176分離株と有意に関連していた。

これまでの研究で，転写因子LysRファミリーに属するAmpC β-lactamase制御因子AmpRが緑膿菌の複数の病原性メカニズムも制御することが示されている29，30。これまで，AmpRが肺炎Kの病原性制御の役割について報告した論文は1報のみであった． K. pneumoniaeのクローン分離株は、既知の病原性遺伝子がほとんどなく、重症感染症の原因となっていることが示された。 これらの分離株のAmpRは，カプセル合成のアップレギュレーション，バイオフィルム形成や3型フィンブリア遺伝子発現の調節，マウス消化管への定着に関与していた31。しかし，致死的感染モデルのデータがないため，これらの分離株の病原性レベルは不明なままであった。 本研究では、肺炎モデルを用いて、これらのampR保有株の病原性が増強されていることを確認した。 これにより，これらの分離菌に感染した患者の死亡率が高い理由を説明することができるだろう」

以前は，ST11型K. pneumoniaeはカルバペネムに耐性であっても高病原性ではないことが一般的であった。 しかし，2017年にST11型カルバペネム耐性高病原性K. pneumoniae分離株による病院感染症のアウトブレイクが報告された。 これらの分離株の高病原性表現型は、ST11および血清型K47に属する古典的CRKP分離株が約170 kbpのpLVPK様病原性プラスミドを獲得したことによるものであった15。上記の報告とは異なり、本研究では病原性を増強したST11 CRKP分離株に病原性プラスミドが見られず、病原性増強は古典的機構によるものではないと考えられる32。複数の病原性因子を含む病原性プラスミドとは異なり、AmpRは単独に病原性を増強することができる。 このことはampR相補株の病原性試験により確認された。

WcaJはコラン酸合成を開始し、最初の糖（グルコース-1-P）を脂質担体ウンデカプレニルリン酸に搭載する役割を持つ酵素である。 プロテオーム解析の結果，AmpRがカプセル合成の初期段階を制御することによってK. pneumoniaeの病原性を高めることが示唆された33． AmpRは、その制御因子として、遺伝子プロモーターに結合することが必要である。 現在までに，K. pneumoniaeでは多くのカプセルタイプが同定されており34，いくつかのカプセルタイプにAmpR結合部位がないことが，KL1分離株の病原性がKL47分離株に見られるAmpRによって増強されないことの説明になると考えられる。

新しい証拠により，高粘度化と高ビルレンス性は異なる表現型であり同義的に使用すべきでないということが示唆されている。 さらに，分離株がhypervirulentであるかどうかを判断する上で，string testが陰性であることは重要である35。本研究の主要な発見は，病原性が増強された非高粘性ST11 CRKPサブクローンを同定したことである

この研究の最大の制限は，少数例であり，非高粘性hypervirulent CRKP感染と臨床結果との関連を検討できない点である． また、ampRノックアウト株の構築はできなかったが、これはゲノム解析の結果、ampRがプラスミドに存在すると推定されたためと考えられる（図S3）。 このような非高粘菌性表現型の株は臨床上ほとんど見分けがつかないため，引き続き新規株の調査・研究が必要である

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