[Antigen retrieval: its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

免疫組織化学の最大の問題の一つは、組織切片の形態と抗原の免疫反応をいかによく維持するかということであった。 固定、脱水、包埋などの日常的な組織調製後に抗原の免疫反応性を取り戻す（アンマスキング）ための様々な技術が考案され、細胞組織学的な調査のみならず、病理臨床診断における免疫染色に利用され始めている。 本報告では、まず、タンパク質の不活性化の観点から、固定と抗原賦活の両者の機構と意義について概観した。 次に、最もポピュラーなアンマスキング技術である酵素分解法と熱誘起エピトープ回収法（HIER）について、免疫組織化学に的確に適応するための実用上の問題点と注意点を検討した。 固定によって引き起こされる主なアーチファクトは、タンパク質のアミノ酸残基間の架橋に起因する組織抗原のマスキングである。 抗原の生化学的性質と固定に対する抵抗性を考慮し、抗原ごとに適切な固定条件を選択することが重要である。 (表2）。また、様々なアンマスキング技術により抗原の免疫反応を容易に回収できるよう、固定条件は最小限にとどめることが重要である（表3、図1）。 抗原の回収自体は、他の多くのタンパク質の不活性化過程と同様に、組織におけるタンパク質の変性を引き起こす過程である（表1）。 酵素消化は、抗原の周囲のタンパク質のマスキング部分をエッチングし、そのエピトープを露出させることができる。 酵素消化は比較的簡単で、処理条件のコントロールも容易ですが、酵素の種類やロットにより、必ずしも劇的で一貫した結果が得られるとは限りません。 したがって、各抗原に最適な染色結果を得るためには、自分なりの消化マニュアルを見つける必要があります（例えば、表4）。 例えば、ブロモデオキシウリジン（BrdU）と増殖細胞核抗原（PCNA）の免疫染色では、ペプシン消化が最も良い結果を示し、他の酵素はほとんど影響を及ぼさなかった（表5）。 加熱はまた、ポリペプチドの骨格を切断し、固定によって生じた架橋を破壊する可能性がある。 抗原賦活化に対する加熱効果は温度依存的であり、温度と時間の積に比例するようである。 パラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋切片に対するPCNA免疫染色の場合、90℃、3分以上の加熱が必要であるが、加熱条件が厳しくなるにつれ、非特異的バックグラウンド染色も増加し（表6）、抗原賦活化における最も深刻な問題の一つである（図2a、c）。 このような望ましくない結果を回避するための一つの選択肢として、最適でない加熱（80℃、10～15分）とペプシン消化の組み合わせが考えられます（Fig. 2b, d）。 このような劇的な変性方法を採用する際の重要な理論的考察は、以前に信頼した抗体で偽陽性（または偽陰性）の結果を生じさせることなく、マスクされた抗原エピトープを適切に露出させることができるかどうかということである。 それぞれの抗原は、その抗原性の最適な保存と正確な局在化のために、「テーラーメイド」の組織調製を必要とするようです。 免疫学、分子生物学、遺伝学、発生学などの発展に伴い、様々な分子の空間的・機能的関係をin situで解析するために、in situ hybridizationなどの他のテクノロジーと組み合わせた多重免疫染色の必要性が高まるはずである。 そのとき、抗原賦活法は強力な戦略となるでしょう。