Antinociceptive Activity of Methanol Extract of Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb.Stems – FullText – 医学の原理と実践 2017, Vol.26, No.4 Stems

Abstract

Objective: 本研究の目的は、Tabebuia hypoleucaの茎のメタノール抽出物（THME）の抗侵害受容活性を評価することである。 材料と方法 動物を8匹ずつ5群に分け、各試験を行った（陰性対照群、陽性対照群、THMEを150、300、500 mg/kgの用量でp.o.投与した3群）。 THMEの抗侵害受容作用は，マウスのwrithing，ホルマリン，テールフリック，ホットプレートモデルを用いて評価した． 結果 writhing試験において、THME（150、300、500 mg/kg）は有意に（p p p p p）収縮をもたらした。 これらの結果は、THMEがいくつかの侵害モデルを用いて抗侵害受容活性を有することを示し、その効果は末梢性および中枢性の両方の抗侵害受容メカニズムが関与していることを示唆している＜718＞＜4249＞© 2017 The Author(s) Published by S． Karger AG, Basel

Significance of the Study

– 本研究において、Tabebuia hypoleucaは、末梢性および中枢性の両方の抗侵害受容メカニズムが関与することにより抗侵害受容作用があることが示された。 T. hypoleucaは痛みの治療のための新しい選択肢になる可能性があります。

はじめに

痛みは傷つく刺激の知覚から生じる主観的な経験で、それが起こっているときに個人が意識する必要がある感情の要素を含みます。 1986年、国際疼痛学会（IASP）は、疼痛を「実際のまたは潜在的な組織損傷に関連する、あるいはそのような損傷という観点から説明される不快な感覚的・感情的経験」と定義した。 疼痛はまた、侵害受容と呼ばれる生理学的な要素を持っている。すなわち、強い熱的、機械的、または化学的刺激が侵害受容器と呼ばれる末梢神経線維の部分集団によって検知されるプロセスである。 しかし、これらの薬剤の長期使用は、胃潰瘍、腎障害、気管支痙攣、心臓異常、依存性などの重大な副作用を生じる可能性があり、その使用は制限される。 近年、疼痛治療薬の開発が進んでいるが、依然として有効な鎮痛剤が求められている。 長年にわたり、天然物は、現代医学、特に痛みの治療において現在使用されている創薬につながる分子多様性の比類ない源であることが示されている.

Tabebuia spp. (Bignoniaceae) には、中央および南アメリカの熱帯雨林地域で見られる、厳密に木質として知られている約100種が含まれている.。 Tabebuia属の種は、伝統的に梅毒、マラリア、皮膚感染症、胃の疾患、癌、炎症、痛み、細菌や真菌感染症、不安、貧しい記憶、過敏性、うつ病、および他の治療に使用されています。

Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb.は、通称「ロブレ・マチョ」と呼ばれるキューバの固有種で、Sierra MaestraとGuantanamoに自生している植物である。 我々はこれまでに、カラギーニン誘発足浮腫モデルおよびクロトン油誘発耳介浮腫モデルを用いて、T. hypoleuca茎のメタノール抽出物（THME）の抗炎症活性を報告している 。 本研究では、痛みの動物モデルにおいてTHMEを経口投与し、抗侵害受容活性を評価した。

材料と方法

植物材料と抽出

T. hypoleuca茎はキューバ、ハバナ州の国立植物園（JBN）で収集された。 植物の同定はEldis R. Becquer博士によって確認され、サンプルはHFC-88204の番号で実験ステーションのハーバリウムに寄託された。 T. hypoleucaの茎の抽出には，メタノール（Merck®）を用いたソックスレーでの固液抽出を用いた。 718>

Drugs and Chemicals

The drugs and chemicals used were: indomethacin (SOLMED, Havana, Cuba), diclofenac (SOLMED), methanol (Merck, Germany), acetic acid (Merck), and formalin (Merck). 抽出物およびすべての薬剤は、0.9%生理食塩水（NaClを蒸留水で希釈したもの）で希釈した。

動物

オスおよびメスのBalb/cマウス（20-25 g）およびメスのSprague-Dawleyラット（180-200 g）は国立実験動物生産センター（CENPALAB、サンチャゴ・デ・ラスベガス、キューバ、ハバナ）から供給された。 23±2℃，相対湿度40～60％，12/12時間明暗サイクルの標準条件下で飼育し，餌と水を7日間自由に摂取させた． すべての実験手順は、実験動物の世話と使用に関する国際ガイドラインに従って実施し、国立動植物衛生センター（CENSA、ハバナ、キューバ）の動物倫理委員会の承認を得た（プロトコル番号03/FT/15）。

急性経口毒性

経済協力開発機構（OECD; guideline 423）のガイドラインに準じて急性経口毒性試験を実施した。 試験には健康な雌の子宮内膜炎ラットを使用しました。 ラットは2群に分け，各群3匹ずつとした。 経口投与の12時間前から投与3時間後まで、餌と水を与えずに飼育した。 対照群には1 mL/kgの生理食塩水を経口投与し，暴露群には2,000 mg/kgのTHMEを投与した。 その後，OECDガイドラインで推奨されているように，別の3匹の動物で2,000 mg/kg投与の安全性が確認された。 投与後直ちに，すべての動物を，確立された基準に基づいて合計14日間観察し，最初の4時間は特に注意し，臨床症状または死亡を記録した。 15日目にすべての動物を頸椎脱臼により安楽死させ、その後、剖検と臓器の巨視的観察を行った。

リスティングテスト

リスティングテストはKosterらの記載に少し修正を加えて実施した。 雄マウスを8匹ずつ5群に分けた。 インドメタシン（20 mg/kg）、蒸留水（10 mL/kg）およびTHME（150、300、および500 mg/kg）を経口投与した。 投与1時間後に0.8%酢酸溶液（0.01 mL/g体重）を腹腔内注射して踠きを誘発した。 酢酸溶液注入後15分間の悶絶（腹部の収縮と後肢の伸展）を数えた。 鎮痛活性の割合は以下のように算出した。

ホルマリンテスト

ホルマリンテストはSantos and Calixto .の記述に従って行われた。 ホルマリン誘発の疼痛行動は二相性で、最初の急性期（神経原性疼痛）は0-5分続き、比較的短い静止期が続き、その後、15-30分続く長時間の緊張性反応（炎症性疼痛）が来た。 雄マウスを8匹ずつ5群に分けた。 ジクロフェナク（10 mg/kg）、蒸留水（10 mL/kg）、THME（150、300、500 mg/kg）を経口投与した。 30分後，右後肢足底に2.5％ホルマリン溶液（37％ホルムアルデヒド）20μLを注射した． 侵害受容の指標、すなわち各動物が注射された前足を舐めるか噛むかして過ごした総時間を30分間記録した。

Tail Flick Test

テールフリックテストは、D’Amour and Smith .に従って実施した。 雄マウスを8匹ずつ5群に分けた。 55±0.5℃に保たれた温水中にマウスの尾の1～2cmを浸漬させた。 尾の浸漬と脱落の間の潜時を記録した。 実験の24時間前に1.5秒から3.5秒の潜時を示したマウスをこの研究に選び、前処置の潜時を記録した。 インドメタシン（20 mg/kg）、蒸留水（10 mL/kg）、THME（150、300、500 mg/kg）で動物を経口投与した。 経口投与から60分後、再び反応時間を記録した。 マウスの尾部組織の損傷を避けるため、10秒のカットオフ時間を使用した。 鎮痛活性の割合は以下のように計算した：

ホットプレート試験

ホットプレート試験はAsongalemらによって記載されたように実施した． 雌マウスを8匹ずつ5群に分けた。 装置は水槽の中に金属製の円柱(直径20cm、高さ10cm)を入れたものである。 円筒の温度は55±0.5℃に設定された。 ホットプレート上で15秒以内に前脚を舐める、前脚を引く、ジャンプするなどの反応を示したマウスを実験24時間前に選び、前処理潜時を記録した。 インドメタシン（20 mg/kg）、蒸留水（10 mL/kg）およびTHME（150、300、500 mg/kg）を経口投与した。 経口投与から60分後、再び反応時間を記録した。 肉球の損傷を避けるため、15秒のカットオフ時間を使用した。 鎮痛活性の割合は、テールフリックテストと同じ式を用いて算出した。

統計分析

統計分析は、統計ソフトウェアパッケージSPSS, version 21.0 for Windows (IBM Corp., Armonk, NY, USA) を用いて実施した。 データは平均値±SEMで表した。 一元配置分散分析に続いて、ダネットポストホックテストを使用して、対照群と処理群の間の有意差を決定した。p < 0.05は統計的に有意とみなされた。

Results

Acute Oral Toxicity Study

急性経口毒性試験では、最大2000 mg/kg体重までのTHMEは14日間観察しても、動物の死亡、行動または神経毒性の兆候を生じないことが示された。 また、正常な体重増加が認められ、対照ラットと処理ラットの臓器重量に差はありませんでした(Table 1)。

Discussion

本研究では、THMEは2000mg/kg体重まで（急性経口毒性試験）では毒性作用はないことが示された。 また、THMEをマウスに経口投与すると、侵害受容の化学的刺激（writhingおよびホルマリン）および熱的刺激（テールフリックおよびホットプレート）に対して抗侵害受容作用を示した

writhingテストは、炎症性疼痛の典型的モデルを記述している。 酢酸は、末梢組織液中の炎症性物質のレベルを増加させることにより、腹部の収縮と腹筋の捻転を誘発するものである。 この試験において、THMEを投与したマウスの身悶え回数は対照群に比べ少なく、酢酸による内臓侵害の抑制が認められた。 この結果は、THMEが2つの急性炎症モデルマウスで抗炎症活性を示したという以前の報告を裏付けるものであり、見られる抗侵害受容効果は、炎症メディエーターの放出の抑制または末梢のシクロオキシゲナーゼ活性の遮断に一部起因しているものと思われた。 このアッセイに伴う痛みは、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、プロスタグランジンなどの内因性メディエーターが末梢の侵害受容性ニューロンを刺激することによって間接的に発生する可能性がある。 しかし、この化学的方法は、感度は良いが特異性が低く、結果の誤解を招く。これは、この方法が非特異的な侵害受容の刺激であり、異なるメカニズムを持つ薬物に感受性があるためである。 この問題は、他の侵害受容モデルで補完することで回避できる。

ホルマリンテストは、2相で生じる持続性疼痛のモデルと考えられている。 第一相(0-5分)は神経原性疼痛、第二相(15-30分)は炎症性疼痛が特徴である。 この試験において、THMEは300 mg/kgと500 mg/kgの用量で、第1相のリッキング時間が対照群よりも有意に短くなったが、第2相では500 mg/kgの用量でのみ抗侵害受容作用を示した。 第2相における抗侵害受容作用は、THMEが500 mg/kgの用量でのみ抗炎症活性を示した以前の研究と関連している。 初期段階の痛みは主にC線維の活性化によって引き起こされ、後期段階では末梢組織における炎症反応と脊髄後角の機能変化の組み合わせが関与していた 。 中枢に作用する薬物は痛みの両相を抑制し、末梢に作用する薬物は主に第2相を抑制する。 これらの結果は、ホルマリン試験におけるTHMEの抗侵害受容活性は、神経原性および抗炎症性メディエーターの両方の作用に起因する可能性を示唆するものであった。

テールフリックテストでは、熱刺激により末梢の侵害受容器が活性化され、反射的に尾が外れるようになった。 反応時間の増加は、一般的に中枢性の抗侵害受容活性を評価するための重要なパラメータと考えられていることは、以前に報告されているとおりです。 尾の跳ね上げの発見は、脊髄の再跳躍アークによるもので、下行性経路のメカニズムによって調節されている可能性がある 。 尾部フリッカー試験においてTHME（300および500 mg/kg、p.o.）の抗侵害受容効果が観察され、その中枢活性が確認された。 ホットプレートテストでは、主に脊髄上部の反射により、THMEの中枢に作用する抗侵害受容作用が明らかになった。 一定温度に加熱されたプレートは、反応時間で測定された2つの行動成分、すなわち、前足を舐めることとジャンプを生じさせたが、これは、棘上部に統合された反応によるものと考えられる。 これらの結果から、THME（300および500 mg/kg、p.o.）は、このモデルにおいて潜伏時間を有意に増加させることから、中枢性の抗侵害受容作用を誘導することが明らかとなり、その中枢活性が確認された。

いくつかの植物化学的研究により、Tabebuia種からの抽出物にはタンニン、フラボノイド、キノン、アルカロイド、ナフトキノン、イリドイドなどの多様な二次代謝産物が含まれていることが明らかにされています。 THME については、予備的な植物化学分析により、タンニン、アルカロイド、フェノール化合物の存在が確認され、抗侵害受容活性や抗炎症活性など様々な生物学的作用があることが示されており、THME で認められた抗侵害受容作用は、これらの化合物の存在による可能性がある。 しかし、生理活性成分を特定し、これらの化合物が抗侵害受容特性を発揮する作用メカニズムを明らかにするために、さらなる研究が必要です。

結論

本研究は、マウスの侵害のいくつかのモデル（化学および熱）を使用してT. hypoleucaの茎のメタノール抽出物の抗侵害受容活性を実証し、それによって本種が中枢および末梢媒介抗侵害受容作用を有することを示しています。

謝辞

著者らは、CENSAの生物医薬品開発部門のRafael LorenzoとDamileysi Castroによる技術サポートに感謝している。 また、言葉の修正にご協力いただいたEduardo Sistachs博士に感謝いたします。

Disclosure Statement

著者らは申告すべき利益相反はない。

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