Apocynin, a low molecular oral treatment for Neurodegenerative Disease

Abstract

Accumulating evidence suggests that inflammatory mediators secreted by activated resident or infiltrated innate immune cells has significant impact on the pathogenesis of neurodegenerative diseases.そのようなエビデンスが蓄積されている。 このことは，神経変性疾患に罹患した患者にとって，自然免疫活性の選択的阻害剤による治療が有益であることを示唆していると思われる。 本論文では、薬用植物Jatropha multifidaから単離された本質的に無毒なフェノール化合物であるアポシニンの治療の可能性について概説する。 アポシニンは食細胞のNADPHオキシダーゼNox2を選択的に阻害し、経口投与が可能で、低用量で顕著な効果を発揮する

1. はじめに

高齢化社会では神経変性疾患が増加している。 比較的普及している例としてはアルツハイマー病やパーキンソン病があり，あまり普及していない例としてはハンチントン病やルー・ゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症；ALS）などがある。 すべての神経変性疾患に共通するのは、神経機能の進行性低下を食い止める有効な治療法が存在しないことです。 近年、神経変性疾患の発症には、内在あるいは浸潤した自然免疫細胞による炎症反応が大きな影響を及ぼしているのではないかという見方が強まっています。 その中心的な役割を果たすのがミクログリアである。ミクログリアは骨髄系に属するグリア細胞で、しばしばCNSのマクロファージと指摘される。 この興味深い新知見は、単核球や多核球などの自然免疫細胞の細胞障害性機能から末梢臓器を保護する効果が証明されている薬剤が、神経変性疾患の神経炎症性要素の治療にも有用である可能性を示唆しているのかもしれない。 薬物は血液脳関門を通過し、神経変性過程の舞台である中枢神経系に浸透することが大きなハードルである。 このレビューでは，小フェノール系抗酸化物質であるアポシニンの神経変性疾患治療薬としての可能性を強調する前臨床試験について述べる

2. 薬理学的に活性な植物フェノールであるアポシニン

ヒマラヤ高山地帯に生育する多年草Picrorhiza kurroa Royle ex Benthの根に生理活性物質としてアポシニン (4′-hydroxy-3′-methoxyacetophenone or acetovanillone) が確認されました。 この根からの抽出物は、インドやスリランカのアーユルヴェーダ医学の伝統において、肝臓、心臓、関節、肺の病気の治療のための民族薬の調製に使用されている。 私たちは、実験室で制御された条件下で 95% エタノール根エキスを調製し、その調製物を、急性炎症の実験的試験としてヒト多形核/好中性顆粒球 (PMN) の酸化的バーストを用いた活性誘導精製にかけました

私たちが用いた読み取り測定は、ヒト血清中でオプソン化したザイモサンによって刺激されたヒト PMN によるルミノール増強化学発光の生成に基づいています。 このアッセイの本質は、血清中でオプソニン化された酵母粒子が、表面に露出した免疫グロブリンや補体因子の受容体を介してPMNsを刺激することである。 これらのレセプターを介して伝達される活性化シグナルは、細胞質顆粒を空にして（脱顆粒）、食細胞NADPH酸化酵素Nox2の集合を引き起こす。 Nox2酵素複合体は、膜結合型（, ）と細胞質型（, ,, およびRac2）のサブユニットから構成されている。 サブユニットは特定のキナーゼによってリン酸化され、チオール架橋が形成されることで集合する。 集合した複合体は、NADPHから電子を受け取り、これを遊離の分子状酸素に移動させ、スーパーオキシドアニオン（1電子還元）と過酸化水素（H2O2、2電子還元）を生成する。 どちらのオキシダントも細胞毒性を持っていることは、異なる種の赤血球を用いて証明されている。 PMNの酸化的バーストは、ROSと総称される強力な活性酸素種のカスケードから構成されている（図1）。 一酸化窒素との反応により、強い細胞毒性を持つペルオキシナイトライトが形成される。 H2O2はFe2+イオンの存在下で反応性の高いヒドロキシルラジカル（OH-）に変換され、膜脂質の過酸化を経て細胞膜の流動性に影響を与える。 PMNの脱顆粒により放出されたミエロペルオキシダーゼは、H2O2とハロゲン化物（Cl2、Br2、J2）の反応を触媒し、毒性の高い次亜ハロゲン化物（OCl-、OBr-、OJ-）を形成する。 活性酸素は貪食された微生物を細胞内で殺すのに不可欠な成分であるが、細胞外環境に放出されると、活性化したPMNの組織破壊活性の重要なメディエーターとなる。

化学的に複雑な植物抽出物の成分は、複数のレベルで読み取りアッセイを妨害し、またPMNの殺害またはオキシラジカルの消去などの非特異的効果を及ぼすことが想定され得る。 このことは、活性誘導型精製を成功させるには、偽陽性結果を避けるために、十分に焦点を合わせ、非特異的効果について慎重に制御する必要があることを示唆している。 これらのハードルにもかかわらず、我々はアポシニンの高度に特異的な活性をアッセイで実証することができた。 アポシニンは、MPO触媒によるH2O2との反応で代謝的に活性化され、対称的な二量体であるジアポシニンを形成することがわかった（図2）。 この反応中間体がGSHで捕捉されることから、代謝的に活性化されたアポシニンが、機能性Nox2を構成する膜結合型と細胞質型の間のチオール橋の形成を阻害しているのではないかという仮説が立てられた。 しかし、その後、ジアポサイニンがNox2のスーパーオキシド産生を直接阻害すること、この活性はMPOとは無関係であることが明らかになった 。 アポシニンの重要な発見は、アポシニンが細菌の細胞内殺傷を妨げることなく、PMNの酸化的バーストを阻害することであった。 このことは、アポシニンを投与することで、活性化したPMNの殺菌機能を阻害することなく、PMNが浸潤した組織の付随的な損傷を防ぐことができることを示唆している

Figure 2

3.アポシニンはNox2活性を阻害する。 AIMID動物モデルにおけるアポシニンの有効性

我々がアポシニンの臨床効果を試験した最初の標的疾患は、自己免疫炎症疾患（AIMID）関節リウマチ（RA）の前臨床モデルとして認められているWAG/Rij（RT-）ラットコラーゲン誘導関節炎（CIA）モデルであった。 このモデルでは、RA患者の状況を反映し、PMNが明確な病原性を持っている。 ラットの研究では、我々はアポシニンを0.3から200μg/mLの用量範囲で投与することにした。 その結果、1日6μgの経口投与に相当する0,3μg/mLの最低用量で、すでに関節炎がほぼ完全に抑制されていることが観察された。 抗コラーゲン抗体や、CIAやRAにおける重要な病原性サイトカインであるIL-6の血清レベルに対するアポシニンの効果は観察されず、この疾患の炎症成分に対する高い選択性が示唆された。 我々とは別に、Hougeeらは、CIAモデルマウスにおいて、アポシニンを経口投与すると、関節軟骨プロテオグリカンの産生が阻害された関節を回復させることを証明した。 この治療の興味深い副作用は、アポシニンの強力な抗炎症作用を示すもので、免疫抗原／CFA製剤が注射された部位の壊死性皮膚病変が劇的に抑制されたことである 。

1990年に強力な抗炎症剤として最初に同定されて以来、アポシニンは、末梢および中枢器官に影響を及ぼす免疫介在性炎症疾患の幅広いin vivoモデルで実証されたように、好中球の酸化的バーストの阻害剤として確立されてきました。 このレビューで特に重要なのは、ALS、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患モデルで観察された有望な臨床効果である。 これらのモデルでは、アポシニンの抗酸化活性は好中球ではなく、「脳のマクロファージ」、すなわちミクログリアを標的としている。 ミクログリア

脳には、アストロサイト、ミクログリア細胞、髄膜や脳動脈および毛細血管の血管周囲にあるマクロファージなどの免疫機能を発揮する様々な細胞型が存在する。

ミクログリアは、中枢神経系に遍在する自然免疫細胞で、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイトと密接に相互作用している。 しかし、ミクログリアのみが刺激後にMPOを放出し、アポシニンの代謝活性化の必要条件となる。

健康なCNSのミクログリアは、ramified rest表現型を持っている。 以前の概念とは異なり、健康な脳のミクログリアは安静ではなく、突起の伸縮や、炎症を引き起こす可能性のある組織の残骸の貪食によって、細胞外環境の恒常的監視を行う非常に動的な細胞である。 活性化したミクログリアは、MS脳の脱髄皮質灰白質病変内、アルツハイマー病脳のアミロイド斑の周囲、パーキンソン病の変性黒質など、病的なCNS組織で見出される。 ミクログリアの多様な発現プロファイルは、広範で連続的な活性化状態を反映しているように見えるが、マクロファージに指定されているM1状態とM2状態に対応する、両端の2つの活性化状態を認識することができる … 「古典的に活性化された」M1ミクログリアは、例えばLPSやIFNγによって誘導され、TNF-α、IL-1β、IL-12などの炎症性サイトカインや活性酸素・窒素種などの毒性物質の分泌によって発揮される炎症性機能を持つ。 IL-4やIL-13を多く含む環境下で誘導された “代替活性化 “M2ミクログリアは、IL-4、IL-10、TGF-βなどのサイトカインやインスリン様成長因子、アルギナーゼ-1、キチナーゼ様1などの修復因子を介して、抗炎症活性や組織再生活性を発揮している。 サイトカイン環境だけでなく、NADPH オキシダーゼ活性に直接関係する微小環境の酸化還元状態も、M1 または M2 表現型へのミクログリアの機能分化を決定している

5. Apocynin as a Potential Treatment of Neurodegenerative Disease

M1 microglia cells are the main resource of Nox2 in the brain.M1ミクログリア細胞は脳内のNox2の主な供給源である。 M1ミクログリアによる活性化されたNox2の発現は、活性酸素を産生し、ミクログリアが介在する神経毒性の本質的な要素である。 このように、ミクログリア由来の活性酸素が神経変性脳損傷の重要なメディエーターであるという考え方は広く受け入れられており、アポシニンの良好な薬理プロファイルと低毒性を神経保護治療に利用できないかという疑問が生じます。 ミクログリア細胞はNox2を発現しているだけでなく、活性化後にMPOを分泌するため、アポシニンの代謝活性化を及ぼす可能性がある。 虚血、脳内出血、脳卒中などの急性神経疾患（のモデル）に対するアポシニンの有益な効果については、複数の著者が報告している（総説あり）。 慢性神経変性疾患におけるアポシニンの展望は？

培養ミクログリアを用いたin vitroの研究では、Nox2由来の活性酸素がミクログリアの増殖と機能分極に関与することが示唆されている。 神経炎症時にNox2を阻害すると、代替的かつ抗炎症的なミクログリアの活性化が促進されることが重要な発見であった。 このことは、アポシニンでNox2を抑制することにより、炎症性M1表現型と抗炎症性/再生性M2表現型の間の健全なバランスが回復する可能性を示唆している。 他の研究者は、アポシニンがミクログリアによるIL-1β、TNF-α、一酸化窒素の産生を低下させ、有害な活動の自己永続的サイクルを中断させることを明らかにしている。 神経変性疾患における活性化したミクログリアの正確な神経毒性メカニズムはまだ不明であるが、興奮毒素であるグルタミン酸の放出にはNox2活性が必要であり、これがアポシニンによって阻害されることも非常に興味深い点である . これらのデータを総合すると、神経変性疾患においてアポシニンが有益な役割を果たす可能性があることが示唆される。 実際、いくつかの主要な神経変性疾患のマウスモデルで、アポシニンの有望な効果が観察されています。

筋萎縮性側索硬化症（ALS、Lou Gehrig Disease）。 筋萎縮性側索硬化症は、運動ニューロンを侵す一般的な成人発症の神経変性疾患である。 この病気は、急速に運動機能障害を進行させ、通常5年以内に死に至ります。 筋萎縮性側索硬化症の患者の大半は原因不明ですが、一部の患者では、スーパーオキシドディスムターゼ-1（SOD1）遺伝子の変異が遺伝的原因であるとされています。 この突然変異は、H2O2への分解が減少し、スーパーオキシドアニオンの産生が異常になることで酸化ストレスを増強させる。 変異したSOD1を発現するアストロサイトは、グルタミン酸の吸収能力が低下し、神経毒性因子を放出するため、ALSの病態に関連していると考えられている。 変異型SOD1マウスモデルにおいて、変異型SOD1を選択的にサイレンシングしたり、変異型ミクログリアを野生型ミクログリアに置き換えたりすると、ミクログリアが中心的な病原的役割を果たすことが強く示唆される。 Harrazらは、SOD1変異マウスモデルで神経変性の進行を制御するためにアポシニンを経口投与し、有望な効果を観察しています；飲料水中のアポシニンの投与は、生存期間を著しく延長し、運動障害の発症を遅らせることが観察されています。 この研究は、経口投与されたアポシニンが、神経毒性レベルの活性酸素生成を緩和するために、中枢神経系実質内で十分に高い濃度を構築できることを示している。 しかし、この有望なデータは、同じ変異マウス系統を用いた別の研究では再現できませんでした。

アルツハイマー病（AD）。 アルツハイマー病は、加齢に伴う進行性の神経疾患であり、不可逆的な認知症に至る。 アルツハイマー病の神経病理学的特徴は、大脳皮質におけるアミロイドβ凝集体の老人斑とタウ蛋白の神経細胞内凝集塊である。 老人斑の周辺には活性化したミクログリア細胞が集積しており，活性酸素，NO，TNF-αなどの神経毒を産生していることがわかった． 1284>

Lull らは，AD の hAPP トランスジェニックモデルマウスにおいて，アポシニンを飲料水から 10 mg/kg の経口投与で試験した． 彼らはアポシニンを投与したマウスで、大脳皮質と海馬のプラークサイズが有意に減少し、大脳皮質ではミクログリアの数が減少したが、海馬では減少しなかったことを観察している。 しかし、このモデルマウスで観察されたADの行動学的特徴、すなわち、海馬で組織化された空間記憶をテストするモリス水迷路遊泳テストの成績は、この治療によって顕著に改善されなかった。 このモデルにおけるアポシニンの臨床効果が限定的であったのは、AD患者においてより顕著である神経炎症が明確でなかったため、またプラーク形成が必ずしも認知機能の低下を予測しないためかもしれません。 PDの病理学的特徴は、中脳の底部に位置する色素性構造物である黒質（SN）のドーパミン産生ニューロンの進行性変性である。 黒質は、ドーパミンの放出を通じて、報酬、中毒、運動など様々な神経機能の調整に中心的な役割を担っています。 特に後者の機能は、PDにおいて障害される。 ドーパミンの減少を補うために、代謝的に安定したドーパミンの前駆体（L-DOPA）が投与されますが、相当数の患者さんで運動過多症候群として知られる典型的な不随意運動が引き起こされます。 散発性）PD患者の大多数では病気の原因は不明であるが、ごく一部では遺伝的原因、すなわちαシヌクレイン、パーキン、ロイシンリッチリピートキナーゼ2、PTEN誘導型推定キナーゼ1、ATP13A2などいくつかの遺伝子に変異があることが判明している。 MPTPで汚染されたヘロインの使用者がPD症状を発症するという観察から、臨床的に適切なPD動物モデルを作成することができた。 MPTPはアストロサイトのモノアミン酸化酵素BによってMPP+に変換された後、特定のドーパミン輸送体を介してドーパミン作動性細胞に取り込まれ、そこでミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iをブロックする。 その結果、酸化還元ストレスが生じ、細胞内のCa2+が調節できなくなり、細胞死を引き起こす。 ALS や AD と同様に、PD の神経変性はミクログリア Nox2 の活性化と関連していることが分かっており、これが発症プロセスに大きく寄与していると考えられている

Gao らは in vitro システムを用いて、ミクログリア Nox2 によって発生する活性酸素がドーパミン作動性ニューロンの MPP+ に対する感度を高めることを実証した。 また、PDのマウスモデルにおいて、ミクログリアによる神経毒性に対するアポシニンの有益な効果が示されている。 非ヒト霊長類のパーキンソン病モデルにおけるアポシニンの効果

小型の新熱帯霊長類のコモンマーモセットに低量のMPTPを反復注射すると、臨床および神経病理レベルでPDとよく似た神経病が誘発される。 我々は、このMPTPモデルを5匹のマーモセット双子に用い、アポシニンの経口投与が高等動物にも有効であるかどうかを検証した。 経口投与のために、アポシニンをアラビアガムに溶かし、各双生児の片方の兄弟にはアポシニンを含むガムを、もう片方にはガムのみを与えた。 アポシニンの投与（100 mg/kg、TID）は、MPTP（1 mg/kg、8日間皮下注射）によるPD誘導の1週間前に開始された。 アポシニンは、パーキンソン症候群に伴う典型的な体重減少を制限した。 また、アポシニンを投与したサルの運動機能は改善され、アポシニンの抗パーキンソン効果が示された。 さらに、生存しているドーパミンニューロンの数はアポシニンによって増加し、神経保護効果があることが示された。 アポサイニンは、ドーパミンの代謝物であるホモバニリン酸（HVA）と類似した分子構造を持っていることは、驚くべきことです。 アポシニンのPDにおける保護効果の説明は、天然の利用可能なo-methoxycatechol HVAのレベルの減少の補償に関連しているかもしれません。 ヒト患者の治療の展望

アポシニンは、その低い一般毒性とMPO放出食細胞による代謝活性化後にその特定の抗酸化作用が引き出されるという事実のため、潜在的に魅力的な経口プロドラッグであります。 アポシニンの安全性に関するデータは少ないが、入手可能なデータは低毒性と高い安定性を示している（一部総説あり）。 マウスの経口投与後のLD50は9g/kgと推定されている。 ラットでは120 mg/kgのアポシニンを腹腔内投与した場合、20時間後の尿中に約80％が未変化体として回収された。 マウスに420 mg/kgのアポシニンを静脈内投与すると、毒性の兆候はほとんど見られなかった。

我々の知る限り、アポシニンはヒトの神経変性疾患患者でテストされていない。 しかし、Petersらは、炎症性肺疾患のモデルとして、喘息患者のオゾン誘発性気管支メタコリン過敏症に対する吸入アポシニンの治療的可能性を評価している 。 著者らは、アポシニンによるオゾンの消去を除外し、その効果は、オゾン曝露により肺に浸潤したPMNと好酸球による活性酸素産生を緩和していると結論付けた。

このレビューで取り上げたマウス研究では、経口経路で投与した低用量のアポシニンが、ミクログリアの酸化的バーストを抑制し神経変性を阻害するのに十分な濃度でCNS実質に達することが示されている。 アポシニンの非常に低い全身毒性と非常に特異的な作用機序を考慮すると、ヒトの神経変性疾患における治療価値を検証するための魅力的な視点となるであろう。

利益相反

著者らは、本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。

謝辞

著者らは、アートワークの作成に関してHenk van Westbroek氏（BPRC）に謝意を表したい。