Association of HPV genotypes with external anogenital warts: a cross sectional study

Study design and participants

Non-probabilistic sampleを用いた横断研究を実施した。 Farwania Health District Areaの皮膚科クリニックに通院する患者を2016年11月から2017年5月まで連続的に研究に採用した。 凍結療法またはレーザー治療を予定している外性器いぼの臨床診断歴のある免疫不全患者は、皮膚科医から参加勧誘の口頭説明を受けた後、同意書に署名してもらった。 採取時、疣贅検体は万能輸送媒体（HealthLink Inc.、Copan Italia S.p.A., Italy）で採取し、-80℃で保存した。 健康科学センター倫理委員会（番号：VDR/EC/2310）および保健省から倫理的な承認を得ている。

各患者から以下のような人口統計学的情報および臨床情報を取得した。 年齢（年）、性別（男性、女性）、国籍（クウェート人、非クウェート人）、いぼの数（1個、2～4個、5個以上）、いぼの存在期間（<1ヶ月、1～6ヶ月、7～12ヶ月、12ヶ月以上）、それぞれのいぼのサイズ（センチメートル単位）（<1個、1個、1から2個間、2から以上）、パートナーがいぼを持っているか（有、無）、いぼが事前に治療を受けているか（有、無）。 HPVワクチン接種は、現在保健省でその実施が検討されているものの、クウェートではまだ実施されていないため、参加者のいずれも受けていない。

DNA抽出とコントロール

受け取った組織サンプルは-80℃で保存された。 受領したサンプル数が多いため、患者1人あたりのすべてのイボを一緒にミンチし、1回のDNA分離に供した。 組織はペトリ皿の上で滅菌したはさみと鉗子でミンチし、約25-mgの組織を秤量した。 組織はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。 QIAmp DNA Miniキット（Qiagen、米国）を用いて、製造者の指示に従って組織サンプルからゲノムDNAを抽出した。

HPV2型、HPV1型、HPV16型ベクター（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）をPCR実験における対照として用いた。

リアルタイムPCR

性器いぼにおけるHPV DNAをスクリーニングするためにリアルタイムPCRアッセイが実施された。 抽出したDNAの5マイクロリットル（5-μl）を、受動的基準としてROXを含む2X Syber Greenマスターミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）12.5-μlと、フォワードおよびリバースプライマー（10-uM、後述）10 pmolと結合させた。 プライマーのすべてのセットは、Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAによってカスタム合成されたものである。 混合物は、ヌクレアーゼフリー水（Ambion, Austin, TX, USA）で25-μl容量にした。 偽陽性または偽陰性の数を減らすために、サンプルは96光学ウェル反応プレート（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で二重に分析した。 各増幅バッチには、陽性対照と陰性対照が含まれていた。 サンプル中のHPVを定量するために、既知の陽性コントロールDNAの5倍から10倍の連続希釈をサンプルと一緒に行った。 リアルタイムPCR増幅は、ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) で行った。

リアルタイムPCRアッセイは、3種類のプレートで実施された。 最初のプレートは、LumとLe Marchandが1998年に以前に記述したように、268-bp断片の標的を増幅するβ-グロビンPCRアッセイによって、標的DNAの完全性を決定するために使用された 。 β-グロビンプライマーの塩基配列は以下の通りである。 β-グロビンフォワードPCRプライマー：5′-TGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′。 β-globin reverse PCR primer: 5′-AACAGCATCAGGTGGACAGAT-3′.The PCR amplification was initiated at 95 °C for ten minutes and completed by 45 amplification cycles (denaturation at 95 °C for 15 s, annealing at 55 °C for 45 s and extension at 65 °C for 1 minutes).

The second plate was used for presence of HPV infection using MY11/GP6 primers from the HPV L1 ORF .このプライマーを用いて、2枚目は、HPV感染の存在を調べるために使用された。 MY11/GP6プライマーの塩基配列は以下の通りである。 MY11フォワードプライマー：5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′、GP6リバースプライマー：5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATTC -3′である。 増幅された断片の予想サイズは185-bpである。 PCR増幅は95℃で10分間開始し、45回の増幅サイクル（95℃で15秒間変性、45℃で45秒間アニーリング、65℃で1分間伸長）で完了した。

3番目のプレートは、HPV L1 ORFからのHVP2/B5プライマーを用いてHPV感染の有無のスクリーニングに使用した . HVP2/B5プライマーの塩基配列は以下の通りである。 HVP2フォワードプライマー：5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′；B5リバースプライマー：5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′である。 増幅された断片の予想サイズは650-bpである。 PCR増幅は95℃で10分間開始し、45回の増幅サイクル（95℃での変性15秒、50℃でのアニーリング45秒、65℃での伸長1分）で完了した。

蛍光スペクトルは各PCRサイクルの伸長期に記録された。 ABI 7500 real-time PCRのSequence Detection Software (SDS v1.7)を使用して、各反応の増幅カーブを作成した。 特異的なアンプリコンと非特異的なアンプリコンを区別するために、各反応の後に解離曲線を作成した。 増幅曲線に基づいて、任意のサイクルから始まり、サイクル番号40までのHPV増幅を持つすべてのサンプル（カットオフラインは0.2）を解析対象として選択した。 解離曲線が70℃から80℃の間にあり、微分値が0.100から0.500の間にある試料のみをHPV DNA陽性とみなした。

サンガーシークエンス

いぼのHPV DNAは、AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) HVP2/B5 primersを最初のPCRで、CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R and C4F/C4R primers in the second PCRを用いてシーケンス前に nested PCRにより増幅された。 最初のPCRは95℃で10分間開始し、35回の増幅サイクル（95℃での変性15秒、50℃でのアニーリング45秒、68℃での伸長1分）により完了した。 2回目のPCR増幅は、1回目のPCR産物の3μlを用い、同じサイクリング条件で実施した。 HVP2/B5とCN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R, C4F/C4Rプライマーを用いて皮膚いぼから検出されると予想される幅広いスペクトルHPV遺伝子型には、α属（HPV2.HPV2.HPV3.HPV4）のHPV型が含まれる。 3、7、10、27、28、29、40、43、57、77、91、94）、γ（HPV 4、65、95、48、50、60、88）、μ（HPV 1、63）、ν（HPV 41） ……………………..。

PCR産物はPCR精製キット（NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Germany）を用いてメーカーの指示に従い精製した。 その後、BigDye terminator v3.1 cycle sequencing mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) と上記のnested PCR primersを用いてSanger sequencing 反応を行った。 BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いて、未結合の蛍光色素デオキシターミネーターを除去するためにポストシーケンスPCR精製を実施した。 95 ℃で 2 分間変性させた後、直ちに氷上で冷却し、ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 上にロードした。 サンプルは、分離媒体として POP 6 ポリマー (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を使用した 50 cm キャピラリーアレイで電気泳動しました。

サンプルは、Sequencing Analysis ソフトウェア v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) で解析されました。 HPVの配列アライメントは、BLASTnソフトウェア（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）とLos Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPVデータベース（https://pave.niaid.nih.gov/）を用いてGenBankデータベースで提示された配列との間で実施した。

得られた配列がPCR産物の収量が少ないために質が悪い場合、PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, Madison, WI)で精製後pGEM-T Easy Vector (Promega)にクローニングし、挿入物の配列決定をM13フォワードおよびリバースプライマーを用いて実施した。

統計解析

臨床診断、人口統計学的データおよびウイルス学的分析のデータは、SPSS統計ソフトウェア「Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0」（IBM Corp, Armonk, NY, USA）を用いて集計および解析した。 記述統計：度数/パーセンテージ、中心度、分散度を算出した。 平均値の等質性の検定には、正規性が保たれている場合はすべての連続変数について2標本のt検定を用い、そうでない場合はMann Whitney U検定を使用した。 3群の平均値の比較には、仮定が満たされているかどうかによって、分散分析またはKruskal-Wallis検定のいずれかを使用した。 2 つのカテゴリー変数間の関連性を調べるには，仮定を満たす場合に限り，独立性のピアソン・カイ二乗検定またはフィッシャー・エ クステック検定を用いた． 共変量のセットで二値転帰をモデル化するために、ロジスティック回帰が実施され、粗オッズ比、調整オッズ比、およびそれらの95％信頼区間が推定された。 すべての検定は2尾で、P値が5％未満を統計的に有意とした

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