BiomedicalReports

BY admin

| 10月 6, 2021

Introduction
GPMの調製
細胞培養と形態観察
MTT assay
Hoechst 33258 staining
カスパーゼ活性分析
ウエスタンブロット解析
Results
GPM inhibits the proliferation of HepG2 cells
Effects of GPM on caspase activity
Discussion
用語解説
略語
略語。

Introduction

肝細胞癌（HCC）は、肝細胞の原発癌で、原発肝癌の80％を占めている。 B型肝炎ウイルスやC型肝炎ウイルスに感染している慢性肝疾患の患者は、しばしば肝細胞癌を発症します(2)。過去数十年間、プログラム細胞死としても知られるアポトーシスの広範な研究により、このプロセスが癌治療の適切な方法であることが明らかになりました(4,5)。しかし、アポトーシス作用を持つ多くの薬剤は、副作用の問題からがん治療には使えないのが現状です。そのため、肝細胞癌の治療において、効率的に癌細胞のアポトーシスを誘導することができる新規で信頼性の高い治療薬を特定することが重要です。

近年、漢方薬はその大幅な改善効果や低い副作用から、悪性腫瘍の治療において重要な役割を果たしています（6）。漢方薬の代表格であるヤモリは、生薬として悪性腫瘍の治療に用いられてきた(7-9)。ヤモリクルーデペプチドおよびヤモリエタノール抽出物は、ヒト肝細胞癌細胞のアポトーシスを誘導し、腹水H22担癌マウスにおいて抗腫瘍活性を示すことが、我々の先行研究において証明されています（10,11）。本研究の目的は、ヤモリペプチド混合物（GPM）のヒト肝癌HepG2細胞株におけるアポトーシス効果およびその基礎となるメカニズムをin vitroで検討することであった。 (Anhui, China)から購入した。ヒトHCC細胞株HepG2は、Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, China)から提供された。

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) and Hoechst 33258はSigma (St. Louis, MΟ, USA) から購入。Caspase Activity Assay KitはBeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, China) から購入した。アポトーシス誘導因子（AIF）に対する一次抗体は BosterInc.から購入した。 (Wuhan, Hubei, China)から、β-actin 抗体は Proteintech (Wuhan, Hubei, China)から購入した。チトクロムc（Cyt c）に対する一次抗体およびマウスまたはウサギに対する二次抗体は、中山金橋生物工学有限公司から購入した。 (Beijing, China)から購入した。

マイクロプレートリーダーは、BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA)の製品を使用した。

GPMの調製

ヤモリ粉末（100g）を400mLの二重蒸留水と混合し、ホモジネートとした。 5,600×g、5分間遠心分離後、沈殿を回収し、55%エタノール溶液400 mlに浸漬した。その後、残渣液を凍結乾燥し、黄色粉末を回収した。 7212>

細胞培養と形態観察

HepG2細胞は、10%牛胎児血清、100 U/mlpenicillinおよびStreptomycinを添加したDulbecco’ modified Eagle’s mediumで37℃、湿度5 %のインキュベーターで培養された。培養液は2日ごとに交換し、対数増殖期の細胞を以下の実験に使用した。 HepG2細胞（3.0×104cells/ml）を様々な濃度のGPMと24時間インキュベートした。 7212>

MTT assay

HepG2細胞を6.0×103cells/wellの密度で96well plateに播種した。各ウェルに異なる濃度のGPMと0.003 mg/ml fluorouracil (5-Fu)を加え、20、44、68時間培養した後、MTT試薬（5 mg/l）20 μlを各ウェルに加え、さらに4時間培養した。上清を200 μlのジメチルスルホキシドに置換し、490 nmの吸光度をELX800 UniversalMicroplate Readerで測定した。細胞増殖抑制率（IR）は以下の通りである。 IR = (1-AGPM/Acontrol) ×100%

Hoechst 33258 staining

6ウェルプレートで一晩培養後、HepG2細胞を様々な濃度のGPM (0,0.06 または 0.) で処理した。08 mg/ml）と0.003 mg/ml 5-Fuを新鮮な培養液で37℃、24時間処理した。細胞をリン酸バッファリン（PBS）で2回洗浄し、Hoechst 33258染色液（10μg/ml）で染めた。暗所で15分間培養した後、細胞を冷たいPBSで2回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。

カスパーゼ活性分析

カスパーゼ活性測定キットで、メーカーのプロトコルに従ってカスパーゼ-3とカスパーゼ-9活性を測定した。数種類の濃度のGPM（0、0.06、0.08 mg/ml）と0.003 mg/ml 5-Fuに24時間暴露した後、細胞を回収して溶解バッファーに再懸濁した。その後、細胞を溶解バッファー中で20分間インキュベートし、16,000×g、4℃で3分間遠心分離した。上清を回収し，Bradford法によりタンパク質量を測定し，カスパーゼ基質ペプチドAc-DEVD-pNAおよびAc-LEHD-pNAと反応液（ジチオスレイトールを含む）によりカスパーゼ-3およびカスパーゼ-9活性をそれぞれ測定した． 405 nmの光学密度で得られた値は、AGPM/AControlとして表した。

ウエスタンブロット解析

HepG2細胞をGPM (0, 0.06 or 0.08mg/ml) と 0.003 mg/ml 5-Fu で24時間それぞれ処理した。溶解バッファーを用いて氷上で30分間処理した後、13,000×g、4℃で30分間遠心分離を行った。タンパク質濃度はブラッドフォード法で測定した。タンパク質は12% SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。PVDF膜はPBS中の5%無脂肪乾燥乳で37℃、1時間ブロックし、0.1%Tween-20を含むTris-buffered saline (TBST) で15分間3回洗浄し、一次抗体とインキュベートした。カスパーゼ-3（cat. no. sc-7148; 1:200, polyclonalrabbit anti-human）, カスパーゼ-9（cat. no. sc-8355; 1:200, polyclonalrabbit anti-human）, Cyt c (cat. no.). sc-13156; 1:500,monoclonal mouse anti-human), AIF (cat. no. PB0388; 1:200,polyclonal rabbit anti-human) and β-actin (cat. no. 66009-1-Ig;1:5,000, monoclonal mouse anti-human) at 4°C overnight.その後、サンプルをTBSTで30分間洗浄し、対応する二次抗体と1時間インキュベートした。化学発光はECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology) で検出した。群間の差はSPSS 19.0system (IBM Corp., Armonk, NY, USA)を用いて一元配置分散分析で調べた。 P<0.05は、統計的に有意な差を示すとみなされた。

Results

GPM inhibits the proliferation of HepG2 cells

GPM on HepG2 cell growth effect was assessed by the MTT assay.The effect of GPM is the GPM in the proliferation of HepG2 cells. その結果、GPMは用量・時間依存的にHepG2細胞の増殖を有意に抑制した（Fig.1）。 GPMで処理した細胞は、丸みを帯びた形態、収縮および付着力の喪失を示した（図2）。図3に示すように、GPM処理細胞では核凝縮、染色体凝縮、顆粒状アポトーシス小体などのアポトーシス特性の形態変化が蛍光顕微鏡でも観察された。

Effects of GPM on caspase activity

細胞死の開始者および実行者として、システインプロテアーゼはアポトーシス過程で重要な役割を持つ（12）。図4に示すように、GPM処理によりカスパーゼ-3およびカスパーゼ-9活性が用量依存的に上昇したことから、GPMがHepG2細胞においてアポトーシス作用を有することが示唆されました。 5に示すように、GPMの投与により、ミトコンドリアから細胞質へのCyt cとAIFの放出が増加し、カスパーゼ-3とカスパーゼ-9の発現量が用量依存的に増加することがウェスタンブロットにより示された。このタンパク質の変化は、対照群と比較して有意に異なっていた（図6）（P <0.05）

Discussion

ここ数十年間、がんの発生率は著しく増加しており、人間の健康に深刻なダメージを与えている(13). 現代の治療戦略は明らかな抗がん作用を示しているが、依然として深刻な副作用が避けられない。天然薬物からペプチドを抽出し、がん治療に応用することは、世界的に広く報告されており、がん治療において有望視されています(14)。ペプチドは、腫瘍の増殖抑制、細胞周期の停止、腫瘍の血管新生の抑制、アポトーシスの誘導など、様々な役割を持つ可能性があります(15)。ヤモリは何百年もの間、漢方薬として広く利用されてきた。これまでの研究において、ヤモリの粗ペプチドはH22マウスおよびHepG2細胞株に対して有効な抗腫瘍活性を示しましたが（16,17）、ヒト肝細胞に対するGPMの作用はまだ明らかにされていません。そこで、本研究では、GPMがヒト肝細胞株HepG2においてアポトーシスを誘導する根本的な分子メカニズムをさらに明らかにすることを目的とした。

本研究では、MTTアッセイにより、GPMが用量および時間依存的にHepG2細胞の増殖を阻害することを明らかにした。さらに、この阻害はGPM処理によるものであり、典型的な形態変化を伴う用量依存的な細胞死を誘発することを実験的に示した。 Hoechst 33258染色を用いて、GPMがHepG2細胞に引き起こす細胞死はアポトーシスに属し、GPM処理後にカスパーゼ3とカスパーゼ9の発現レベルが増加することが明らかになった。また、ウェスタンブロッティングの結果、GPMはCyt cとAIFのミトコンドリアから細胞質への放出を促進したことから、GPMによるHepG2細胞のアポトーシスはミトコンドリアのアポトーシスパスウェイによって媒介されていることが示唆されました。この自己破壊的な細胞プロセスは、臓器の発達、組織のリモデリング、免疫調節、およびいくつかの疾患状態にとって重要である（19）。多くの抗腫瘍剤は、アポトーシスを誘導することにより治療効果を発揮する(20-24)。ミトコンドリアは細胞アポトーシスの制御に不可欠な役割を担っており、膜内には細胞アポトーシスと密接に関連する特定のタンパク質が存在します（25）。通常、AIFやCyt cタンパク質はミトコンドリアの膜間隙に存在するが、様々なAIFの作用により、ミトコンドリアから細胞質へ放出される。 AIFは最終的に核に移行し、アポトーシスの特徴的な変化を引き起こす。 AIFは、カスパーゼ非依存的な細胞死を媒介する最初のタンパク質として発見された(28)。 Cyt cは細胞質に放出され、カスパーゼ依存性アポトーシスを誘導し、カスパーゼの活性化とアポトーシスを引き起こす(29,30)。 AIFによって誘導されるアポトーシスはカスパーゼに依存しないが、AIF、カスパーゼ、Cyt cの間には相互作用、相乗効果、さらには拮抗作用が存在する。 7212>

カスパーゼはシステインプロテアーゼの一種で、アポトーシス経路の中心的な役割を担っている。アポトーシスの誘導はカスパーゼの活性化に関連している(31)。カスパーゼ3はアポトーシスの下流に位置し、カスパーゼ9はアポトーシス経路の頂点のカスパーゼである(32)。カスパーゼ-3の活性化はカスパーゼ-9の活性化と相関している(33)。Cyt cの放出は、アポプトソームの形成を介してカスパーゼ-9の活性化を引き起こす。その後、イニシエーターであるカスパーゼ9が活性化されると、エフェクターであるカスパーゼ3が切断され、DNaseが活性化されて核内のDNA断片化が引き起こされる(34)。つまり、カスパーゼ-3は実行型カスパーゼであり、Cyt cの細胞質への放出によるカスパーゼ-9の活性化を含む次のミトコンドリア経路によって活性化され（35）、最後にプログラムによる細胞死を引き起こすと考えられる。これらの結果は、GPM が肝細胞癌の治療薬となる可能性があることを示している。

用語解説

略語

略語。

GPM	gecko peptides mixture
Cyt c	cytochrome c

	Abrams P and Marsh JW: 肝細胞癌への現在のアプローチ。 Surg Clin North Am. 90:803-816. 2010.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	But DY, Lai CL and Yuen MF: Naturalhistory of hepatitis-related hepatocellular carcinoma. World JGastroenterol. 14:1652-1656. 2008. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Faivre S, Bouattour M and Raymond E.（フェーヴルエス、ブアトゥールエム、レイモンドイー）。肝細胞癌の新規分子療法。 Liver Int.31(Suppl 1): 151-160. 2011. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang TH, Bang JY, Kim MH, Kang IC, Kim HMand Jeong HJ: Atractylenolide III, a sesquiterpenoid, inducesapoptosis in human lung carcinoma A549 cells viamitochondria-mediated death pathway. Food Chem Toxicol. 49:514-519.2011. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liao N, Ao M, Zhang P and Yu L: Extractsof Lycoris aurea induce apoptosis in murine sarcoma S180 cells.Molecules.The Journal, 2011. 17:3723-3735. 2012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang YX, Gu XX, Geng D, Sun HY, Wang CM,Jiang GX, Hou XN and Ma CH: Differentiation of bel-7402 humanhepatocarcinoma cells induced by aqueous extract of fresh Gecko(AG) and its anti-tumor activity in vivo. All Rights Reserved. J Ethnopharmacol.155:1583–1588. 2014. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Song P: Wang XM and Xie S: 宋洙：Wang XM、Xie S: 新月桃凍結粉末がH22肝癌の血管新生を抑制するメカニズムに関する実験的研究. 中國中西怡傑和坐志． 26:58-62. 2006年(中国語)。中国消化器学会誌.14:2428-2431. 2006.
	Wu BD：食道腫瘍105例に対するヤモリの配合処方による治療. 中國中西經濟雜誌.19
	Song Y, Wang JG, Li RF, Li Y, Cui ZC, DuanLX and Lu F: Gecko crude peptides induce apoptosis in human livercarcinoma cells in vitro and exenograft model in the mouseascites H22 antintumor activity. J Biomed Biotechnol. 2012:7435732012.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cui CC: Research of antitumor effect of Gecko ethanol extract II. 河南科技大学. 2013.(In Chinese).
	Jiang CP, Ding H, Shi DH, Wang YR, Li EGand Wu JH: Pro-apoptotic Effect of tectorigenin on humanhepatocellular carcinoma HepG2 cells. World J Gastroenterol.18:1753-1764. 2012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	オレフソン S とモス SF: Obesity and relatedrisk factors in gastric cardia adenocarcinoma(胃腺癌の肥満とその危険因子). Gastric Cancer.18:23-32. 2015. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wang N, Tan HY, Li L, Yuen MF and Feng Y:Berberine and Coptidis Rhizoma as potential anticanceragents.日本におけるベルベリンとコプティディスリゾーマによる抗癌剤の開発。また、”beautiful “という言葉もある。 J Ethnopharmacol.176:35-48。 2015. 記事を見る : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Costantino VV, Lobos-Gonzalez L, Ibañez J,Fernandez D, Cuello-Carrión FD, Valenzuela MA, Barbieri MA, SeminoSN, Jahn GA, Quest AFおよびLopez LA.による論文。デヒドロロイコジンは、前臨床メラノーマモデルにおいて、細胞周期の停止、老化およびアポトーシスを誘導することにより、腫瘍の成長を抑制する。 Cancer Lett. 372:10-23. 2016.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Xu XL, Wang JG, Li RF, Li SP, Qiu XJ andDuan LX.を参照のこと。また、”李舜臣 “は、”李舜臣 “が “李舜臣 “を “李舜臣 “と呼び、”李舜臣 “は “李舜臣 “を “李舜臣 “と呼ぶ。中國倫荘瑤里雪澤志． 29:602-604. 2013.
	Song Y, Wang JG, Cui CC, Qian X, Li RF,Duan LX, Liu L and Xi SM: Apoptotic mechanism of gecko crudepeptides on human liver carcinoma cell line HepG2. 中医蔡.35:863-866. 2012.(In Chinese). PubMed/NCBI
	Lowe SW and Lin AW: Apoptosis in cancer.Carcinogenesis. 21:485-495. 2000. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bhatia D, Mandal A, Nevo E and Bishayee A:Apoptosis-inducing effects of extracts from desert plants in HepG2human hepatocarcinoma cells.Bishayee A., Bishayee A: Apoptosis-inducing effects of extracts from desert plants in human haperocarcinoma cells.Bhatia D, Mandal A., Nevo E and Bishayee A. Asian Pac J Trop Biomed. 5:87-92.2015. 記事を見る: Google Scholar
	Li CJ, Huang SY, Wu MY, Chen YC, Tsang SF,Chyuan JH and Hsu HY: Induction of apoptosis by ethanolic extractof Corchorus olitorius leaf in human hepatocellularcarcinoma (HepG2) cells via a mitochondria-dependent pathway.Molecules.HY: エタノールアミンによるヒト肝細胞癌細胞へのアポトーシス誘導。 17:9348-9360. 2012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang B, Wang YQ, Cheng RB, Chen JL, ChenJ, Jia LT, and Zhang RS: 楊斌氏：「Patrinia heterophylla bungeから抽出したisovaltrate acetoxyhydrinisolatedによるヒト胃癌細胞SGC-7901の細胞毒性およびアポトーシス誘導には、ミトコンドリア経路およびG2/M期細胞周期停止が関与していることがわかった。 Asian Pac J Cancer Prev.14:6481-6486. 2013. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim TM, Shin SK, Kim TW, Youm SY, Kim DJand Ahn B: Elm tree bark extract is inhibits HepG2 hepatic cancer cellgrowth via pro-apoptotic activity. J Vet Sci. 13:7-13. 2012.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Nho KJ, Chun JM and Kim HK: EthanolExtract of Dianthus chinensis L. in vitro in humanhepatocellular carcinoma HepG2 cells in apoptosis induces an epoptosis in the humanhepatocellular carcinoma. を、”Evid BasedComplement Alternat Med. 2012:5735272012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li L, Chen GG, Lu YN, Liu Y, Wu KF, GongXL, Gou ZP, Li MY and Liang NC:Ent-11α-Hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid inhibits growth ofhuman lung cancer A549 cells by arresting cell cycle and triggergeringapoptosis.No. Chin J Cancer Res.24:109-115。 2012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Cao MR, Li Q, Liu ZL, Liu HH, Wang W, LiaoXL, Pan YL and Jiang JW: Harmine induces apoptosis in HepG2 cells via mitochondrial signaling pathway. Hepatobiliary Pancreat DisInt. 2011. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I,Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, LoefflerM, et al: Molecular characterization of mitochondrialapoptosis-inducing factor.S., S., L., M.A.B.S.S.・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 17 Nature. 397:441-446. 1999. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R andWang X: Induction of apoptotic program in cell-free extract:Requirement for dATP and cytochrome c.Cell. 86:147-157. 1996.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Norberg E, Orrenius S and Zhivotovsky B:Mitochondrial regulation of cell death.Induced a apoptotic program: アポトーシス誘導因子（AIF）の処理。 Biochem Biophys Res Commun.396:95-100. 2010. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chandra D, Liu JW and Tang DG: Earlymitochondrial activation and cytochrome c up-regulation duringapoptosis.The Hardware of the Year of the Year of the Year of the Year of the Year of the Mitochondrial activation and cytochrome c up-regulation during theapoptosis.Chang DG. J Biol Chem. 277:50842-50854. 2002. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Zhang P, Xu Y, Li L, Jiang Q, Wang M andJin L: In vitro protective effects of pyrroloquinoline quinone onmethylmercury-induced neurotoxicity.In vitro protective effects. Environ Toxicol Pharmacol.27:103-110. 2009. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li LK、Rola AS、Kaid FA、Ali AM、AlabsiAM: また、”Goniothalamin induces cell cycle arrest and apoptosis in H400human oral squamous cell carcinoma: A caspase-dependent mitochondrial-mediated pathway with downregulation of NF-κβ.” （ゴニオタラミンは、H400ヒト口腔扁平上皮癌の細胞周期停止とアポトーシスを誘発する。 ArchOral Biol.64:28-38。 2016. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Li Y, Hu J, Huang H and He Y: Effect ofJinlong capsule on proliferation and apoptosis of human pancreaticcancer cells BxPC-3. J Tradit Chin Med. 33:205-210. 2013.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Du RH, Cui JT, Wang T, Zhang AH and TanRX: Trichothecin induces apoptosis of HepG2 cells via caspase-9mediated activation of the mitochondrial death pathway. Toxicon.59:143-150. 2012. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kang MH and Reynolds CP: Bcl-2 Inhibitors:targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy.日本癌治療学会誌(2012). ClinCancer Res.15:1126-1132。 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jin Q, Nan JX and Lian LH: Antintumoractivity of leaves from potentilla discolor on human hepatocellularcarcinoma cell line HepG-2. 中国Jat Med. 9:61-64. 2011.