Bisulfite sequencing

図3：メチル化特異的PCRに基づかないDNAメチル化解析方法。 バイサルファイト変換後、ゲノムDNAはメチル化配列と非メチル化配列を識別しないPCRで増幅される。 その後、利用可能な多くの方法を用いて、重亜硫酸塩変換の結果としてのアンプリコン内の変化に基づいて識別を行う。

Direct sequencingEdit

重亜硫酸塩処理したDNAを用いてメチル化分析を行う最初の報告方法は、PCRと標準ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定を利用して重亜硫酸変換に抵抗性のヌクレオチドが直接判明する方法であった。 プライマーは、鎖特異的であると同時に、目的のメチル化部位を挟む（ただし関与しない）重亜硫酸塩特異的（すなわち、非重亜硫酸塩処理DNAと相補的でないように非CpGシトシンを含む）プライマーを設計している。 したがって、メチル化特異的PCRとは対照的に、メチル化配列と非メチル化配列の両方を増幅することができる。 メチル化されていないシトシンの部位はすべて、増幅されたセンス鎖ではチミンとして、増幅されたアンチセンス鎖ではアデニンとして表示される。 PCRプライマーにハイスループットなシークエンスアダプターを組み込むことにより、PCR産物を超並列シークエンスで配列決定することが可能である。 また、PCR産物をクローン化して配列決定することも可能であり、その場合は多大な労力を要する。 Nested PCR法は、配列決定のために産物を強化するために用いることができる。

バイサルファイト処理したDNAを用いたその後のすべてのDNAメチル化解析技術は、Frommerらによるこの報告に基づいている（図2）。 他のほとんどの様式は真のシークエンスに基づく技術ではないが、「bisulfite sequencing」という用語は、一般に二重塩基変換DNAメチル化解析技術を表すためにしばしば用いられる。

PyrosequencingEdit

Pyrosequencingも、メチル化特異的PCRを使用せずに二重塩基処理したDNAを解析するのに用いられてきた。 目的の領域をPCRで増幅した後、パイロシーケンスを用いて、その領域内の特定のCpG部位のbisulfite変換された配列を決定することができます。 個々の部位のCとTの比率は、配列伸長中のCとTの取り込み量に基づいて定量的に決定することができる。 この方法の主な制限は、技術にかかるコストである。 しかし、パイロシークエンスはハイスループットなスクリーニング法への拡張を可能にする。 特にゲノムインプリンティング解析に有用である。

Methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA) Edit

この方法は、一塩基多型（SNP）解析で開発した一塩基構造多型解析（SSCA）法をベースにしたもので、一塩基多型の解析ができる。 SSCAは、サイズは同じだが配列が異なる一本鎖DNA断片を、非変性電気泳動における移動の差に基づいて区別するものである。 MS-SSCAでは、これを利用して、目的のCpG部位を含むバイサルファイト処理されたPCR増幅領域を区別している。 SSCAは1塩基の違いだけでは感度が悪いが、ビスルファイト処理ではほとんどの対象領域でCからTへの変換が頻繁に行われ、結果として感度は100%に近づく。 MS-SSCAでは、バンド強度の比からDNAのメチル化の程度を半定量的に解析することも可能である。 しかし、この方法は、個々のメチル化部位ではなく、対象領域のすべてのCpG部位を全体として評価するように設計されている。

高分解能融解分析（HRM）編集

二硫化物処理したDNAと変換されたものを区別するさらなる方法は、当初SNPを識別するために設計された定量PCRベースの手法である高分解能融解分析（HRM）を用いる方法である。 PCRアンプリコンの温度上昇と、その結果生じる融解時のインターカレート蛍光色素の遊離によって、直接分析する。 メチル化の程度は、アンプリコン中のC-to-Tコンテンツで表され、溶融の速度とそれに伴う色素の放出が決定される。

Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension (MS-SnuPE) Edit

MS-SnuPE は、当初一塩基多型を解析するために考案されたプライマー延長法を採用したものである。 DNAをbisulfite変換し、bisulfite特異的プライマーを目的のCpGの直前の塩基対までの配列にアニーリングさせる。 プライマーはDNAポリメラーゼの終止ジデオキシヌクレオチドを使ってC（またはT）へ1塩基対延長させ、CとTの比率を定量的に決定する。 当初、MS-SnuPEはプライマー伸長のレポーターとして放射性ddNTPsに依存していた。 また、蛍光を利用した方法やパイロシークエンスも利用可能である。 しかし、2つの多型プライマー伸長産物を区別するためのマトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間（MALDI-TOF）質量分析法は、本質的に、SNPジェノタイピング用に設計されたGOODアッセイに基づいて使用することが可能である。 イオンペア逆相高速液体クロマトグラフィー（IP-RP-HPLC）もまた、プライマー伸長産物を区別するために使用されている

塩基特異的切断/MALDI-TOFEdit

Ehrichらによって最近報告された方法は、塩基特異的切断のステップを追加して塩基変化から得られる情報を強化することによって、二硫化炭素変換をさらに活用するものです。 まず、目的の領域をRNAに試験管内転写することにより（最初の増幅でPCRプライマーにRNAポリメラーゼのプロモーター部位を加えることにより）、RNase Aを用いてRNA転写物を塩基特異的部位で切断することが可能である。 RNase Aはシトシンとウラシルのリボヌクレオチドで特異的にRNAを切断するので、シトシン特異的（C-特異的）な切断を望む場合は切断抵抗性のdTTPを、ウラシル特異的（U-特異的）切断を望む場合はdCTPを取り入れて塩基特異性を達成することができる。 切断された断片は、MALDI-TOFで解析することができる。 ビスルファイト処理により、増幅された逆鎖にC-U変換による切断部位の導入/除去、またはG-A変換によるフラグメント質量のシフトが生じる。 C-特異的切断は、すべてのメチル化CpG部位を特異的に切断する。 得られた断片のサイズを分析することにより、領域全体のメチル化の程度を決定するのではなく、領域内のCpG部位の特定のDNAメチル化パターンを決定することが可能である。 この方法は、ハイスループットなスクリーニングに有効であることを示し、複数の組織における多数のCpG部位をコスト効率のよい方法で調べることができる

Methylation-specific PCR (MSP) Edit

図4： Methylation-specific PCRとは、メチル化特異的プライマーにより二硫化炭素変換ゲノムDNA上の目的メチル化領域を識別増幅し検出する感度の高い方法です。 このようなプライマーは、メチル化され、したがって、重亜硫酸塩による変換に耐性のある5-メチルシトシンを含む配列にのみアニールすることになる。

このメチル化解析の代替法も、重亜硫酸塩処理したDNAを用いるが、関心領域の配列決定の必要性を回避することができる。 その代わりに、プライマーペアは、変換されていない5-メチルシトシンのみを相補する配列を含む「メチル化特異的」、あるいは逆に、メチル化されていないシトシンから変換されたチミンを相補する「非メチル化特異的」であるようにそれ自体が設計されている。 メチル化は、特異的プライマーが増幅を達成する能力によって決定される。 この方法は、プライマー中のCpG対の数が増えることでアッセイの特異性が高まるため、メチル化密度の高いCpGアイランドを調べるのに特に有効である。 また、CpGペアをプライマーの3’末端に配置することで、感度も向上する。 MSPを用いた最初の報告では、0.1％の対立遺伝子のメチル化を検出するのに十分な感度があると述べられている。 一般に、特定の遺伝子座のメチル化状態を調べる場合、MSPとその関連プロトコールが最も感度が高いと考えられている

MethyLight法はMSPをベースにしているが、定量PCRによる定量分析が可能である。 メチル化特異的プライマーを使用し、増幅領域にアニーリングするメチル化特異的蛍光レポータープローブも使用する。 また、配列内のCpGペアの識別が必要な場合は、メチル化特異性のないプライマーやプローブを設計することも可能である。 定量は、メチル化された参照DNAを基準として行われる。 このプロトコルに修正を加え、バイサルファイトに変換されたDNAのPCRの特異性を高める方法（ConLight-MSP）は、バイサルファイトに変換されないDNAにプローブを追加し、この非特異的増幅を定量するものだ

MSP-増幅DNAによるさらなる方法は、溶融曲線解析（Mc-MSP）によって生成物を分析する。 この方法は、メチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーの両方でバイサルファイト変換したDNAを増幅し、融解曲線解析で生じるピークの差分を比較して、2つの生成物の定量比を決定するものである。 特に低レベルのメチル化を高感度に検出するために、定量PCRと融解解析を併用した高解像度融解解析法が紹介されている

マイクロアレイベース法編集

マイクロアレイベース法は、バイサルファイト処理したDNAを解析できる技術を論理的に拡張し、ゲノム全体のメチル化解析に対応できるようになった方法である。 オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、目的のCpG部位を標的とする一対のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いて設計される。 一方はメチル化されていない配列に相補的であり、もう一方はC-U変換されたメチル化されていない配列に相補的である。 また、このプローブは、重亜硫酸塩によって不完全に変換されたDNAに結合しないよう、重亜硫酸塩特異的である。 イルミナメチル化アッセイは、このようなアッセイの一つで、マイクロアレイレベルでバイサルファイトシーケンス技術を適用し、ゲノム全体のメチル化データを作成するものである

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