Brainbow
3コピーの遺伝子コンストラクトにより、複数の蛍光体の色の組み合わせを発現させることができるようになった。 Lawson Kurtzら／Duke University
基本的なBrainbow1遺伝子コンストラクトです。 Lawson Kurtzら/デューク大学
ブレインボー技術は、Creリコンビナーゼというタンパク質がloxP部位間のDNAの反転または切除を駆動するCre-Lox組換えに依存しています。 Brainbow法にはBrainbow-1とBrainbow-2があり、それぞれ異なる形のcre/lox組換えを利用している。 2013年には、Brainbow-1を改良したBrainbow-3が開発されました。 すべての Brainbow サブタイプで、特定の XFP の発現は確率的、またはランダムなイベントです。
Brainbow-1 では、異なる蛍光タンパク質遺伝子 (XFP) を持つ DNA コンストラクトを、突然変異型および正規型の loxP で分離して使用します。 cre を介した組換えは同一の loxP 部位間でのみ起こるので、これは相互に排他的な切除の可能性のセットを作成する。 組換え後、プロモーターの直後に残された蛍光タンパク質は、一意に発現する。 したがって、3つの異なるloxP部位で区切られた4つのXFPを持つ構築物、3つの切除イベント、および元の構築物は、4つの異なる蛍光タンパク質を生成できる。
Brainbow-2 はCre切除と逆位を使用して、与えられた構築物で複数の発現可能性を可能にする。 2 つの逆向きの XFP を持つ 1 つの DNA セグメントでは、Cre がランダムな逆位現象を誘発し、1 つの蛍光タンパク質を発現に適した向きに残すことができる。 これらの逆位可能な配列のうち2つが並んでいる場合、3つの異なる逆位事象が可能である。
Brainbow-3はBrainbow-1のloxPフォーマットを踏襲し、RFP、YFP、CFP遺伝子をmOrange2、EGFP、mKate2で置き換えたものである。 mO2、EGFP、mK2は、蛍光スペクトルの重なりが少なく、配列の相同性も低いため、免疫組織化学的プロトコルで検出するための選択的な抗体の設計が可能になることから選択された。 Brainbow-3 はまた、神経細胞膜への輸送がより均一なファルネシル化 XFP の誘導体を使用することにより、XFP が神経細胞に不均一に充填されるという問題にも対処している
Brainbow は、Cre タンパク質を発現する系統と、複数のバージョンの loxP/XFP 構築物をトランスフェクトした系統の、2つのトランスジェニック生物株を交配して生体内に導入されます。 トランスジーンの複数のコピーを使用することにより、XFPが約100種類の色のうちの1つを与えることができるように結合することができる。
XFP の発現パターンの違いを可視化するために、脳のスライスを共焦点顕微鏡で撮影しました。 特定の励起波長の光子を照射すると、各蛍光体は信号を発し、赤、緑、青のチャンネルに集められ、得られた光の組み合わせがデータ解析ソフトウェアで解析される。
Brainbowはこれまで主にマウスでテストされてきたが、2007年に発表されたオリジナルの手法の登場以来、より最近の研究でも使用できるように上記の基本技術が修正されている。
MiceEdit
マウスの脳は75,000,000個のニューロンを持ち、ショウジョウバエやこの技術のモデルとしてよく用いられる他の生物、例えばC.A.B.C.よりも人間の脳に似ている。 elegansなどよりも人間の脳に近い。 マウスは、Brainbow法によるニューロイメージングに成功した最初の生物である。 Livetら（2007）は、上述のBrainbow-1とBrainbow-2を用いて2種類のBrainbowマウスを開発した。 これらの方法を用いて、マウスの筋肉の軸索の完全なマップを作成し、追跡するにあたっては、数万枚の画像を収集し、スタックにまとめて完全な模式図を作成する必要がある。
トランスジェニックマウスでBrainbow法を用いて調べた神経細胞の例としては、耳の筋肉を支配する運動神経、脳幹の軸索路、海馬の歯状回にあるものがある。
DrosophilaEdit
約10万個のニューロンからなるショウジョウバエの脳は複雑で、Brainbowのような神経生理学および神経科学の技術を実装するための優れた候補となります。 実際、Stefanie Hampelら（2011）は、Brainbowを遺伝子ターゲティングツールと組み合わせて、ショウジョウバエの脳内の個々のニューロンやさまざまなニューロン系譜を特定しました。 遺伝的ターゲティングツールの1つは、UAS-Brainbowの発現を制御し、ニューロンの小グループに発現をターゲティングするGAL4/UASバイナリ発現システムであった。 Flip Out」法を利用することで、レポーター構築物の細胞分解能を向上させた。 蛍光タンパク質の発現は、オリジナルのBrainbowと同様に、マッチしたlox部位に対応するCre組み換えに依存した。 Hampelら（2011）は、内因性蛍光ではなく、エピトープの抗体標識に基づくBrainbowの独自のバリエーション（dBrainbow）も開発した。 彼らのコンストラクトの2つのコピーから、明るく分離可能な6色が得られる。 これにより、色の割り当てを単純化することができ、長距離にわたって各ニューロンの軌跡を観察することが可能になった。 特に、運動ニューロンを触角葉から神経筋接合部まで追跡し、個々のニューロンの標的筋を特定することができました。
結局、この技術はショウジョウバエのニューロン回路を効率的にマッピングする能力を提供し、研究者がこの無脊椎動物の脳構造とそれに伴う行動との関連について、より多くの情報を明らかにできるようにするものでした。