Current applications of antibody microarrays

抗体マイクロアレイのユニークな性能とバイオメディカルプロジェクトへの適用性から、一連の異なる抗体マイクロアレイが開発され、そのいくつかは商業的に利用できるようになっています。 ここでは、過去7年間の代表的な研究を集め（表1）、その概要をプロジェクトの焦点に応じて、基礎生物学主導型と臨床研究の2つのパートに整理している。 抗体マイクロアレイの最近の応用をすべて網羅することは現実的に不可能であるため、ここでは、臨床的に重要な意義を持つ知見や関心の高いと思われる応用に焦点を絞っている。

基礎研究

シグナル経路関連

シグナル経路における変化は、がん、糖尿病、神経変性疾患など多くの疾患状態の特徴であるとされています。 シグナル伝達カスケードのタンパク質を標的とした捕捉試薬を用いて抗体アレイを構築することにより、正常な生物学的プロセスや疾患状態におけるタンパク質プロファイルの変化やシグナル伝達経路の変化を調査することが可能になりました。 研究者たちはこのコンセプトを、細胞溶解液、組織抽出物、血漿など、さまざまな生体試料材料や調製物に応用しています。

Calbindin-D28 k (CB) は、カルシウムの緩衝剤として働く重要なカルシウム結合タンパク質で、アルツハイマー病のマウスやヒトの脳で発現レベルが低くなることがわかっていますが、この変化がAD関連の機能障害（AD）に寄与するかはわかっていません。 Kookらは、CB欠損アルツハイマー病トランスジェニックマウス（CBKOTg）を作製し、ADのシグナル伝達経路におけるCBの寄与を検討した 。 抗体マイクロアレイを用いてマウスの脳組織を調べたところ、CB欠失により細胞死経路、シナプス伝達、MAPKシグナル伝達経路に著しい変化が生じることが確認された。 これらの知見は、アポトーシスマーカーの増加や神経細胞死の増加を示した免疫組織化学によって検証され、抗体マイクロアレイが新しい情報を提供し、AD病態生理学におけるCBの役割とその関与についての理解を深めることができることを実証した

抗体マイクロアレイは、伸長因子4などの高度に保存されたタンパク質における生理学的役割を明らかにするために用いられてきた。 Gaoらは、phospho-explorer抗体マイクロアレイを用いて、品質管理因子であるミトコンドリア伸長因子4（mtEF4）の翻訳における機構を明らかにした。 mtEF4ノックアウトマウスとWTマウスの精巣組織のライセートを比較したところ、様々なシグナル伝達経路の中でmTORのfold enrichmentが最も高いことを見出した。 著者らは、mtEF4欠損により、体細胞質からの主要なフィードバックシグナルがmTORのアップレギュレーションであることを明らかにした。 これは、細胞質翻訳の増加を伴うことから、mTORがミトコンドリア翻訳不足を補う下流エフェクターとして重要な役割を担っていることを示している 。 さらに、本研究では、ミトコンドリアにおけるmtEF4依存の品質管理と細胞質におけるmTOR経路の間のこれまで記述されていないクロストークを関連付けた。 多くの可能性のあるアプリケーションの中で、腫瘍による血管新生は、癌の進行に極めて重要な役割を果たすため、研究されています。 PDZ 結合モチーフ (Ser-Asp-Val) を持ち、インテグリン αvβ3 に高い親和性を持つ新規ペプチドリガンド P11 を、抗体マイクロアレイを用いたヘキサペプチドライブラリ (PS-SPCL) から同定した。 P11 の薬理学的メカニズムは、48 の癌関連抗体を含む特別にデザインされたファーマコプロテオミクスマイクロアレイアプローチを用いて解明された。 その結果、P11は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼおよび細胞外シグナル制御キナーゼの阻害を介して、bFGF誘発ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。 また、マイクロアレイ解析により、P11 はアポトーシスマーカーである p53 の発現を上昇させ、カスパーゼ系の活性化を介してアポトーシスを誘導することが明らかになり、P11 が腫瘍進行の抑制に重要な役割を果たす可能性が示された。 P11とp53の関連は、臨床および基礎のがん研究者に提示され、P11の役割とその阻害標的に関するさらなる手がかりを解明するのに役立つだろう。

ロバスタチンはAspergillus terreusまたはMonascus ruber由来の天然物で、コレステロール低下薬として広く臨床で使用されてきた。 Yangらは，異なる機能的細胞経路に着目した656の抗体を含む抗体マイクロアレイを用い，ロバスタチンが，定義されていないメカニズムで抗がん作用も有することを示唆した。 効果的ながん治療法の発見とその作用機序の解明が強く求められています。 マイクロアレイを用いて、乳がん細胞を低酸素条件下で研究し、ロバスティンがその効果を発揮する分子メカニズムを調べました。 その結果、ロバスタチン処理乳がん細胞では、コントロールと比較して、17種類のタンパク質の発現が増加し、20種類のタンパク質の発現が減少していることが示され、その結果は、リアルタイムPCRによって検証された。 このタンパク質シグネチャーには、アポトーシス、細胞増殖、腫瘍転移に関与するタンパク質が含まれており、これらの経路の調節をロバスティンの薬理作用に結びつけました。 Leeらは、細胞周期関連分子を研究するために構築された抗体マイクロアレイを用いて、新規メトホルミン誘導体の効力を調査した。 その結果、metformin-butyrate（MFB）はmetformin-HClよりも抗腫瘍活性が高く、S期およびG2/M期の細胞周期進行を阻害する効率が高いこと、さらに乳癌幹細胞集団に対して優先的に細胞毒性を発揮することが示された。 これらの知見は、抗体アレイが、より有効な薬剤の開発をサポートするプロテオミクス的証拠を提供できることを強調しています。

基礎生物学研究において、抗体マイクロアレイは、シグナル伝達タンパク質や特定の表現型に関連するタンパク質を検出するのに役立つことがあります。 並列にタンパク質を検出するアレイは、1回の実験で複数のシグナル伝達経路を調べる機会を作り、病気の進行、薬物相互作用、感染症への反応などの研究など、新しいメカニズムへの洞察を提供します。 タンパク質は細胞プロセスの大部分に関与しているため、タンパク質解析は生物学的な疾患シグネチャを提供し、細胞、器官、システムの現在の状態に関する詳細な洞察を生み出す可能性があります。 抗体マイクロアレイは、健康時および疾病時の生物学的プロセスの変化をリアルタイムでガイドすることができます。 このセクションでは、抗体マイクロアレイが、主に血清および血漿サンプルの分析において、臨床コホートの調査にどのように使用されているかを例証します。 臨床研究における抗体マイクロアレイのすべての側面を網羅することは不可能であるため、ここでは最も重要ないくつかの疾患、すなわち自己免疫疾患、感染症、がんおよび神経変性疾患のみに焦点を当てる。 Linらは、疾患活動性の異なる60人のSLE患者、25人の関節リウマチ患者、28人の他の自己免疫疾患サンプル、24人の健常対照者の末梢血単核細胞を用いて、DotScan™抗体マイクロアレイ・スクリーニングを実施しました。 抗体マイクロアレイプロファイルは、活動性のSLE患者を健常対照者と区別することができました。 白血球捕捉アレイを用いることで、従来のSLE診断の識別能力を向上させました。血清抗dsDNA、補体C3、C4を確認することで、マイクロアレイは半活動性と活性SLEの識別能力を高め、より良い疾患管理を支援する情報となりました。 この研究では、全身性硬化症（SSc）、SLEの患者および15人の健康なボランティアについて調べた。 SScは連結組織を侵す自己免疫疾患で、SLEとの鑑別診断が困難な場合がある。 このアレイは、SLEとSScの重症度を区別するためのプロテオームシグネチャーの候補となる、40種類の異なる発現タンパク質を同定しました。 このタンパク質シグネチャーは、ANA、抗DNA、SLEDAI-2 k、C1q、C3、C4、CRPといった従来の臨床パラメータの単独あるいは組み合わせよりも優れた疾患分類となり、抗体マイクロアレイが疾患管理に臨床価値を付加する新しい疾患シグネチャーを作り出す可能性を示している。 ヘリコバクター・ピロリは、世界人口の約半数に感染し、慢性胃炎を引き起こす病原体である。 Sukriらは、DotScan抗体マイクロアレイを用い、胃がんにおける腫瘍細胞に対する免疫系の耐性を調べるため、144種類のCD抗体を用いて、ヘリコバクター・ピロリ感染胃腺がん細胞と非感染胃腺がん細胞のCDマーカーの分布をプロファイリングしました。 興味深いことに、cagA + H. pyloriに感染した胃腺がん細胞株AGSでは、T細胞集団の維持に不可欠なCD27の発現が増加しており、H. pylori感染胃がん患者においてもCDマーカーの増加が検出された。 この研究は、胃がんに対する免疫系の耐性だけでなく、異なるH. pylori株によって利用される免疫応答のバリエーションを示唆している。

さらに、抗体アレイは、疾患の状態や治療・介入に対する反応など、生理的環境の継続的な変化を追跡するのに有用である。 肝移植後、94％の患者にC型肝炎ウイルス（HCV）による組織損傷が見つかり、一部の患者は重度の疾患再発に苦しんでいます 。 そのため、再発を予測するバイオマーカーの開発が急務となっています。 CD抗体マイクロアレイを用いて、移植前、移植初期、中期、後期と定義した患者の末梢血から、移植後のHCV再発の重症度を予測するための調査を行った。 肝移植前後の患者から採取した連続した血液サンプルは、独自の内部コントロールにより、疾患環境を追跡することができました。 5つのCDマーカー（CD27、CD182、CD260、CD41、CD34）は軽度の再発に比べ、重度の再発で有意に増加した。 この結果は、抗体アレイが肝移植後のHCV再発重症度評価に役立つことを示している。

Ellmarkらは、胃腺癌のn-CoDeRライブラリから選択した免疫制御抗原に対する127種類の抗体を含む単一フレームワーク組み換え抗体（SinFabs）マイクロアレイを考案した。 その結果、IL-9、IL-11、MCP-4など、腫瘍および感染症に関連するタンパク質発現シグネチャーが血漿プロテオームから同定され、バイオマーカーとなり得ることが明らかになった。 これらの知見は、H-ピロリによる癌の理解を深めるのに役立ち、将来的に洗練された診断への道を開くかもしれません。

マラリアとマラリア関連合併症に苦しむ子供の血漿中のタンパク質プロファイルの違いを調べるために、ビーズベースの抗体アレイが実施されました。 1000個のタンパク質をスクリーニングした結果、41個のタンパク質がマラリア感染児と地域対照児の間で発現の差があった。 さらに 13 種類のタンパク質が、マラリアの重症度と関連していた。 また、筋肉タンパク質のうち2つ（炭酸脱水酵素3とクレアチンキナーゼ）に大きな変化が見られ、脳マラリアの子供たちの筋肉の損傷や病変が示唆されました。 これらの知見は、マラリア感染児を重症化するリスクの高いグループに分類するための簡単な検査の開発に役立つと考えられます。 膵臓がんは予後不良の進行性疾患であり、早期かつ正確な診断を可能にする疾患特異的なバイオマーカーが急務となっています。 Wingrenらは、自社開発の組み換え抗体マイクロアレイプラットフォームを用いて、膵臓がん、慢性膵炎、自己免疫性膵炎（AIP）、健常対照者の148人の血清のスクリーニングを行った。 その結果、IL-2、IL-11、IL-12、TNF-を含む25のタンパク質が膵臓癌と健常者の鑑別に寄与することが明らかになりました。 この25のタンパク質シグネチャーは、高い診断能を有している（AUC 0.88）。 さらに、このグループは、最近、リンパ腫、前立腺癌、乳癌などの細胞溶解液や血漿などのサンプルセットに、このパネルの分析を拡張しました。 これらの知見は、新規の多変量診断法の開発に役立つものです。

がん生物学における最も重要な問題の1つは、腫瘍の浸潤性を判断することです。 ある研究では、膵管腺癌（PDA）モデルマウスの前浸潤性疾患から浸潤性疾患にわたる血漿サンプルを調べるために、4096の特徴を含む抗体マイクロアレイのプラットフォームをカスタマイズして開発しました。 彼らは、ERBB2、TNC、ESR1の3つのタンパク質の発現差からなるタンパク質シグネチャーを発見し、これを用いて、PDAマーカーCA19-9を含む場合のAUCを0.86 (95% 信頼区間 0.76-0.96) から 0.97 (95% CI 0.92-1.0) に改善できた。

新しく診断された膀胱癌は大部分が低ステージの低グレード、筋侵入性ではありません . 標準的な経尿道的切除後、50～70％の腫瘍が再発するが、10～30％の腫瘍が筋層浸潤性疾患へ進行する 。 腫瘍の進行のメカニズムを理解することで、より有用な情報を臨床の場に提供することができる。 Srinivasanらは、Hoheisel研究室によって構築された810の癌関連抗体を含む抗体マイクロアレイを用いて、細胞溶解液を研究した。 著者らは、20のタンパク質を含む多変量解析法を構築し、感度80％、特異度100％で再発を予測することを可能にした。 興味深いことに、彼らは再発癌においてTGF-βシグナル伝達経路が抑制されていることを見出した。 シグナル伝達因子IFNG、TNF-α、THBS1の発現量は少なく、阻害因子MAPK3（ERK1としても知られる）の存在量は多く、SMAD2、SMAD3、SMAD4は再び著しく発現量が低下していた . このデータは、TGF-βシグナル経路の阻害剤が膀胱癌の再発を抑える可能性を示している。

Puig-Costa らは、抗体マイクロアレイを用いて胃癌（GC）のバイオマーカーを発見した。 注目すべきは、抗体マイクロアレイが、120のサイトカイン、43の血管新生因子、41の成長因子、40の炎症因子、10のメタロプロテアーゼなど、癌の進行に重要な役割を果たす、よく知られた機能性タンパク質を標的とする抗体を含んでいることである。 ICAM-1やangiogeninなどのバイオマーカーは、GC患者において高い炎症反応を示すことが、Ingenuity Pathway解析により確認された。 また、単球走化性タンパク質（MCP）-1などの細胞運動や免疫細胞輸送のターゲットが、GC患者において過剰に発現していることが明らかになった。 この検証コホートにおける陽性予測値および陰性予測値は、それぞれ75％（95％CI 53-90）および80％（95％CI 56-94）であった。 最後に、GCに関連する炎症性プロテオームの抗体マイクロアレイ解析により、GCと非がん性胃粘膜を正確に識別する21タンパク質の炎症性タンパク質駆動型胃がんシグネチャー（INPROGAS）が特定され、がんの進行解析のための新たな手がかりとなる可能性がある＜6842＞＜9538＞前立腺がんにおいて、Schwenkらは前立腺特異抗原（PSA）と並ぶ追加バイオマーカーの探索のためにサスペンションビーズアレイ上の抗体アレイを用いて異なるグループの血漿タンパク質のレベルを比較検討した。 彼らは、PSAに基づく患者の分類に加えて、血漿中のCNDP1レベルの低下を確認し、その後の大規模な研究において、このことがより侵攻性の高い病態に関連していることが示された。 サンドイッチ免疫測定法が開発され、1200人以上の患者さんでこの知見が検証され、CNDP1の低下とリンパ節転移の関連がさらに明らかにされました。 これは、抗体マイクロアレイのパイプラインと標的アッセイの開発を通じて、最初の適応症の検証に成功した数少ない研究の1つであることを実証しています。 Darmanisらは、小腸神経内分泌腫瘍の研究において、2つの独立した研究セット（77および132サンプル）の血漿レベルを調査し、124の固有のタンパク質について標的ビーズアレイを使用しました。 彼らは、タンパク質のパネルを使用して85％までの分類精度を達成し、腫瘍を分類するための新しい候補を提案することで結論付けた。 IGFBP2やIGF1など、最終候補の中から、研究グループはELISA法を用いて適応を確認した。 これらの知見は、血漿タンパク質とがんとの代謝的な関連性を示し、今後のがん研究においてこれらのターゲットを考慮することを支持するものである。

神経変性疾患

タンパク質発現の解析は、神経変性病態生理に関する現在の知識を拡張する可能性を与える。 プロテオミクス分野の最近の進歩により、抗体マイクロアレイを用いた新規バイオマーカー探索の可能性が出てきた。 プロトコール開発の進歩により、血液だけでなく脳脊髄液（CSF）も研究できるようになりました。

神経プロテオミクスにおいて、Nilsson 研究所は Human Protein Atlas の抗体とサスペンションビーズアレイアッセイを使用していくつかの研究を行いました。 多発性硬化症（MS）患者のCSFをプロファイリングし、神経細胞の形成と再生に関与する細胞質タンパク質であるGAP43を発見し、脳の疾患に対する有望なバイオマーカーとなった。 さらに最近、Remnestålらは、異なる神経変性疾患サンプルセットから収集した441のCSFサンプルと、死後に収集したCSFのタンパク質レベルを比較しました。 376の抗体のうち、シナプスタンパク質であるGAP43とNRGNは、対照群と比較してAD患者との関連があることがわかった。 その結果，CSFと血漿でMSのサブタイプに関連する一連のタンパク質が発見された。 IRF8、IL7、METTL14に対する候補抗体のいくつかは、脳組織の免疫蛍光分析にも使用され、MS病変の近傍の神経細胞が染色されることが示された。 このことは、体液の分析のためのアレイベースのアッセイから選択された抗体が、患部組織でさらなる証拠を提供できることを示している。

最後に、ビーズアレイは、筋萎縮性側索硬化症（ALS）に苦しむ患者の血漿のプロファイルに用いられ、ALS患者367人とコントロール101人が、278のタンパク質について分析した。 この研究では、ニューロフィラメント媒体ポリペプチド（NEFM）、ソルートキャリアファミリー25（SLC25A20）、およびGタンパク質シグナル伝達調節因子18（RGS18）を、疾患の病態生理に関連するプロセスに関与していることから貴重なタンパク質として提案し、独立サンプルセットでのさらなる検証を保証する、と結論付けています

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