Cytotoxic and Genotoxic Effect of Acephate on Human Sperm

Abstract

有機リン系農薬（OPs）の大量使用は精子形成の異なる段階で精液品質と精子DNAに変化を与える可能性がある。 アセフェートは毒性の高い有機リン系殺虫剤であり，ヒトの精液の品質と精子DNAの完全性に及ぼす影響を評価することを目的とした。 健康な男性から採取した精子を0、50、100、200μg/mLのアセフェートに曝露し、1時間、2時間、3時間培養した後、精子の運動性、活力、細胞膜の機能的完全性、精子の受精能、およびDNA損傷を調査した。 その結果、100μg/mLでは3時間後、200μg/mLでは1時間後、2時間後、3時間後に運動性が著しく低下し、200μg/mLでは2時間後、3時間後に生存率が有意に低下した。 同様に、精子の受精能は200μg/mLでは1時間後、2時間後、3時間後、100μg/mLでは3時間後に有意な影響を受けた。この研究は、アセフェートへの曝露が精子の構造と機能の変化をもたらし、ヒト精液品質の劣化を引き起こし、不妊を誘発する可能性を示唆している。 はじめに

過去数十年にわたり、人工化学物質やその他の有害物質によって、動物やヒトの生殖機能が破壊されることが、いくつかの研究で示されてきました。 しかし残念ながら、環境暴露がヒトの生殖健康に及ぼす影響について体系的に取り上げた研究は比較的少ない。 最近の研究によると、不妊症（避妊をしない性交渉を12ヶ月続けても妊娠しないこと）に悩むカップルは、全世界で毎年約6000万〜8000万人にのぼると言われています。 男性不妊症の98％は、主に精子の質の低下に起因していると言われています。 しかし、不妊症は特発性とみなされることもあり、農薬を含む環境内分泌撹乱物質などの危険因子の結果である可能性もある。

有機リン酸系農薬はリン酸とチオリン酸のエステルで、その毒性はアセチルコリンエステラーゼの働きを阻害し、神経接合部にアセチルコリンを蓄積することに関係していると言われてきた。 有機リン酸系農薬（OPs）への曝露と不妊症、先天性欠損症、妊娠障害、周産期死亡などの生殖障害との関連は、多くの疫学研究で認識されている … 続きを読む 有機リン系農薬は、脳内アセチルコリンエステラーゼ活性を低下させ、下垂体性腺刺激ホルモンに影響を与え、不妊症の原因となる生殖機能を変化させると疑われている。 精液の質に対する影響は、精子濃度、運動精子率、正常な形態を持つ精子率などのパラメータと精子の運動パラメータによって評価することができる。 いくつかの研究により、OP に曝露された男性は、精子濃度の低下、精子運動性の低下、精子数の減少、精子の性染色体異数性の増加などの精液パラメータの異常を発症するリスクが高いことが明らかにされている. 中国で実施された異なる OP を用いた研究では、新婚男性において、尿中の殺虫剤代謝物の存在と精子濃度および精子運動率の間に明確な関係があることが示された。 スリランカで広く使用されている毒性のある OP のうち、アセフェート (O,S-dimethyl acetylphosphoramidothioate) は殺虫剤で、その幅広い殺虫特性から農業や家庭で使用されています。 アセフェートは、接触性と健胃性を併せ持つ全身性の殺虫剤です。 アセフェートの毒性メカニズムは、アセチルコリンエステラーゼ（AchE）阻害だけでなく、遅発性神経毒性物質として作用することに起因している。 Sing と Jiang は、アセフェートが強力な神経毒性、変異原性、発がん性、細胞毒性を持つ化合物であると報告している。 同様に、Farag らは、14 および 28 mg/kg/day のアセフェート投与により、成体雄マウスの精子運動性および精子数が減少することを明らかにした。 また、別の 2 つの研究により、アセフェートは雄のアルビノラットの生殖能力、精子動態、性器重量および性ホルモンを有意に減少させることが確認された。 したがって、他のOPsと同様に、この化合物にはヒトの生殖に関する健康への潜在的リスクがあります。

アセフェートは、生殖年齢の高いスリランカの農業従事者によって広範囲に使用されています。 過去20～30年の間に、農薬への職業的暴露が男性の生殖能力に影響を与える可能性があることが明らかになったため、これらの若い生産者の暴露リスクが高いことを示しています。 農薬の規制は主に動物モデルに基づいており、ヒトの曝露と精液の質に関するデータは依然としてまばらで限られている。 そこで、本研究では、アセフェートがヒトの男性生殖能力および精子細胞のDNA完全性に及ぼす影響をin vitroで調べた。 材料と方法

2.1. 試験材料

未配合のアセフェート（商品名：サレンダー、分子式：Acephate: C4H10NO3PS; 分子量: 183.16 g/mol; 純度: 99.0%; メーカーによる現場での推奨投与量: 1gのアセフェートを1Lの水に投入）は、Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lankaから入手した。 アセフェートはBiggers Whitten Whittingham（BWW）に容易に溶解するため、これを対照とした

2.2. 精液の採取と調製

精液サンプルは、スリランカ、スリジャヤワルデネプラ大学の健康な男性（年齢20〜30歳）ドナーから、無菌の検体瓶に採取された。 精液採取に先立ち，ドナーには情報提供書と研究参加への意思を問う同意書が渡された。 すべての参加者は、精液採取の3～5日前から性行為を控えるよう求められた。 精子濃度、運動率、形態、粘度、液化時間、pHが正常で、未熟な形態や白血球が存在しない男性（平均年齢）が研究に選ばれた。 精子パラメータ（運動性、活力、低浸透圧膨潤試験、形態）は、WHOのガイドラインに従って評価された。 アセフェートの影響は、異常な精子で拡大する可能性があるため、研究のために許容できる精子の質のドナーを選択することが重要です。

倫理審査委員会、スリジャヤワルデネプラ大学、ヌゲゴダ、スリランカで倫理承認（倫理的許可番号: 712/13）を得ました

2.3. 用量レベルの決定

用量レベルを決定するために、精子運動性に対するアセフェートのLD50値を実施した。 したがって、アセフェートの推奨現場投与量(水1Lにアセフェート1g)に相当するBWW1mLにアセフェート1mgを添加した試料を調製した。 調製した試料は、その後BWWで希釈し、異なる濃度のアセフェートを得た。 精子懸濁液（50×106精子/mLに固定）をエッペンドルフチューブに入れ、所望量のBWWまたは試験溶液を加えた（チューブの最終容量は1 mLに等しい）。 試料を十分に混合した後、加湿インキュベーター（三洋電機株式会社、東京、日本）内で37℃、5% CO2で1時間インキュベートした。 培養後，位相差光学系付きオリンパス顕微鏡（X 400; Olympus Corporation, Japan）下で，独立した2人の観察者により，各濃度における精子の運動率を測定した． この試験的な調査により、アセフェートのLD50値は200μg/mLであることが明らかになった。 そこで、本研究ではLD50値を含むLD50以下の亜致死濃度を用いた。

以下に本研究で選択した用量レベルを示す。 高用量：200μg/mL(LD50値相当)。 中用量：100 μg/mL。 さらに、アセフェート曝露の長期的影響を調べるために、時間点を1時間から2時間、3時間に延長することにした

2.4. 農薬インキュベーション

新鮮な精液サンプル()をBWWで希釈し、最終精子濃度を40×106精子/mLとした。 その後、サンプルは50、100、200μg/mLの濃度の農薬、またはBWWでインキュベートされた。 インキュベーター（三洋電機株式会社、東京、日本）において、最終容量1mLで、37℃、5％CO2、95％O2雰囲気で1、2、3時間インキュベートした

2.5. 精子運動性の測定

位相差光学系（X 400; Olympus Corporation, Japan）下で、独立した2人の観察者により全運動性精子（約100細胞）を推定した。 前方運動率（Percentage Forward Motility）を算出した。 細胞毒性アッセイ

精子の生存率をエオシンY染色法を用いて評価し、死精子と生精子を算出した。 生存率＝（総細胞数-染色数／総細胞数）×100。 総細胞数＝100.

2.7. 精子形質膜の機能的完全性の決定

精子形質膜の機能的完全性は、Jeyendranらによって記載されたHyposmotic Swelling（HOS）テストを使用して評価した。 少なくとも100個の精子がカウントされた

2.8. 容量測定

150μLのBWW培地をあらかじめ温めた培養皿（35×10mm、コーニング、ニューヨーク、アメリカ）に入れ、あらかじめ温めた22×22mmのカバースリップで覆った。 20μLの精子サンプルのアリコートをカバースリップの一角に添加した。 培養皿を、37℃で平衡化された恒温制御空気加熱キャビネット（Nikon, London, UK）を備えた倒立顕微鏡（Diaphot, Nikon, London, UK）内に設置した。 精子の受精能の状態は、Olympus IX71位相差顕微鏡を用いた対物写真法により、過活性化に基づいて評価した。 過活性化は鞭毛現象であるため、精子の運動性から過活性化を視覚的に評価することが可能であり、非過活性化精子と過活性化精子を列挙するために鞭毛運動パターンを評価した . 実験は二重に行い、独立して4回繰り返した。 精子におけるDNA損傷の測定

洗浄した顕微鏡用スライドに精子標本を作成し、蛍光顕微鏡（BH-2、オリンパス株式会社、日本）で490nmを励起して500個の精子を数えることにより、正常DNAを持つ精子の割合を決定した。 1フィールドの観察時間は40〜50秒以内であった。 黄色から赤色を示す精子を変性DNA、緑色を示す精子を正常DNAとした。 統計解析

成人男性の精子数は正規分布であり、農薬の主効果についてMinitabソフトウェアパッケージ（Minitab Co.、米国）を用いた二元配置分散分析（ANOVA）で群間比較を行った。 有意な処理効果が認められた場合、個々の群間平均の差は “Tukey 95%” で検定した。 データは平均値±標準誤差平均値（SEM）で表した。 値は.

3 とした。 結果

3.1. 精子運動率

コントロールと比較して、中用量（100μg/mL）では3時間培養後に運動率が16％有意に（ ）に低下した（表1）。 一方，200μg/mLでは，1時間後，2時間後，3時間後にコントロールと比較して極めて有意な（）減少が記録された。 さらに、インキュベーション時間の増加に伴い、各投与量において運動性の低下が明らかである。

3.2. 細胞毒性

全ての処理群で時間とともに生存率が低下したが（表1）、200μg/mL（高用量）では対照群と比較して培養後2時間後に有意な低下（20％）が記録された。 3時間培養後、高用量で非常に顕著な減少（）が記録され、コントロールと比較して31％減少した

3.3. 精子細胞膜の機能的完全性

表1は、1時間、2時間、3時間培養後の精子細胞の機能的完全性の結果を示したものである。 機能的完全性の有意な減少（）は、13の中用量で記録された。5％、高用量では2時間後に26％であった。 高用量では3時間後に35％の減少を記録した。 精子容量

すべての処理群で容量減少が認められた（表1）。 100μg/mL投与では3時間培養で18％、高用量では1時間、2時間、3時間培養でそれぞれ32％、36％、38％と有意に減少した（）

3.5. 精子におけるDNA損傷

DNA損傷精子数の割合は、投与量および培養時間の増加とともに増加した。 しかし、DNA損傷の有意な増加は、3時間の培養後、高用量（33％）でのみ記録された。 結果は表1にまとめた。 議論

OP 殺虫剤はスリランカで広範囲に使用されているが、使用者による保護はほとんどなく、個人は高い曝露リスクにさらされている。 さらに、これらの農業従事者は生殖年齢にあるため、必然的に長期間にわたって曝露されることになる。 本研究は、OPであるアセフェートと精液の品質、および異なる培養時間における精子のDNA損傷との関連性を実証するために企画されたものである。 本研究で得られた結果から、アセフェートは精子の運動性、精子生存率、膜の完全性、精子受精能を損ない、in vitroでDNA損傷を誘発することが示唆された。 同様の結果は、塩素化炭化水素、有機リン酸塩、ベンゼン代謝物でも得られた。

アセフェートの中用量（100 μg/mL）および高用量（200 μg/mL）の両方で認められた精子運動の著しい低下は、精子受精能力の障害をもたらすと思われた。 最高用量に3時間暴露した後、精子の運動率はWHOが推奨する値よりも低下していた。 精子運動率は、精子の細胞毒性および精子受精能の低下に関する最も敏感な検出器の 1 つであると考えられている。 様々な農薬によるミトコンドリア膜電位の変化は、精子運動性の低下につながる可能性がある。 精子の運動性はミトコンドリアの酸化経路で生じる激しい変質とエネルギー消費に依存しており、農薬は酸化経路を妨害して精子運動の遅延を引き起こし、最終的に細胞死を引き起こす可能性がある。 さらに、農薬の代謝物はミトコンドリアの酸化反応を阻害し、過剰な活性酸素種（ROS）の産生を引き起こし、ATPの産生を減少させ、運動障害を引き起こす可能性がある。 酸化ストレスは、アセフェートを含む有機リン酸塩の毒性の主要なメカニズムであると報告されている。 酸化ストレスは、アセフェートなどの有機リン酸塩の毒性発現の主要なメカニズムであることが報告されている。 このような膜の損傷が、射精後の精子の運動性や生存率の継続的な低下の原因となっている可能性がある。

生存率とは、細胞や膜の完全性の評価によって決まる生きた精子の割合のことである。 エオシン染色検査は精子膜の構造的完全性に関する情報を提供し、HOS検査は精子膜の機能的完全性に関する情報を提供している。 精子の生存率は、無傷で、機能的で、半透過性の細胞膜と関連している。 農薬はカルシウムイオンの上昇を誘発し、精子膜に損傷を与えるため、卵母細胞に到達するよりもずっと前に精子の生存率に影響を与える可能性がある。 本研究で観察された細胞膜の変化は、精子の運動性、生存性、膜の完全性の低下をもたらす可能性がある。

高活性化は、精子が受精を完了したことを示すもので、卵丘と透明帯を通過するために不可欠である。 本研究では、高活性化精子は高濃度で減少し、培養時間が長くなると減少することが示され、精子の受精能が損なわれていることが示唆された。 精子膜とミトコンドリアは過活性化に不可欠であり、精子膜と精子ミトコンドリアの損傷は、受精能の低下につながる可能性がある。 OPは、in vitroで精子とインキュベートすると、AchEを阻害することにより、受精能の低下を引き起こすことが知られている。 しかし、十分な量のAchEまたはAchE模倣酵素を培地に添加すると、この効果は逆転した。このことは、受精を開始するためには、精子膜のAchEの活性が重要であることを示している。 精子のDNAは生殖の際に遺伝情報を伝達するために重要であり、DNAの損傷は不妊の原因となる可能性がある。 DNA の塩基とホスホジエステル基は、細胞膜に多価不飽和脂肪酸を大量に含み、細胞質には消去酵素が少ないため、酸化ストレスによる損傷を特に受けやすい。 したがって、高レベルの活性酸素は、不妊男性の精子でよく観察される二本鎖DNA切断をもたらす可能性がある。 アセフェートは細胞内の活性酸素種を著しく増加させ、塩基対エラーや鎖切断を形成して DNA の修飾を引き起こすことが記録されている。 DNA が切断された精子は運動性が低下し、低浸透圧膨張に弱くなる。これは精子膜の機能的完全性が低いことを示しており、DNA 損傷の増加に伴い精子の機能が低下する。 白血球のDNA損傷を誘発する農薬は、精子のDNA損傷にもつながる可能性がある

5. 結論

本研究は、アセフェート曝露による精子機能の障害の可能性を示唆するものである。 本研究で試験した高濃度のアセフェート（LD50に相当する200μg/mL）は、ヒトの精子の運動性、生存率、細胞膜の機能的完全性、精子の受精能に変化を与え、in vitroでDNA損傷を誘発させた。 この結果と、化学物質の分解やクリアランスといった人間の自然な生物学的反応を考慮すると、試験した高用量（200μg/mL）以上は、人間の健康に対するリスクを引き起こす可能性があることが示唆された。

略語

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotic solution
NaCl.を使用した。	塩化ナトリウム
OP:	有機リン酸農薬
ROS:	活性酸素.

倫理的承認

倫理的承認は、スリランカ、ヌゲゴダ、スリジャヤワルデネプラ大学、医学部、倫理審査委員会から得られました。 倫理承認番号は712/13です。

Conflicts of Interest

著者は本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

二酸化炭素のインキュベーターを提供してくださったスリ・ジャヤワデネプラ大学医学部微生物学科のNeelika Malavige教授、プロジェクトに化学薬品を提供してくださったコロンボ大学理学部動物学科に感謝します。