Discovery, activity and characterisation of an AA10 lytic polysaccharide oxygenase from shipworm symbiont Teredinibacter turnerae

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Express and enzymatic characterization of AA10 LPMO from T. T.。 turnerae

T. turneraeは、船鰓に共生するガンマプロテオバクテリアの中で唯一、分離・培養に成功し、そのゲノムをマッピングした。 T. turneraeの予測されるプロテオームに対して自動アノテーションと手動BLAST検索を行い、AA10 LPMO（以下TtAA10A）をコードする1つの遺伝子（NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1）を発見した。 予測されるタンパク質配列は、N末端のシグナルペプチド、LPMOドメイン、セリンリッチリンカー領域に続き、糖結合モジュール（CBM）10ドメインがある（図1a）。 AA10はCBM2、CBM3、CBM5、CBM10、CBM12、CBM18およびCBM73ドメインが付加されたものが見つかっており（Bernard Henrissat私信）、セルロースまたはキチンに対して活性を持つことが知られている。 CBM10ドメインはセルロースと結合すると考えられており、触媒作用とは関係ないセルロースを認識する可能性がある。 4903>

Fig. 1
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TtAA10A の生産と安定性について。 a分泌のためのシグナルペプチド（SP）、AA10 LPMOドメイン、70残基のポリセリンリンカー（柔軟であると予測される）および予測されるCBM10を特徴とする完全長TtAA10Aタンパク質の構造。 b本研究で使用した組み換えTtAA10Aコアの構造。 c 大腸菌で異種生産した精製TtAA10A（LPMOドメイン）のSDS-PAGE（M分子量マーカーはkDa、P精製タンパク質）。 d 精製TtAA10A LPMOドメインの熱シフト解析。EDTA処理による銅除去が不安定化効果を示し、7．9℃の融解温度の低下

様々な親和性、溶解性タグおよび異なる分泌シグナルを用いて遺伝子の発現を何度も試みた結果、大腸菌でC末端のstrepタグを持つLPMO触媒ドメイン（His25からGly228まで）の生産により、分析に十分なタンパク質がようやく得られた（図1b）。 精製されたタグ付きタンパク質は、過剰な銅を負荷し、サイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、SDS-PAGE（図1c）および質量分析ベースのタンパク質ID（図示せず）で純度を分析し、その後の実験に使用した。

組み換えTtAA10A（触媒ドメイン、25-228、のみ）は正しく折りたたんだAA10の特徴を示す。 精製した銅担持TtAA10Aの熱シフト解析（Thermofluor）により、融解温度（Tm）は50.4 °Cであることが示された。 10 mM EDTAで銅を除去すると、Tmは42.5 °Cまで下がり、他のLPMOの文献で報告されているように、金属補因子によるタンパク質安定化効果を示唆している（例えば、Fig. 1dなど）。 また、あるタンパク質は銅を1つだけ含み、他のタンパク質は2つの銅原子を含むなど、タンパク質調製にばらつきがあることがわかった（以下に記述）。

単一および二重銅部位サンプルの活性アッセイを、さまざまな市販の多糖類基質 (Avicel, イカペン由来のβ-キチン、エビ殻由来のα-キチン)で実施した。 セロヘキサオース、コーンスターチ、パキマン、ブナノキシラン、グルコマンナン、キシログルカン、リケナン、ガラクタン、ガラクトマンナン、マンナン）を還元補酵素である没食子酸の存在下で測定した。 24時間後のサンプルをMALDI-TOF MSで分析し、反応生成物のピーク質量を既報のデータと比較したところ、C1-C4の混合酸化パターンが、セルロースのみで、電子供与体の存在に依存していた（図2a, b）。 生成物はいずれの陰性対照物質でも検出されなかった（Additional file 1: Figure S1）。 銅を担持したTtAA10Aを10mM EDTA存在下で行った活性測定からの粗抽出物のMALDI-TOF MS分析は、生成物の放出を検出できず（データは示さず）、予想通り、銅が活性に必須であることを示した

Fig. 2
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Activity of TtAA10A on polysaccharides. a MALDI-TOF MS spectrum of products obtained after incubation of 4 mg/mL Avicel with 2 μM LPMO and 4 mM gallic acid, indicating native and oxidised oligosaccharides.The MIDI-A10A は、多糖類をインキュベーションして得られた生成物のスペクトルである。 主なピークは以下の通りである。 C1またはC4ケト付加物、モノソーダ付加物（-2種）；C4ケトとC1アルドン酸、モノソーダ付加物（+14種）；C1アルドン酸またはC4ジェムジオール、モノソーダ付加物（+16種）；C4ジェムジオールとC1アルドン酸、モノソーダ付加物（+32種）と2ナトリウム付加物（+54種）；C1アルドン酸、2ナトリウム付加物（+38種）。 質量1083 m/zの追加ピークは、LPMO酸化の既知の生成物に確実に割り当てることができず、C6におけるより高い酸化レベル（C4ジェムジオール+C1アルドン酸+C6アルドン酸、二ナトリウム付加物に相当+70種）として暫定的に解釈された。 天然種と酸化種はそれぞれ黒と赤で表示されている。 相対強度は1.23×103を表す。 b DP6の拡大マススペクトル。 市販のGH6による微結晶セルロース（アビセル）からのセロビオースの放出（c）と、市販のGH9によるセロペンタオースの放出（d）を示す相乗効果実験。 LMPOは両グリコシド加水分解酵素の活性を著しく高め、その効果は没食子酸の添加により増大する

TtAA10Aと市販のグリコシド加水分解酵素（GH6とGH9）を、Aviselと没食子酸存在下でコインキュベートしてシナジー実験を行い、得られた単糖とオリゴ糖を高速アニオン交換クロマトグラフィー (HPAEC) で定量化した。 LPMOまたはGHを単独で含む反応では、遊離糖の放出量はごくわずかであったが、共インキュベーション反応では強い相乗効果が見られ、電子供与体の存在によりさらに増強された (Fig. 2c, d, Additional file 2: Figure S2). これらの実験でテストした市販の GH (GH6 と GH9) はいずれも、シップワームの消化タンパク質に最も多く含まれるファミリーに属していることは注目に値する。

電子常磁性共鳴分光法

あるタンパク質標品が 2 つの銅サイトを含んでいる最初の証拠は、EPR 分析から得られた。 銅飽和 TtAA10A の凍結溶液 (165 K) X バンド CW-EPR スペクトル (図 3) には、スペクトルの平行領域に 2 組の超微細ピークがあり、1 つの部位内の異なる配位環境 (たとえば、リガンドのプロトン化状態の相違) または異なる第 2 銅結合サイトのいずれかから、2 つの異なる銅配位幾何が存在することを示しました。 実際、スペクトルの平行領域の正確なシミュレーションは2つの異なる種で行うことができ、それぞれの種のスピンハミルトニアンパラメーターは、gz = 2.267 and |Az| = 425 MHz（種1）、gz = 2.314 and |Az| = 465 MHz（種2）（表1）で、種1と2の割合はおよそ3：2であることが分かりました。 種2のgz値は、活性部位に典型的なAA10 LPMO銅が配位している場合に予想される値に比べて高く（LPMOの分光学は最近文献でレビューされている）、これに基づいて種1をヒスチジンブラスの活性部位に結合した銅であるとした。 そのスピンハミルトニアンの値は、NとO供与配位子の混合物を含む軸銅配位構造の典型的なものである。 (すべての小分子種がタンパク質調製中に除去されるため、種2は溶液中の自由な銅種から来ることはできない。したがって、EPRのすべての銅信号はタンパク質結合銅から生じる。))

Figure 3
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CW X-band EPR spectrum of copper-saturated TtAA10A.の図。 種1については表2で報告されたパラメータを用い、種2については以下の値を用いて得られたシミュレーション：gx = 2.03, gy = 2.07, gz = 2.314、｜Ax｜＝40MHz、｜Ay｜＝60MHz、｜Az｜＝465MHzに、AN主値35MHzの結合N原子を1つ追加した場合

Table 1 図に示す試料からの種1および種2のスピンハミルトニアンパラメータ（パラレル領域）、および、図に示す試料からの種2および種3のスピンハミルトニアンパラメータを示す。 3

2つのシグナルが、配位構造の異なる単一の銅結合部位から生じたのか、あるいは2つの異なる銅部位から生じたのかを判断するために、XバンドCW-EPR滴定実験が行われました。 タンパク質はEDTA（タンパク質濃度の10倍）で前処理して銅を除去した後、緩衝液で交換してEDTAを除去した。 この銅を含まないタンパク質サンプルをテストしたところ、予想通り、銅に基づくシグナルは見られなかった。 0.2当量の銅を加えたところ（タンパク質濃度に対して）、パラレル領域に単一のシグナルが現れ、ヒスチジンブラッセ活性部位（種1）内の銅（II）イオンに割り当てられた。 さらに銅を添加すると、このヒスチジンブレスの銅信号が増加し、それに伴って種2の信号も増加し、0.4当量の銅添加で既に明らかになった（追加ファイル3：図S3）。 これらの滴定実験はpHを固定して行われ、銅飽和TtAA10AのEPRスペクトルの2つの種は、わずかに異なる銅結合親和力を持つ2つの異なる銅結合サイトを表し、種1がより親和力の高いサイトであることが示された。 さらに、0.4当量の銅を添加したTtAA10Aの試料を4℃で48時間放置し、そのEPRスペクトルを再調査したところ、0.4当量の銅を添加したTtAA10Aは、4℃で48時間放置した後、そのEPRスペクトルを再調査した。 この試料では銅種の比率に差がなく、銅の結合速度に大きな差があるために結合部位が異なるわけではないことが示された。 これらのサンプルは、XバンドのEPRスペクトルで2つの異なる銅のシグナルを持つTtAA10A（種1および種2）を得たものと表向き同じ条件を用いて調製されたため、単離タンパク質の銅化学量論におけるこの違いの理由は明らかでない。 これらの銅を単独で占有した試料では、これまでの試料と比較して活性の違いを検出することはできなかったが、これらの試料を利用して、これまでのスペクトルを参照して判断すると、ヒスチジンブラースのみを占有したTtAA10Aの活性中心銅のXバンドおよびQバンドCW-EPRスペクトルの両方を測定することができた（図4）。 そこで、この試料を用いて、XバンドとQバンドのスペクトルの同時フィットを行い、ヒスチジンブレース活性部位（種1）の銅イオンについて、より正確なスピンハミルトニアンパラメータを得ることができた。 これらの値は表2に報告されている。 TtAA10AにPASCを添加してもEPRスペクトルに変化は見られなかった（データなし）。

Figure 4
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TtAA10A (species 1) の凍結溶液Xバンド (a) とQバンド (b) CW-EPR spectra. 黒が実験データ、赤がシミュレーション

Table 2 PBSバッファpH7でのTtAA10A（種1）のCW XバンドおよびCW QバンドスペクトルのシミュレーションによるEPRスピンハミルトニアンパラメータ。4

TtAA10A

の3次元構造

TtAA10A の生化学的特性の分子基盤をさらに理解するために、また、この珍しい2銅構造を調べるために、我々は組換え発現タンパク質の結晶構造を1.4 Å分解能で決定した（追加ファイル4：表S1）。 その結果、このファミリーの酵素によく見られるように、ループとヘリカルバンドルで装飾された免疫グロブリン様のコア構造を持つことが明らかになった（図5）。 実際、DALIサーバーを用いた構造比較では、Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) および Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) の180および170 Cα-位置のRMSDがそれぞれ2.4 Åおよび2.3 Åで最も構造一致し、配列レベルでの同一性はわずか30%であることが判明した。 TtAA10Aのセルロースに対する高い活性を考えると、この酵素に最も近い2つの構造マッチがキチン活性を持つAA10であることは、やや意外なことであるかもしれない。 しかし、3番目に近い構造マッチはStreptomyces coelicolorのAA10 (ScAA10, PDB ID 4oy7 ) で、これはセルロース特異的AA10であり、160 Cα原子のRMSDは2.5 Åであった。 TtAA10AとScAA10は、同じ基質で活性を示すにもかかわらず、配列の同一性はわずか26%であり、配列と全体構造のみに基づいてLPMO基質特異性を関連づけることの難しさがさらに浮き彫りになった（さらにAA9との関連で文献に記載されている）。

Fig. 5
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TtAA10A の構造解析 a TtAA10A の全体構造は、その周囲の表面をグレーで示し、二次構造によって色分けした漫画として示されています。 ヒスチジンブラース活性部位銅はオレンジ色の球で、その配位する残基は原子の種類によって色分けされた棒で表示されている。 二次的な銅の部位と別のナトリウムイオン結合部位は、それぞれシアン色と灰色の球で示し、配位する残基はヒスチジンブレスと同様に色付けした。 b 酵素活性部位のヒスチジンブレスの拡大図。 最終的な構造の2Fobs-Fcalcマップは、青いメッシュで1σの輪郭で表示されている。 銅イオンと相互作用するために対称性関連分子から移動したStrep-Tag由来のヒスチジンは、白い炭素原子で示し、*印で示した。 bとcの両方において、差分異常マップは4σで輪郭をとり、ピンク色のメッシュで銅イオンの位置を確認している

これまで研究したすべてのLPMO（その活性で定義）と同様に、TtAA10Aの活性部位は、ほぼ平面状の面の中心にある「ヒスチジンブレス」モチーフで形成されています（図5a、b）。 この位置には、His 1のアミノ末端と側鎖、およびHis 107の側鎖イミダゾールによって典型的なT字型形状に配位された1つの銅イオンがモデル化された。 活性部位銅イオンの周りの軸の位置には、TtAA10AはPhe 195とGly 105を持つ。 これらの位置は、他のAA10ではそれぞれフェニルアラニン/チロシンおよびアラニン側鎖によって占められていることが多い。 後者は、キチン特異的AA10のCu(II)酸化状態で観察される歪んだ活性部位配位構造の形成を促進する立体的環境の形成に関与しているとされている。 AlaをGlyに置き換えることで、活性部位の銅はわずかに軸配位構造になり、AA9やセルロース活性型AA10に典型的な配位構造に近く、先に述べたEPR解析で得られた種1のスピンハミルトニアンパラメータと一致した（図4）。 LPMOの結晶構造は、放射線損傷の結果、光還元されることが多く、結晶構造では活性部位の静止形状を直接観察することができない（例えば、以下のような例）。 TtAA10Aの銅イオンを囲む球を解析したところ、銅から2.6Å離れた水分子の密度は弱く、Glu53に水素結合する3.2Å離れた2番目の水分子の密度は強かった。 これらの水分子は銅から遠すぎるため、直接配位していると考えることはできない。 したがって、この酵素の銅も光還元を受けてCu(I)酸化状態になったものと考えられる。

この構造から、EPRスペクトルで観測された第2の銅結合部位の位置が明らかになった。 この部位は、タンパク質表面の負に帯電した大きなパッチにあるヒスチジンブレース銅イオンから14.4Å (Cu…Cu) にある (Fig. 5a, b; Additional file 5: Figure S4)。 この2番目の銅イオンは、His 165、Glu 5、Asp 101、水分子、および結晶中の隣接分子からStrepタグによって提供されるHis 207* によって直接配位されています。 この相互作用が観察されたため、SEC-MALLSを用いて、溶液中のタンパク質のオリゴマー状態を確認しました（追加ファイル6：図S5）。 その結果、このタンパク質は単量体であることが確認され、銅-His207*の相互作用は結晶のアーチファクトであることが示唆された（ただし、タンパク質間相互作用の可能性を示唆するものであることは間違いないだろう）。 それにもかかわらず、EPRデータに加え、この構造は、His 207*が水分子に置き換わっている可能性が高く、この第2部位が溶液中で占有されていることを示唆している。 BlastP検索によって同定された上位500のTtAA10A正体配列の多重アラインメントは、5位の酸性残基はAA10では珍しくないが、残基101と165はTeredinibacterに近縁なバクテリアのLPMOでのみ大きく保存されていることを示している。

酵素が固体基質表面に結合しているときに、低分子およびタンパク質の電子供与体がLPMOに結合して触媒反応を可能にする位置については、かなりの議論があった（例えば、以下を参照のこと）。 実際、TtAA10A構造をEHPathプログラムで調べると、ヒスチジン1とチロシン3（10Å離れている）の間に、平均ホール滞在時間がわずか20 msの、明確で速いホールホッピング経路が存在することがわかった。 チロシン3は2番目の銅サイトに隣接しており（5.3 Å）、2つの銅サイト間の効率的な電荷移動経路を提供している。 そこで、2つの銅部位間の電荷移動経路の可能性を考慮し、2番目の金属部位（我々の場合は銅で占められているが、Fe、Ni、Zn、Mn塩で銅を置換できなかった）がタンパク質性の酸化還元パートナーの結合部位であるかどうかを調査し（この部位に別のタンパク質が結合することは、結晶格子内で隣接する分子とStrepタグが会合することから示唆された）、T. turneraeの予測するセクレトームから、TtAA10Aを固定化したアフィニティーカラム（StrepTrap HP）を用いて、TtAA10Aと安定的に相互作用する可能性のあるタンパク質を引き抜くことを試みた。 しかし、活性化酵素がこの領域に一過性に結合し、LPMOへの電子伝達を可能にし、その結果触媒作用を開始する可能性は否定できない。 しかし、構造精密化の過程で、タンパク質表面にナトリウム結合部位も確認された（Additional file 7: Figure S6）ことに注意が必要である。 これらの結合部位は、T. turneraeが生息する塩分環境において安定であるために、このタンパク質が増加した電荷の結果であるかどうかは、まだ未解決の問題である。 しかしながら、LPMOを安定化させたり、特定の条件に適合させて工業用バイオリアクターに導入する場合、TtAA10Aのこれらの表面特性は酵素工学者にとって興味深いものになるであろう。