Emerging evidences for opposite role of apolipoprotein C3 and apolipoprotein A5 in lipid metabolism and coronary artery disease アポリポ蛋白C3とアポリポ蛋白A5の脂質代謝と冠動脈疾患における役割

アポリポ蛋白C3（アポC3）とアポリポ蛋白A5（アポA5）はAPOA1/C3/A4/A5遺伝子クラスターによってコード化されている． 遺伝学的研究、疫学的研究、基礎実験から、アポC3とアポA5が血漿中のトリグリセリド（TG）代謝の重要な調節因子であることが一貫して証明されている。 アポC3やアポA5の欠乏は、ヒトやマウスで血漿中のトリグリセリドレベルの著しい低下や上昇を引き起こした。 詳細なメカニズムの研究から、アポC3は血漿中のTGの加水分解、残留リポ蛋白の取り込みを阻害し、肝からのTG分泌を促進するが、アポA5は全く逆の方法で血漿中のTG代謝を調節していることが明らかになった . 最近の研究では、さらにアポC3とアポA5が残留コレステロール（RC）、高密度リポタンパク質（HDL）および肝TG代謝に関与していることが明らかにされた。 さらに、大規模な集団遺伝学的研究により、APOC3およびAPOA5遺伝子の機能喪失変異は、それぞれ冠動脈疾患（CAD）のリスクの低下および上昇をもたらすことが示唆された。 このように、apoC3およびapoA5は、心血管系リスクを低減するための新規ターゲットとして期待されている。 本論文では、脂質代謝とCADリスクにおけるアポC3とアポA5の相反する役割を示唆する既存の証拠を主にレビューし、これら2つのアポリポタンパク質の潜在的な相関性について議論した。 これらの遺伝子は進化的に保存されている。 ヒトAPOC3遺伝子の制御領域は、4つのエレメント（-283/+24）からなる近位プロモーターと6つのエレメント（-890/-500）からなる遠位エンハンサーのセットを含んでいる。 初期の動物および細胞培養研究により、APOC3 エンハンサーは肝および腸の APOA1、APOC3、APOA4 遺伝子の発現を指令する共通の制御配列として機能していることが明らかにされた。 しかし、APOA5遺伝子のみを含む26 kbのDNA XhoI-フラグメントを用いると、APOOC3エンハンサーを欠くため、生体内で肝臓特異的なAPOA5遺伝子の十分な発現が得られた . Gao らはさらに、APOC3 エンハンサーがトランスジェニックマウスにおける APOA5 の発現に影響を及ぼさないことを確認した。 実際、APOA5のプロモーター領域には2つの要素があり、ヒト肝細胞株での発現を誘導するのに重要であることがわかった。

遺伝子発現の開始は転写因子が遺伝子調節要素に特異的に結合することによって行われ、このプロセスに影響を与える分子は対応する遺伝子発現を調節することができる。 APOC3とAPOA5の遺伝子発現の具体的な構造や制御機構については別の場所でレビューされているが、ここではAPOC3とAPOA5に共通する制御因子に焦点を当てる。 実際、APOC3とAPOA5の発現を同じ方向に制御する分子として、hepatocyte nuclear factor 4-α (HNF4-α) とグルコースによるアップレギュレーション、AMP-activated protein kinase、インスリン、Tumor necrosis factor-α (TNF-α) によるダウンレギュレーションなどが指摘されてきた。 これらの物質は、TNF-αを除き、いずれも糖代謝に直接関与する重要な物質であり、APOC3およびAPOA5の制御異常が糖尿病性脂質異常症に寄与している可能性が示唆された。 また、peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPAR-α) や farnesoid X-activated receptor (FXR) は APOA5 を促進し、APOC3 の発現を抑制するという逆の方向の制御も見いだされた。 APOA5とは対照的に、ヒトのAPOC3遺伝子プロモーターには、PPAR-αおよびFXRの陽性応答要素が含まれていない。 実際には、これら2つの核内受容体は、HNF4-αのような他の転写因子のAPOC3の特定エレメントへの結合を阻害することによって間接的に作用し、それによってAPOC3遺伝子の転写をさらに阻害した . したがって、PPAR-α作動薬の一つであるフィブラートの血漿中TG低下作用は、アポA5の循環濃度を増加させ、かつ/またはアポC3レベルを減少させることによって部分的に媒介されている可能性がある。 実際、最近の研究では、フェノフィブラートとオメガ3多価不飽和脂肪酸療法の両方が、ヒトの血漿アポC3レベルを有意に低下させることが示された。

Plasma lipid metabolism

Lipoprotein distribution

Circulating apoC3 と apoA5 は主にトリグリセリド・リッチ・プロテイン（TRL）とHDLに関連していた … アポC3とアポA5のいずれかがTRLとHDLの間で交換可能であることが示された。 正常脂質血症患者では、血漿中のアポC3の大部分はHDLに結合していた。 一方、高トリグリセリド血症患者では、アポC3は超低密度リポ蛋白（VLDL）上に多く存在した。 人工TGエマルション中のTG濃度が高くなるにつれて、アポC3の大部分は血漿中の天然リポ蛋白から人工エマルションに移行していった。 Glangeaudらは、リポ蛋白リパーゼ（LPL）を介したVLDLの加水分解の際に、アポC3がVLDLからHDLに再分配され、その量はVLDLのTG加水分解の大きさに比例し、アポC3はその後新たに合成されたTGに富むVLDL粒子に再び移行することを見いだした . 同様に、Nelbach らは、APOA5 トランスジェニックマウスではアポA5 はHDL に多く結合し、VLDL はTG に乏しかったが、APOA5 ノックアウトマウスから分離したVLDL に迅速かつ効率的に再分配されたことを示した。 Shuらは、APOA5ノックアウトマウスにアポA5を含む再構成HDLを静脈注射したところ、再構成HDLとVLDL間でアポA5の交換パターンが同じであり、VLDLの加水分解が阻害されたため、アポA5は依然としてTGリッチVLDLに結合していたと報告している

これらの結果から、アポC3とアポA5のリポ蛋白分布がTRL中のTG量と深く関連していると示唆された。 TRLのTG濃度が低い場合，apoC3やapoA5の大部分はHDLに含まれていた． TRL中のTG量が増加すると、アポC3とアポA5の大部分がHDLからTRL粒子へと再分配され、TRLの加水分解処理に伴って徐々にHDLへとシャトルバックされた。 しかし、この交換過程の生物学的機能や制御機構は十分に解明されていない。

血漿中TG

ヒトにおける遺伝的観察から、ApoC3とApoA5は血漿中TG濃度の重要な決定因子であることが明らかとなった。 ヒトAPOC3遺伝子の機能喪失変異は低血漿TGプロファイルを与えるが、APOA5欠損変異を持つ患者は極めて高い血漿TGレベルを有していた。 アポC3やアポA5の異常は、家族性高カイロミクロン血症、家族性複合型高脂血症、家族性異種脂肪酸血症など、さまざまなタイプの高脂血症に関連していた。 興味深いことに、最近の研究により、アポC3タンパク質のスレオニン74に単一のグリコシル化部位が存在し、血漿中に4つの主要なプロテオフォームを生じることが示された。 糖鎖を持たない野生型は一般にapoC30aと呼ばれている。 残りの3つはいずれもO-結合型2糖であるガラクトースとN-アセチルガラクトサミンが結合したコア糖鎖を持っている。 ApoC30bは糖鎖コアのみを持つプロテオフォームであり、ApoC31とApoC32はそれぞれ1つと2つのシアル酸残基を追加している。 さらに、アポC3の4つの主要なプロテオフォームは、空腹時TGレベルと異なる相関があった。 血漿中のアポC30a、アポC30b、アポC31は空腹時血漿中TGと正の相関を示し、アポC32は負の相関を示すことが明らかになった。

また、APOC3ノックアウトマウスは野生同腹子と比べてTG濃度が減少（-30％）したが、APOC3トランスジェニックマウスは血清TG値が上昇（＋200％～2000％）していることがわかった。 一方、APOA5ノックアウトマウスはTG濃度が増加（+ 400%）したのに対し、APOA5トランスジェニックマウスはこの脂質パラメータが有意に減少（- 70%）した。

詳細なメカニズム研究では、ApoC3とApoA5が複数の経路を通じて血漿TGレベルを制御していることが明らかにされた。 ApoC3はLPLを介したTRLの加水分解、循環血中TRLレムナントのクリアランスを阻害し、肝TGの分泌を促進することがわかった。 興味深いことに、ApoA5は血漿中のTG代謝を全く逆の経路で調節した。 すなわち、apoA5 は TRL の加水分解と肝への TRL 残留物の取り込みを促進する一方で、肝からの TG 分泌を抑制した（図 1）

Plasma RC

RC は、空腹時のVLDLと中密度リポ蛋白（IDL）を含むTRL、および非空腹時のVLDL、IDL、カイロミクロン残査の総コレステロール含有量で定義されています。 RCは虚血性心疾患の独立した危険因子であることを示す証拠が増えつつある。 さらに、RC値の上昇は虚血性心疾患患者の全死亡率の上昇と関連していた。

アポC3およびアポA5はTRL代謝を制御しているので、APOC3およびAPOA5の遺伝子変異がRC値と関連していたことは予想外ではなかった。 137,895人のメタアナリシスでは、APOC3欠損機能ヘテロ接合体では非保有者に比べてRCが43%低かった 。 一方、APOA5の一般的な変異体（c.-1131 T > C、S19 W、c.*31C > T）の遺伝子型の組み合わせでは、RCが最大で56％増加することが示された。 6904>

HDL

HDLは、コレステロール排出の仲介、血管内皮の保護、抗炎症作用、抗アポトーシス作用など、さまざまなアテローム保護作用を発揮する． これらの特性が欠落したHDLは機能不全HDLと呼ばれ、ひいてはCADの進行の一因となる。 ヒトでの観察から、これらの性質は病的な障害下では欠陥があることが示唆されている。 例えば、尿毒症患者のHDLでは、コレステロールの排出能に障害が見られた。 Riwantoらは、CAD患者からのHDLは内皮の抗アポトーシス経路を活性化せず、むしろ内皮のプロアポトーシス経路を刺激することを見出した。 さらに、スペクトロメトリーや生化学的解析により、HDLの機能低下はプロテオーム組成の変化と密接に関連していることが示され、中でもアポC3やアポA5の変化が注目された

Riwanto らは、CAD患者のHDL粒子では健康な対照群と比較してアポC3が著しく高いことを明らかにした。 また、これらのHDLに含まれるアポC3を中和する抗体を用いると、HDLが介在する抗内皮アポトーシス機能が改善された。 Cho KHは、人工再構成HDL中のアポC3含量が増加すると、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）の活性化能が低下することを示した。 興味深いことに、Luo Mらは、HDL中のApoC3含量がHDLを介したコレステロール排出能と負の相関があることを示したが、そのメカニズムは不明であった。 一方、アデノウイルスでAPOA5を過剰発現させたマウスでは、HDL中のAPOA5が増加し、コレステロール排出能が増加した。 アポA5をより多く合成した再構成HDLは、in vitroでより大きな粒子径、より多くの脂質含有量、LDLに対する優れた抗酸化能を有していた。

HDLの機能におけるアポC3およびアポA5の明確な役割については、さらに検討する必要がある。 HDL中のアポC3は、構造不明なドメインを持つスカベンジャー受容体B1（SR-B1）に結合することが報告されています。 SR-B1は、HDLからコレステロールエステルを選択的に肝臓に取り込ませるなど、コレステロールの逆輸送に重要な役割を担っていることが知られている。 このSR-B1とapoC3の相互作用がコレステロールの逆輸送に影響を与えるかどうかは未解決である。 VLDLは中性脂質のコア、主にTGといくつかのアポリポタンパク質から構成されている． その中でもアポリポタンパク質B100（apoB100）は最も重要であり、VLDL粒子の構造的安定性を提供している。 VLDLの生合成には2つの段階がある。 まず、小胞体でアポB100が合成され、VLDLが形成される。 その後、新生アポB100は部分的にラピッド化され、脂質の少ない始原VLDL粒子を形成するが、これはミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（MTP）により促進される。 VLDL形成の第2段階として、始原VLDL粒子はトリグリセリドに富む粒子と融合し、TGに富む成熟VLDLを形成する 。 アポC3やアポA5がVLDLの脂質化を制御し、肝TG量に影響を与えることが証明されつつある（図1）

細胞培養、動物実験、ヒトでの研究から、アポA5がVLDL-TG分泌を抑制し細胞質脂質滴へのTG貯蔵を促進することが確認された。 ヒトAPOA5を安定的に導入したMcA-RH7777細胞は、コントロール細胞からのVLDLより小さいVLDLを分泌するが、細胞のTGレベルが高く、脂質滴が大きかった 。 一方、Ressらは、HepG2細胞でAPOA5をノックダウンすると、細胞のTG量が減少することを報告している。 APOA5 トランスジェニックマウスの肝臓は、野生の同胞と比較して肝TGレベルが上昇していた 。 Qinらは、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）患者では、健常対照者と比較してAPOA5の発現が上昇していることを見出した。 しかし、まだいくつかの謎が残っており、さらに解明する必要がある。 まず、APOA5の一部は、どのようにして血中への分泌経路を逃れ、細胞質脂質滴に結合するのだろうか？ また、アポA5はどのようにして、VLDLの形で分泌されるのではなく、脂質滴（LD）に肝臓のTG貯蔵を促進するのか。

逆に、in vivoおよびin vitroの研究では、アポC3がVLDLの脂化を促進する作用があることが示されている。 APOC3ノックアウトマウスに高脂肪食を2週間与えてもVLDL-TG産生は促進されなかったが、ヒトapoC3をコードするアデノウイルスでAPOC3の発現を再構成すると、VLDL-TGがしっかりと産生されるようになった。 VLDLの脂質化に対するヒトapoC3の刺激効果は、脂質が豊富な条件下でMcA-RH7777細胞で再現された。 さらに、apoC3 の脂質結合ドメインの残基（K58E）を部位特異的に変異させると、この刺激作用が消失した。 これらの知見は、APOC3の発現を低下させる2つのSNP（C-482 T, T-455C）が、アジア系インド人集団における肝TG値の上昇やNAFLDの高い有病率と相関しているという観察からも支持されるものである。 Gaoらは、アポA5が小胞体内腔のLDの出芽を促進し、細胞質LDを形成し、VLDL粒子へのTGの集合を減少させると仮定している。 Qin らは、apoC3 が VLDL 脂質化過程において ER 内腔 LD と VLDL 粒子の融合を促進することを明らかにした 。 アポA5とアポC3がVLDL脂質化およびLD代謝に及ぼす影響の基礎となる分子基盤に焦点を当てた詳細な研究が必要であり、それは肝TGホメオスタシスに関する新しい理解をもたらすであろう。 低比重リポ蛋白コレステロール（LDL-C）は、CADの発症に重要な役割を果たすことがよく知られており、血漿LDL-Cの低下によりCADの罹患率と死亡率が著しく低下する。 しかし、LDL-Cの治療目標値を達成してもなお、多くの人がCADを患っていることが報告されている。 したがって、CADのリスクをさらに減少させるために、他の修正可能な危険因子を特定する努力が続けられている。 集団遺伝学的データは交絡や逆の因果関係がないため、新しいCADの危険因子を特定する重要な方法として認識されている。

興味深いことに、遺伝的に血漿アポC3レベルが低下すると、ヒトのCADリスクが低下することが証明されている。 APOC3遺伝子のナンセンス変異、R19Xは、循環アポC3レベルの50％低下と関連していた。 さらに重要なことは、この稀な変異体R19Xの保有者は、冠動脈石灰化の発生率が低く、フラミンガム10年CADリスクも低かったことである。 R19Xと他の3つの希少バリアント、APOC3遺伝子の2つのスプライスサイト変異（IVS2 + 1G → A; IVS3 + 1G → T）と1つのミスセンス変異（A43T）の心臓保護効果は、最近2つの大規模試験で確認された . 米国国立心肺血液研究所のエクソーム解読プロジェクトの一環として行われた研究では、参加者の約150人に1人がこれら4つの変異の少なくとも1つを持つヘテロ接合型キャリアであり、キャリアのAPOC3の循環レベルは非キャリアのレベルより46％低かった。 APOC3のいずれかのまれな変異を有する498人のCADリスクは、110,472人の非保有者のリスクより40％低かった。 75,725人のコホートでは、虚血性血管疾患と虚血性心疾患の累積発生率は、APOC3の機能喪失型変異（R19XまたはA43TまたはIVS2 + 1G → A）のヘテロ接合体では、ノンキャリアと比べて減少し、それぞれ41％と36％のリスク減少が認められた。 また、アポC32プロテオフォームが高い患者では、主要な有害心血管疾患イベントが少ない傾向があることが報告されているが、他のアポC3プロテオフォームではこれらの関連は検出されず、アポC32がより機能喪失型プロテオフォームに近いことが示唆された.

また、アポA5レベルの低下につながるAPOA5変異はCADリスクの上昇と関連していた. APOA5遺伝子の-1131 T > Cプロモーター多型とCADのリスクとの関連は、大規模なメタ解析で示されている。 CADのオッズ比はC対T対立遺伝子あたり1.18であった。 さらに、いくつかの独立した研究により、APOA5のバリアントは心筋梗塞（MI）のリスクと有意に関連していることが一貫して示されている。 Raffaele De Caterina らは、APOA5 -1131 T > C 遺伝子変異と早期発症の急性心筋梗塞との強い関連性を見いだした。 Jorgensen ABらはさらに、APOA5遺伝子の遺伝子変異（c.-1131 T. C, S19 W, c.*31C. T）がMIリスクの87％上昇に関連することを示した。 Do Rらは、MI患者6721人と対照者6711人のAPOA5のエクソン配列を決定した。 46のユニークな非同義またはスプライスサイトの一塩基変異または対立遺伝子頻度＜1151＞1％のインデルフレームシフトが同定された。 さらに，APOA5遺伝子におけるこれらの稀な変異の保有者（症例の1.4％対対照群の0.6％）は，対照群と比較してMIのリスクが2.2倍上昇した。

さらに，ApoC3やApoA5のCADリスクへの影響は，血漿RCレベルの変化によって一部仲介されていることが示唆されている。 Wulff ABらは、APOC3欠損機能ヘテロ接合体の非保有者に対し、虚血性血管疾患のリスクが41％低いという観測結果の37％、虚血性心疾患のリスクが36％低いという観測結果の54％をRCが仲介していることを明らかにした 。 しかし、APOA5遺伝子の変異（c.-1131 T. C, S19 W, c.*31C. T）は、遺伝的にRCの増加をもたらし、MIリスクの増加と関連していた。 一方、APOA5遺伝子の変異体（c.-1131 T.C、S19 W、c.*31C.T）は、RCが最大56%増加し、それに伴うMIのオッズ比は1.87となった。

Potential correlation between apoC3 and apoA5

APOC3 とAPOA5は脂質代謝を調節しCADリスクとは反対の関連を持つため、独立して機能するか協力しているか疑問に思うのは妥当である。 遺伝子改変マウスから得られたいくつかの知見から，この2つのタンパク質が密接に関係していることが示唆されたが，現在のところ，両者の直接的な相互作用を示す証拠はない。 Pennacchioらは、APOA5遺伝子導入マウスおよびノックアウトマウスでは、肝のApoC3タンパク質量は明らかに減少および増加したが、ApoC3 mRNA量には有意な変化がないことを示した。 実際、APOA5ノックアウトマウスでは肝臓のアポC3タンパク質量が野生型同腹子と比べて90％増加し、APOA5トランスジェニックマウスでは40％減少していた。 同様に、ヒトAPOA5をアデノウイルスで過剰発現させたマウスでは、血清中のApoC3濃度が低下していた。 これらの知見は、アポC3が転写レベルでアポA5に影響を与え、逆にアポA5が転写レベルでアポC3に影響を与えることを示唆している。 しかし、そのメカニズムは不明である。