Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

BY admin

| 10月 6, 2021

GRAPHICAL ABSTRACT

GRAPHICAL ABSTRACT 1 金界面のpH依存可逆スポンジBSAナノレイヤーの概略図。

はじめに
材料と実験
材料
QCM-D Measurement
DLS Measurement
接触角測定
原子間力顕微鏡（AFM）
結果
考察
結論
Data Availability Statement
Author Contributions
資金援助
利益相反
補足資料

はじめに

血清アルブミンは生体診断によく用いられるタンパク質で、生体界面研究のモデルとして用いられる（Rosi and Mirkin、2005；Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015）。その中でも、ウシ血清アルブミン（BSA）は最も安価であり、ELISA試験におけるブロッキング剤として広く使用されているタンパク質である（Maingonnat et al.、1999）。紙診断では、BSA（Huangら、2018）は紙の疎水性を選択的に高め、液体吸収を減少させることで生体流体および溶出流を改善します。 BSAは、紙上で乾燥させた機能性生体分子を保護し、寿命を延ばします。 BSA処理表面で乾燥させた免疫グロビンGおよび免疫グロビンMの機能性および寿命は、1桁増加することがあります（van Remoortereら、2001年）。 BSAはまた、定量分析のための分析物タンパク質の非特異的吸着を防止します。

金（Dennison et al., 2017）、マイカ（Fitzpatrick et al., 1992）、シリコン（Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017）、およびセルロース（Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017）などの異なる界面でBSA分子収着現象について複数の論文が広範囲に報告されています。吸着したBSA分子のコンフォメーションと形成された層のトポロジーは、pH、イオン強度、温度によって強く影響を受ける。 BSA分子は、pH4.0から8.0の間でネイティブな構造を保持する。 pH4.0以下および8.0以上では、BSA分子はそのネイティブ構造とは異なる折り畳み構造を変化させる（Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015）。 BSAの等電点はpH4.5である。このpHでは、正味の表面電荷がゼロになり、BSA分子は凝集する。 pHを上げるとBSAの電荷が増加し、支配的な静電反発によってBSA分子が安定化し、凝集が防止されます（Li et al.、2008）。この文脈では、表面占有率や重量密度によってのみ定義される表面被覆の概念は、明確さを欠いている。

ウシ血清アルブミン分子は界面に吸着し、ナノメートルオーダーの厚さの層を形成します。反射率（Suら、1998b、2016；Raghuwanshiら、2017a、b）、エリプソメーター、原子間力顕微鏡（AFM）、表面プラズモン共鳴（SPR）および散逸付き水晶マイクロバランス（QCM-D）などのいくつかの特性評価法は、必要とされるナノメータースケールで吸着タンパク質層厚を測定することができる。特に、QCM-Dは、界面における吸着タンパク質質量をナノグラム単位で測定することにより、生体分子の吸着プロセスを動的にモニタリングすることができる（Kristensenら、2013；Luanら、2017）。 QCM-Dは、温度、イオン強度、pH環境の制御を可能にします。 QCMの散逸モードは、吸着されたタンパク質層の剛性を明らかにする。

本研究では、金-塩水界面に吸着したBSA分子の可逆的なpH応答性挙動を説明した。吸着したBSA層はpH感応性スポンジとして振る舞い、周囲のpH4から8の間で水分子の吸着と脱着が行われる。この研究では、BSAスポンジ様層における水の吸着現象をモニターし、定量化するとともに、異なるpHとイオン強度における吸着機構を解明する。固液界面におけるBSAの吸着状態を、分子数および層の重量・厚みで表現することが目的です。 8852>

材料と実験

材料

牛血清アルブミン凍結乾燥粉末（97％）および塩化ナトリウム塩（99.5％）はSigma Aldrich（オーストラリア、NSW、Castle Hill）から購入しました。塩酸（HCl）および水酸化ナトリウム（NaOH）は、Merck Ltd.から購入した。

QCM-D Measurement

Quartz Crystal Microbalance with dissipation measurementsは、Biolin Scientific Ltd.のE4-QCM-D装置で実施された。金でコーティングした水晶センサーは、H2O2：NH3：H2O（1：5：5）溶液で15分間洗浄し、その後UV-Ozoneで10分間洗浄した後に使用されました。 1 mg/mL BSAを生理食塩水（0.9% NaCl）に溶解し、溶液のpHをpH7.0および4.5に設定した。別途、生理食塩水のpHを7.0と4.5に調整した。調製した溶液は，蠕動ポンプにより液体セルモジュールに通液した。基本周波数5MHzと6種類の奇数倍音（1、3、5、7、9、13）に対する水晶センサーの共振周波数（F）と散逸（D）の変化を同時にモニターした。

最初に生理食塩水を液体セル内に送り込み、安定したベースラインを生成するために平衡化させた。その後、生理食塩水中のBSAをセルに通し、BSA分子が金の界面に吸着するようにした。その後、生理食塩水をポンプで送り、付着していないBSA分子を除去した。

得られた共振周波数ΔFと散逸ΔDの変化をDfindというソフトウェアを用いてSauerbreyモデルでフィッティングした。

DLS Measurement

DLS particle size analyzer (Brookhaven Nanobrook Omni) を用いて、異なるpH (4.5 and 7.0) の生理食塩水に分散したBSAの動的光散乱 (DLS) を測定した。光源には40mW（640nm）の温度制御型赤色半導体レーザーを用いた。測定は3回行い、平均化した。すべての測定は室温（22℃）で行われた。

接触角測定

金と金界面に異なるpHで吸着したBSAの接触角は、セットアップOCA 35 DataPhysics Instruments GmbH、ドイツを用いて測定された。測定は、測定後にQCMセットアップから取り出したセンサー表面で直接行われた。すべての測定は室温（22℃）で行った。 8852>

原子間力顕微鏡（AFM）

原子間力顕微鏡の測定は、JPK Nanowizard III AFMを使用してタッピングモードで実施されました。イメージング用に選択したカンチレバー（AC160TS-R3）は公称周波数300 kHz、バネ定数26 N/mであった。イメージングを行ったのは、裸の金界面と、金界面にpH4.5で吸着したBSA層である。画像は、測定後にQCMセットアップから取り出したセンサー表面で直接撮影した。測定はすべて室温（22℃）で行った。

結果

固液界面に吸着したBSA分子の可逆的なpH応答性吸水現象を，pH7.0と4.5の食塩水によるリンスサイクルを用いてQCM-Dにより研究した。金はその疎水性がBSAの吸着を方向付けるため、固体界面として選択した（Lori and Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016）。異なるpH値で吸着したBSA層を、pH4.5と7.0の生理食塩水で交互に繰り返し洗浄する。さらに、イオン強度が吸着BSA層に及ぼす影響を評価するために、純Milli-Q水によるリンスも行った。

図1（上）は、BSA/食塩水溶液からpH7.0で吸着したBSA分子の周波数（F5およびF7）の変化、続いて元の食塩水（pH7）によるリンスを行っている様子を示している。次のすすぎサイクルは、生理食塩水でpH4.5で行った。 8852>

FIGURE 1

Figure 1.pH4.5とpH7の生理食塩水の交互サイクルが続く。 (上) 0.9% NaCl食塩水中のBSA (1 mg/mL) の液体-金界面への吸着 (pH 7.0). BSA吸着飽和後、センサー表面をpH7.0の生理食塩水でリンスし、その後、pH4.5、pH7.0、水の生理食塩水でリンスするサイクルを繰り返すと、センサー表面はBSAの吸着に成功した。 (下) 0.9% NaCl食塩水中のBSA (1 mg/mL)の液体-金界面への吸着。 BSAの吸着が飽和した後、センサー表面をpH4.5の生理食塩水で洗浄し、その後、pH7.0、pH4.5、水の生理食塩水の洗浄を繰り返した。

Figure 1において、最初の安定したベースラインの後、Fが急に減少することが観測されており、金と液体の界面でBSA分子を吸着していることがわかる。 FはΔF = -35.5まで減少し、安定した。生理食塩水（pH7）で洗浄すると、FはΔF = -35.5からΔF = -34.0に増加し、表面から非吸着BSA分子が除去されたことが示された。生理食塩水（pH4.5）で洗浄した後、FはさらにΔF = -30.0まで増加し、センサー表面からさらに質量が減少したことがわかる。これは、BSA層への水分子の吸着により、センサー表面での質量が増加したことを意味する。 8852>

2番目の実験では、最初の実験と同様に、pH4.5でのBSA分子の吸着に続いて、異なるpHでの塩水洗浄を繰り返した（図1：下）。吸着したBSA分子は、FがΔF=-38.5まで減少したことに対応する。生理食塩水（pH4.5）で洗浄すると、非吸着BSAが除去される（ΔF = -38.0）。

塩水（pH7.0）で洗浄すると、金表面での層の質量がさらに増加し、ΔF = -43までのFの減少に相当する。この質量増加は、BSA層に水分子が吸収されたためである。その後、生理食塩水（pH4.5）で洗浄すると水分子は脱離し、F値はΔF = -37に戻る。

同じ実験で、純水でリンスすることにより、吸着したBSA層に対するイオン強度の影響を調査した。図1は、pH7.0と4.5でのBSA吸着を、異なるpHの食塩水と純Milli-Q水でのリンスサイクルで示した。

どちらの場合も、水リンスはΔF = -29.2 (pH 4.5 のBSA吸着)と -26.5 (pH 7.0 のBSA 吸着)の値を増大させる。これは、水洗いをすることでさらに質量が減少し、界面から水分子がさらに脱離することに対応することを示している。

興味深いことに、すべての実験において、pH4.5と7.0での交互の塩水すすぎサイクルは、吸着したBSA層内で水分子の可逆的収縮を示す。 pH7.0の生理食塩水でBSA層をすすぐと、BSA層構造内の水分子が吸着され、固液界面の質量が増加する。一方、pH4.5の生理食塩水でBSA層を洗浄すると、BSA層から水分子が放出され、界面の質量が減少する。

塩水洗浄（異なるpH）時の吸水現象は、吸着したBSA層のみに起因しており、裸の金センサーに対する別の塩水洗浄実験によって確認されている（補足資料S1）。ベアゴールドセンサーの周波数は、生理食塩水（pH 4.5）により安定したベースラインが維持される。その後、pH7.0とpH4.5の生理食塩水の代替洗浄サイクルで金界面を洗浄した(補足資料S1)。その結果、異なるpHの代替食塩水洗浄が金センサーの周波数に影響を与えないことが明らかになった。したがって、金上の吸着BSA層のみが異なるpH値での生理食塩水洗浄サイクルで周波数の変化を示す。

吸着BSA層の吸着質量、表面被覆率および厚さは、QCMデータにSauerbreyモデルを適合させることによって抽出される。このモデルは、我々のすべての実験で観察されたように、散逸値が2未満である剛体層に適合させるために使用される（補足資料S2）。 Sauerbrey方程式はΔm=-CΔfnで与えられ、ここで、C=17.7ng/Hz.cm2は5MHz金コーティング水晶の定数、nはオーバートーン、Δmは吸着質量、Δfは周波数の変化です。

BSA分子はpH7.0で質量被覆6.3mg/㎡（厚み5.6nm）まで吸着しました（図2A）。生理食塩水（pH4.5）で事前に吸着したBSA層をすすぐと、質量被覆率が5.6 mg/m2に、厚さが4.9 nmに減少した（表1）。これは、吸着したBSA層構造から水分子が放出されたためであった。さらに生理食塩水（pH7.0）で洗浄すると、同じ量の水分子が再吸着される。質量変化の差はΔm＝0.7mg/m2である。

図2

図2.質量変化の差はΔm＝0.7mg/m2である。金界面に吸着したBSAの質量（左）と厚さ（右）、およびpH7.0と4.5での生理食塩水洗浄サイクルに伴う変化。 (A) pH7.0で吸着したBSAを水洗したもの。 (B)pH4.5で吸着し、水洗したBSA。

TABLE 1

Table 1.表1.吸着したBSA。 QCM-DデータをSauerbreyモデルでモデル化することによる吸着質量（mg/m2）

図2Bにおいて同様に、pH4.5の事前吸着BSA層を食塩水ですすぎ（pH7.0において）吸着質量が6.4mg/m2から7.4mg/m2と厚さが6.2から6.9nmとなり、この原因はBSA層における水の分子に吸収されているためである。 pHの異なる生理食塩水のすすぎサイクルでは、質量変化差Δm=1.0 mg/m2を保ち、pH7.0での質量変化（0.7 mg/m2）より1.4倍大きい。

異なるpHでの吸着質量差から、生理食塩水のすすぎサイクルでBSA層に吸着／脱着した水分子の平均数を算出した（補足資料S3）。 pH4.5で吸着したBSA層は、水洗サイクル中に3.3×1019個の水分子を吸着/脱着し、これは570個の水分子/BSA分子に相当する（表1）。しかし、pH7.0に吸着したBSA層は、可逆的な食塩水洗浄サイクルの間、2.3×1019個の水分子を吸着/脱着し、450個の水分子/BSA分子を表します。

動的光散乱（DLS）測定により、生理食塩水中のBSAのpH4.5とpH7.0での凝集状態と非凝集状態を明らかにした（図3）。 pH4.5では、DLSはBSA分子の凝集を明らかにし、複数のサイズ分布を示した。 5 nm、10 nm、20 nm、50 nmである。しかし、pH7.0では、BSA分子は静電反発のために凝集せず、5nmと10nmのサイズ分布を示している。水和BSAの5および10 nmのサイズは、個々のBSA分子のサイズおよび形状（14 nm×4 nm×4 nm）と同等である（Andereggら、1955；WrightおよびThompson、1975）

図3

図3. pH 4.5 (A) および pH 7 (B) における生理食塩水中の BSA の動的光散乱 (DLS) 測定。 pH4.5では、BSAは5、10、20、50 nmに最大値を持つ複数のサイズ分布を示している。 pH7.0では、BSAは5nmと10nmの2つのサイズ分布のみを示した。

原子間力顕微鏡の画像は、金の界面にBSA分子が吸着していることを確認した（図4）。これらの画像は、裸の金（図4a、b）とpH4.5で金界面に吸着したBSA（図4c、d）の表面形状の違いを示している。裸の金（図4b）とBSA吸着面（図4d）の拡大画像を比較すると、両者の表面の違いが顕著にわかる。どちらの表面も粒子が形成されていますが、その定義が異なるため、画像化される物質も異なります。裸の金表面の粒子は、BSAコーティングされた表面と比較して、より硬い材料を示している（例えば、形状間の境界が鮮明であるなど）。 BSAでコーティングされた金には、BSA分子の凝集体がさらに存在していることがわかる。 BSAコーティングされた金の拡大AFM画像（図4d）は、凝集したBSA分子の横方向の寸法が、5〜15nmの範囲の高さで、30〜100nmの間で変化することを示す。 (a) 裸の金界面のAFM画像 (b) 裸の金界面の拡大/拡大画像 (c) pH4.5で金界面に吸着したBSA層 (d) BSAコーティングした金の拡大/拡大画像。

金と金に吸着したBSAという二つの表面で水滴が作る接触角は、濡れ性を明らかにするために測定した(図5)。金センサーは親水性で、接触角は 66°であった。しかし、pH4.5で吸着したBSA層は、水の接触角が60°に減少し、さらにpH7.0で吸着したBSA層では55°に減少し、より親水的になっていることがわかった。シリコン表面に吸着したBSA層についても、水の接触角が57°（pH4.5時）から54°（pH7.0時）へと減少し、同様の観察結果が報告されている（Jachimska et al.、2016）。異なるpHで吸着したBSAの接触角と層厚の変化は、金界面での吸着プロセス中の構造および地形の違いを示している

Figure 5

Figure 5. pH4.5（中）およびpH7.0（下）における、裸の金界面（上）および金界面に吸着したBSA層の接触角測定

考察

BSAの等電点とはpH4.5-4.8の間にあり、これは分子の純電荷がゼロになるpHである。等電点付近では、BSA分子の分子間静電反発が小さくなる。また、生理食塩水の高いイオン強度（0.15M）は、電荷を遮蔽し、静電的相互作用を阻害する役割を担っている。そのため、BSA分子はBSA/生理食塩水懸濁液中で凝集する。 DLS測定（図3A）により、pH4.5のBSA/生理食塩水懸濁液に最大60 nmのサイズのBSA凝集体が存在することが確認された

金界面でのBSA吸着（pH4.5）中、金界面に向けたBSAの静電引力は期待されない。しかし、球状BSAタンパク質からの弱い正電荷は、界面での吸着に十分なドリフトを提供することができる（Suら、1998a；Jachimskaら、2016）。複数の論文が、等電点付近のBSAおよび類似のタンパク質の吸着が、静電相互作用を上回る疎水性相互作用によって駆動されることを以前に報告している（Uyenら、1990；Tiltonら、1991；FigueiraとJones、2008；Norde、2008；Jeyachandranら、2009；Rabeら、2011；Huangら、2017；Xuら、2018；Attwoodら、2019）。接触角測定（図5）は、裸の金界面は疎水性が低く、アルブミンは疎水性相互作用を介して金と結合することを示している（Norde and Giacomelli, 2000; Figueira and Jones, 2008）。 BSA分子間の反発が遮蔽されているため、水和BSA分子は凝集体として多量（6.4 mg/m2）に吸着し、金界面に複数の接触点を持つようになった（図6A）。 AFM画像（図4C,D）により、金界面へのBSA分子の吸着と凝集が確認された。 AFM画像から、凝集体の横方向の寸法は30～100 nmで、高さは5～15 nmの間に分布していることがわかった。このことから、BSA分子は立った状態と平らな状態の両方の組み合わせで吸着していることが確認された。

FigURE 6

Figure 6. (A) pH4.5および7.0における液体/金界面でのBSAの収着とコンフォメーションの模式図である。 BSA層の生理食塩水リンスは、pH7.0/4.5で水分子を吸着/脱着させる。 (B) Sauerbreyモデルから評価したBSA層の厚み。 pH4.5とpH7.0で吸着した水和BSA層は、異なる食塩水と水洗サイクルでプロットされている。

pH 7.0で、BSA分子は負に帯電している。これは、BSA分子間に静電反発を生じさせ、溶液中のBSAの凝集を阻害する。 DLS測定では、サイズ5および10 nmの非凝集BSA分子の分布が示された（図3B）。これらのサイズは、個々のBSA分子の寸法（14 nm×4 nm×4 nm）と同等である（Andereggら、1955；WrightとThompson、1975）。 BSAが金に吸着する際、静電的反発と疎水的相互作用の両方が組み合わさって界面にBSA層が形成される。吸着したBSA分子間の強い横方向の分子間反発により、界面でのBSA吸着容量（5.6 mg/m2）は減少する。したがって、BSA分子は個々の分子として（凝集体ではなく）吸着し、金界面で単分子膜を形成する（図6A）。

QCM-D実験（図1）では、予め水和したBSA分子が界面に吸着している。異なるpHの生理食塩水で洗浄すると、BSA層はさらに水分子を吸着/脱着する。 pH4.5で吸着したBSAは、pH7.0で吸着したBSA分子（0.7mg/m2）と比較して、より多くの水分子を取り込み、放出する（1.0mg/m2）。その理由は、pH4.5で吸着したBSAの量（6.4 mg/m2）がpH7.0で吸着したBSAの量（5.6 mg/m2）よりも多いためである。

金センサーの表面を完全に覆うために吸着したBSA分子の計算乾燥質量（非水化）は約2 mg/m2である（補足資料S3）。計算された乾燥質量は、報告された文献（Jachimska et al.、2016）と同等である。乾燥したBSA分子が水和されると、その親水基は急速に水と結合した。この結合は、水の双極性構造がBSAの極性基と相互作用するためである。水和したBSAでは、一部の水分子はしっかりと結合しているが、他の水分子は緩く結合しているか、単にBSAのループ構造の間に巻き込まれているに過ぎない。 BSA層を水和させる水の量は、界面での吸着質量分率を増加させる。異なるpH値での生理食塩水洗浄サイクルでは、吸着したBSA層の電荷が再分配される。この電荷の再分配により、吸着BSA層とバルク溶液の間に勾配が生じる。 BSA層の厚さは、SauerbreyモデルをQCM-Dデータにフィットさせることによって評価される(図2)。 pH4.5で吸着し、生理食塩水（pH7.0）で洗浄した水和BSA層は、6.9 nmという大きな厚さを与える（図6B）。大量のBSA分子（6.4 mg/m2）が多くの水分子を取り込み、BSA層を膨潤させたと考えられる。同じ層を生理食塩水（pH4.5）ですすぐと、層厚は6.4 nmに減少するが、これは層から水分子が放出されたためである。同様の現象は、pH7.0で吸着させたBSA分子にも見られる。しかし、BSA層の厚さは、pH4.5で吸着したBSA層の場合よりも薄い（図6B）。

さらに、両方のpH値における吸着BSA層は、塩水洗浄サイクルの間も剛直で不可逆的に付着したままである。 pHの変動中は、水分子の収着のみが発生する。 BSAの硬さと不可逆性は、BSAの大きなサイズと高い分子量に起因しています。 BSA分子は静電相互作用と疎水性相互作用によって金-液体界面に多数の接触点を形成し、界面からのBSA分子の脱離を防いでいる。

BSA層は溶液のイオン強度が変化しても（脱イオン水によるリンス）金界面から剥離しない。水洗いはBSA層からより多くの水分子を脱離させるだけで、センサー表面の質量はさらに減少する（図2）。水和BSAのイオン強度を純水で変化させると、層からより多くの水分子が放出される。図6Bに示すように、BSA層は厚さ4.8 nm（pH 4.5で吸着した場合）および4.3 nm（pH 7.0で吸着した場合）に収縮する。 8852>

結論

生理食塩水（0.9% NaCl）中のウシ血清アルブミンは、pH7.0と4.5の金-液体界面に吸着させた。その動的過程をQCM-Dで測定し，AFM，DLS，接触角測定で確認した。 pH4.5と7.0の生理食塩水のリンスサイクルを行うことで、吸着したBSA層に対して可逆的で高速かつpH依存的な水収着現象が観察された。水分子はpH7.0ではBSA層を水和させ、pH4.5では脱水させる。 pH4.5で吸着したBSA層は、pH7.0で吸着したBSA層よりも1.4倍多くの水分子によって水和されている。この現象は、異なるpHで吸着されたBSA分子がとるコンフォメーションの違いによって説明される。 pH4.5の等電点付近では、BSA分子は中和して凝集体として多量に吸着する。 6.4mg/m2である。 pH7.0では、BSA分子は帯電し（静電反発）、個々の分子の層として吸着する：5.6 mg/m2。金界面に吸着したBSA分子の凝集層（pH4.5）は、水分子450個/BSAを保持するBSA分子の個別層（pH7.0）よりも多くの水分子（570個/BSA）を取り込んでいることがわかる。 BSA層を純水で洗浄してイオン強度を変えても、吸着した層構造からより多くの水を脱離させるだけである。いずれの場合も、BSA層は金界面に硬く不可逆的に吸着しており、水洗サイクル中に水分子のみが吸脱着していることがわかる。

Data Availability Statement

本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより、資格ある研究者であれば誰でも、不当な予約なしに入手できる。

Author Contributions

VR, CB, BYが実験を実施した。

資金援助

この研究は、オーストラリア研究会議（ARC）、オーストラリア紙、Norske Skog、Orora、Visiによる産業変革研究ハブ助成金IH170100020によって支援されたものである。

利益相反

著者は、潜在的な利益相反と解釈される商業的または金銭的関係がない状態で研究が行われたことを宣言します。