Frontiers in Endocrinology

BY admin

| 11月 14, 2021

Introduction
材料と方法
研究方法と対象者
データ収集と臨床的定義
アシルカルニチンの定量
Statistical Analysis
結果
試験対象者の説明
アシルカルニチンの抽出因子
抽出された因子とT2DMにおけるCVDリスクとの関連
感度分析
考察
Data Availability Statement
Ethics Statement
著者貢献
資金
利益相反
謝辞
補足資料

Introduction

心血管病（CVD）は2型糖尿病患者で最も多く、死亡や身体障害を引き起こす重度糖尿病合併症です … T2DM患者は、T2DMでない患者に比べてCVDのリスクが2～3倍高い(3, 4)。血圧、脂質、肥満度などの従来の因子と比較して、メタボローム解析によって検出される内因性低分子化合物は、細胞の栄養、薬剤、環境汚染物質、その他の外的要因の共同作用に関連する細胞の状態を反映する可能性が高いです(7)。アシルカルニチン代謝物は、遊離カルニチンと脂肪酸から生成されるアシル-コエンザイムA（アシル-CoA）が結合して生成するエステル物質群です(8)。あるコホート研究により、ある種のアシルカルニチンの血漿中濃度は、T2DM患者において非TDM患者よりも高いことが見出された(9)。さらに、果糖負荷マウスの心臓組織におけるアシルカルニチンおよびミトコンドリアの4-ヒドロキシノネナール濃度は、対照群に比べ高かった(10)。 4-hydroxynonenalは過酸化脂質によって生成されるため、4-hydroxynonenalの増加は高い酸化ストレスを示唆すると考えられる(11)。しかし、T2DMにおけるアシルカルニチンとCVDの関連を検討した臨床研究はわずかである。そこで、中国人のT2DM患者を対象に、アシルカルニチン代謝物とCVDの関連を推定するために、病院ベースの横断的調査を実施した。

材料と方法

研究方法と対象者

この研究では、T2DMにおけるアシルカルニチンとCVDの関連を調べるために横断的研究デザインを使用した。 2015年5月から2016年8月に入院した中国錦州市の遼寧医科大学第一付属病院（LMUFAH）の主要電子データベースから代謝物データが入手可能な入院患者2,554人の電子カルテを検索した（12）

対象基準は以下のように設定した。 (1）年齢≧18歳、（2）T2DMと診断され、（3）アシルカルニチン代謝物が摂取可能であったこと。アセチルカルニチン（C2）、プロピオニルカルニチン（C3）、ブチルカルニチン（C4）、ヒドロキシルブチルカルニチン（C4-OH）、スクシニルカルニチン（C4DC）、イソバレリルカルニチン（C5）、3ヒドロキシイソバレリルカルニチン（C5-OH）、グルタリルカルニチン（C5DC）、チグリルカルニチン（C5:1）、ヘキサノイルカルニチン（C6）、オクタノイルカルニチン（C8）、デカノイルカルニチン（C10）、ラウロイルカルニチン（C12）、ミリストイルカルニチン（C14）、3-ヒドロキシルテトラデカノイルカルニチン（C14-OH）、テトラデカノイルジアルキルカルニチン（C14DC）、テトラデセノイルカルニチン（C14:1）、パルミトイルカルニチン（C16）、3-ヒドロキシパルミトイルカルニチン（C16-OH）、3-ヒドロキシパルミトレイルカルニチン（C16：1-OH）、オクタデカノイルカルニチン（C18）、アラキジンカルニチン（C20）、ベヘンカルニチン（C22）、テトラコサンカルニチン（C24）、ヘキサコサンカルニチン（C26）であった。除外基準は以下の通り。 (1）1型糖尿病と診断された者、（2）妊娠中の者。除外基準を満たした、合計741名のT2DM患者が解析に含まれた。

研究の倫理的承認はLMUFAHの臨床研究倫理委員会から得られ、横断的研究の後ろ向きな性質から、LMUFAHの臨床研究倫理委員会によりインフォームドコンセントは放棄された。

データ収集と臨床的定義

人口統計学的および臨床的データは、病院の主要電子データベースから取得し、年齢、性別、糖尿病の期間、糖尿病合併症、薬剤使用状況（抗糖尿病薬、糖尿病薬。 BMI、収縮期血圧（SBP）、拡張期血圧（DBP）、糖化ヘモグロビン（HbA1c）、トリグリセリド（TG）、低密度リポ蛋白質コレステロール（LDL-C）、高密度リポ蛋白質コレステロール（HDL-C）、などを測定。）

CVDは冠動脈疾患（CAD）、心不全（HF）、脳卒中の既往があることと定義した。 BMIは体重（キログラム）を身長（メートル）の二乗で割った値（kg/m2）で算出した。太り過ぎはBMI≧24.0kg/m2だが<28.0kg/m2と定義し、肥満は中国糖尿病学会が中国での使用を推奨しているBMI≧28.0kg/m2と定義した（13）。校正済み水銀血圧計を使用し、患者が5～10分間安静にしてからSBPとDBPを測定した。 T2DM患者から夜間空腹時血液（少なくとも8時間絶食）を採取した。 HbA1c、TG、HDL-C、LDL-Cの測定はLMUFAHの生化学研究所で行われた。アシルカルニチンは、アシル基の炭素数により、C2、C3、C4、C4-OH、C5、C5-OH、C5DC、C5.などの短鎖アシルカルニチンに分類され、さらに、アシル基の炭素数により、アシルカルニチンは、C2、C3、C4、C5-OH、C5DC、C5.などの短鎖アシルカルニチンにも分類されていた。C6、C8、C10、C12、C14、C14-OH、C14DC、C14：1、C16、C16-OH、C16：1-OH、C18、C20、C22、C24、C26などの長鎖アシルカルニチンである（14）。

アシルカルニチンの定量

メタボロミクスの測定方法は、以前の研究(15)に記載されていました。簡単に説明すると、8時間の絶食後に指穿刺で採取した乾燥血液スポット試料をメタボロミクス測定に使用した。乾燥血液スポット中のメタボロミクスは、質量分析（MS）技術を使用して測定された。 MSメタボローム解析にはAB Sciex 4000 QTrap system (AB Sciex, Framingham, MA, USA)を使用しました。 Electrospray ionization sourceをイオンソースとした。イオンスプレー電圧は4.5kVであった。ポジティブモードで分析対象物のスキャンを行った。移動相には80%アセトニトリル水溶液を用いた。絶対定量には、Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA) 製のアシルカルニチンの同位体標識内部標準を用いた。

Statistical Analysis

Statistical Analysis は Statistical Analysis System Release 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) で行った。 P < 0.05を統計的に有意であるとみなした。 2群間のカテゴリーデータは、必要に応じてカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定で比較し、数量と百分率で表現した。解析変数が連続変数の場合、正規性検定にP-P plotまたはQ-Q plotを用いた。正規分布に適合した連続変数は、平均値±標準偏差（SD）で表示し、Studentのt検定で比較した、または中央値と四分位範囲（IQR）で表示し、Wilcoxon Signed Rank検定で比較した。

多重比較に対処するために、多数の相関するアシルカルニチンから少数の相関しない因子に減らすために因子分析を使用した。因子分析への適合性を評価するために、Kaiser-Meyer-Olkin (KMO) とBartlett球形性検定が用いられた(16)。 KMO係数< 0.5は受け入れがたいが、0.8前後の値は有益と見なされる。主成分分析は、因子を抽出し、対応する因子負荷行列を得るために使用された。バリマックス回転により、最初の因子負荷行列を回転させ、最初の因子抽出よりも簡潔で解釈しやすい解を得た(17)。ある因子に対して最大のローディングを持つ個々のアシルカルニチンを、その因子の関連成分として使用した。 Scree plotは、因子分析における因子の固有値を線引きしたものである(18)。 scree plotの横軸は因子の数、縦軸は因子の固有値である。アシルカルニチン因子の数は、固有値、communalities、scree plotにより決定された：固有値＜6912＞1、communalities≧50%、scree plotの急斜面に位置する因子の数。

多変量バイナリロジスティック回帰を用いて、T2DMにおけるCVDに対する抽出したアシルカルニチン因子のオッズ比（OR）とその95%信頼区間（CI）を推定した。人口統計学的変数および臨床変数の交絡効果をコントロールするために、構造化調整スキームを適用した。具体的には、モデル1は単変量モデル、モデル2は他のアシルカルニチン因子について調整、モデル3はさらに年齢、性別、BMI、糖尿病期間、HbA1c、SBP、DBP、TG、LDL-C、HDL-Cについて調整、モデル4はモデル3で調整した変数に加えてさらに抗糖尿病薬、抗糖尿病薬、脂質低下薬などの薬剤使用について調整しました。

結果

試験対象者の説明

試験対象者の平均年齢は57.9歳（SD：14.1）、糖尿病期間の中央値は5年（IQR：0-10）であった。そのうち、391人（52.8％）が男性で、288人（38.9％）がCVD（CAD単独87人、脳卒中単独109人、HF単独6人、CADと脳卒中両方51人、CADとHF両方53人、脳卒中とHF両方18人、全て18人）だった（表1、データシート1）

TABLE1

表1.CADとHF両方、HFとCVD両方、CAD単独、HFと両方）

TATBLE1

非CVD群と比較して、CVDを有するT2DM患者は高齢で糖尿病期間が長く、SBPが高く、HbA1cが低く、インシュリンを使用しない傾向が強かった。これらの患者は、LDL-Cが低く、抗糖尿病薬の使用率が低く、脂質低下薬や降圧薬の使用率が高い傾向があった。性別、BMI、DBP、HDL-C、TGについては、両群間に有意差はなかった。 CVD患者では、C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14、C14-OH、C14：1が高く、C5-OHとC24が非患者に比べ低値であった。その他のアシルカルニチンは両群で同程度であった（表2）

TABLE 2

Table 2. T2DM患者のアシルカルニチンプロファイル。

アシルカルニチンの抽出因子

因子分析の結果は、高いKMO係数0.898とバートレット球性検定の高い有意P値<0.0001が示唆するように許容できるものであった。因子1〜5は固有値が1以上であり、スクリープロットの急勾配に位置していた（図1）。そこで、5因子を抽出し、バリマックス回転後の5因子に対するアシルカルニチンの負荷量を表3に示した。第1因子はC2、C4、C4-OH、C5DC、C6、C8、C14DC、第2因子はC10、C12、C14、C14-OH、C14：1、C16-OH、第3因子はC16、C16：1-OH、C18、C20、C3、第4因子はC22、C24、C26、第5因子はC4DC、C5、C5-OH、C5：1などであった。 5つの因子で全分散の65.9%を説明した。

FIGURE 1

Figure 1. scree plot上の因子の固有値。 scree plotの横軸は因子の数、縦軸は因子の固有値である。表3

表3.固有値が1以上の因子は5つであった。 25種類のアシルカルニチン代謝物によって得られた因子とその負荷量

抽出された因子とT2DMにおけるCVDリスクとの関連

因子1、2、4はすべて一変量解析でT2DMにおけるCVDリスクと正の関連を持っていた。他の因子で調整した後でも、これらの正の相関は有意であった（モデル2）。しかし、年齢、性別、BMI、糖尿病罹病期間、HbA1c、SBP、DBP、TG、LDL-C、HDL-Cをさらに調整した後も、CVDのリスクと正の関連があったのは因子1 (OR: 1.42, 95% CI: 1.03-1.95) と因子2 (OR: 1.24, 95% CI: 1.03-1.49) のみであった。薬剤の使用に関する最終調整後，因子1（OR：1.45，95％CI：1.03-2.03）および因子2（OR：1.23，95％CI：1.02-1.50）の効果量はほとんど変わらなかった（表4）。メタボローム因子と心血管イベントとの一変量および多変量の関連。

感度分析

HbA1cの欠損値を平均インピュテーションおよびマルチインピュテーションした後（n = 200）、T2DMのCVDリスクに対する因子1および2の効果量は、単変量および多変量解析で安定かつ有意に保たれた（表S1）

考察

本研究により一部のアシルカルニチン、すなわち, C2、C4、C4-OH、C5DC、C6、C8、C14DC（第1因子）、C10、C12、C14：1、C14、C14-OH、C16-OH（第2因子）がT2DのCVDリスクと関連し、その関連は他のアシルカルニチン因子や従来のCVDリスク因子とは独立であった。因子1、2で抽出されたこれらのアシルカルニチン代謝物は主に短鎖、中鎖アシルカルニチンであった

ヒトにおける長鎖脂肪酸酸化のエネルギー供給経路は以下の通りである。細胞内では長鎖脂肪酸（FA）がコエンザイムA（COA）と結合して長鎖アシル・コエンザイムA（acyl-COA）を形成する（19）。カルニチンは、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイル転移酵素1により、長鎖アシル-COAのアシル基と結合し、長鎖アシルカルニチンを形成する(20)。アシルカルニチンはカルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ（CATC）を介してミトコンドリア内に輸送される(21)。長鎖アシルカルニチンは、ミトコンドリア内膜のカルニチンパルミトイル転移酵素2により長鎖アシルCoAとカルニチンに分解される(22)。長鎖アシル-COAは超長鎖アシル-COAデヒドロゲナーゼの作用で脱水素され、エノイル-COAになる(23)。エノイル-COAは、エノイル-CoAヒドラターゼの制御下で水和して3-ヒドロキシアシル-CoAを生成する(23)。 3-ヒドロキシアシル-CoAは長鎖3-ヒドロキシアシル-CoA-デヒドロゲナーゼにより脱水素され、3-ケトアシル-CoAとなる(24)。 3-ケトアシル-CoAは長鎖レトアシル-CoAチオラーゼによるチオリシスを受け、アセチル-CoAと炭素鎖が2本短くなったアシル-CoAが生成する(25)。短縮型COAは、短鎖脂肪酸の酸化経路に入るまで、この代謝サイクルに再参入する。長鎖脂肪酸と比較して、中鎖および短鎖脂肪酸は、CACTの助けを借りずに直接ミトコンドリアに入ることができる。長鎖脂肪酸と同様に、中・短鎖脂肪酸は、いくつかの類似した酵素の複合触媒作用のもとで、比較される短縮型COAとアセチル-CoAを生成する。短縮型-COAは、アセチル-CoAに変換されるまで短鎖脂肪酸サイクルに再投入される。最後に、脂肪酸の酸化で生成したアセチル-CoAはトリカルボン酸サイクルに参加してエネルギーを供給する（図2A）

FIGURE 2

Figure 2. (A）健康な心筋細胞で脂肪酸がエネルギーを供給する経路。鎖状脂肪酸は、いくつかの酵素の複合触媒作用の下でアセチル補酵素Aを産生することによりエネルギーを供給する。 (B）心血管疾患を有する2型糖尿病患者の心筋細胞において、脂肪酸がエネルギーを供給する経路。遊離長鎖脂肪酸の蓄積は、中・短鎖脂肪酸の完全酸化を阻害し、中・短鎖アシル-COAを増加させることになる。中・短鎖アシルカルニチンは、これらのアシル-COAとカルニチンの組み合わせにより増加する。 FA、脂肪酸；COA、コエンザイムA；CPT 1、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1；CACT、カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ；CPT 2、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ2；VLCAD、超長鎖アシル-coA デヒドロゲナーゼ。 ECH, enoyl-CoA hydratase; LCHAD, long-chain 3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase; LCKAT, long-chain ketoacyl-CoA Thiolase; MCAD, medium-chain acyl-CoA dehydrogenase; MCKAT, medium-chain 3-ketoacyl-CoA thiolase; TCA, tricarboxylic acid.などの酵素。

いくつかの研究で、ob/obおよびdb/dbマウスにおいて、グルコース酸化率の低下、FAの酸化率の上昇、心筋酸素消費量の増加が報告されている（26, 27）。アメリカの研究チームは、上記のマウスを異なる週齢で繰り返し測定することにより、同様の結論を導き出した(28)。この研究チームは、さらにPCR実験を行い、FAの取り込みと酸化に関わる遺伝子の発現がバランスを崩し、心筋細胞に入ったFAがミトコンドリアの酸化力を上回ったのではないかと推測している。さらに、いくつかの他の研究では、Zuckerラットの心筋細胞は、心筋細胞中の長鎖FAが増加するのに比べて、酸化は有意に増加しないことがわかった(29, 30)。ヒトのFA量を測定した研究では、FA酸化速度は増加したものの、摂取量の増加により脂肪酸酸化量の割合が低くなっていることがわかった（31）。その上、FAの過負荷がかかると、アシル-CoAが細胞質に蓄積されることがある(32)。メタボローム解析では、非TDM患者と比較して、T2DM患者では長鎖脂肪酸の酸化が不完全であり、C6、C8、C10、C12、C14の血漿中濃度が有意に上昇することがわかった(33)。体脂肪率がC2、C3、C4、C5、C6、C8：1、C16：1の血清レベルと正の相関があることを示した研究者もいる(34)。体脂肪が高いと脂肪酸のβ酸化が不完全になり、短鎖または中鎖アシルカルニチンの量が優位になることと相関があると思われた。また、C2, C6, C8, C10, C12, C14, C14:1, C14-OHの血清レベルが糖尿病予備軍で上昇していた(34)。

したがって、T2DM患者では心筋細胞の脂肪酸酸化率がわずかに上昇しても、心筋細胞に蓄積した長鎖フリーFAを十分に酸化できないのではないかと推測した。蓄積された遊離脂肪酸は心毒性を誘発する。一方、長鎖脂肪酸の酸化速度が上昇することにより、中鎖・短鎖脂肪酸の酸化経路が阻害される可能性がある。この阻害により、中・短鎖のコエンザイムAは十分にアセチル-CoAに変換されない。最後に、アシル-CoA結合カルニチンの累積は、中鎖および短鎖アシルカルニチンの増加をもたらす（図2B）

我々の研究で気づいたいくつかの限界があった。まず、本研究は横断的研究であり、アシルカルニチンとT2DMにおけるCVDの因果関係を立証することはできなかった。第二に、本研究の対象者は入院患者であった。彼らのT2DMは、一般的なT2DM患者よりも重症であった。したがって、我々の知見を一般的なT2DM患者集団に外挿することはできない。第三に、我々の研究では食事要因を収集しておらず、食事習慣は我々の分析における主要な交絡因子の一つである可能性がある(35)。しかし、我々は、他のアシルカルニチン代謝物、年齢、BMI、血圧、HbA1c、脂質プロファイルなどの人口統計学的および臨床的要因の交絡の可能性について慎重に調整した。食事の「成果」として、これらのアシルカルニチン代謝物や臨床因子を調整することで、食習慣の交絡効果を部分的に取り除くことができたと思われる。しかし、これらの交絡因子を注意深く調整しても、未調整の交絡因子が存在することは否定できないことを認識した。したがって、この結果は慎重に解釈される必要がある。第四に、我々はインスリン抵抗性とアシル-CoAのレベルを決定していない。最後に、HbA1cについては、我々の被験者で200例が欠落していた。しかし，これらの関連は平均値インピュテーションや多重インピュテーション後も安定しており，大きなバイアスは考えにくいことが示唆された＜8634＞＜2480＞我々の研究は，公衆衛生上重要な意味を持つものである。 CVDはT2DMによく見られる重篤な合併症であり，T2DMにおける早期死亡と有意に関連している。高血糖、高血圧、脂質異常の集中的な管理はT2DMにおけるCVDのリスクを減らすことができるが、CVDの残存リスクは実質的に高いままである(36)。 T2DMにおけるCVDのメカニズムをよりよく理解することが重要である。本研究は、T2DMの代謝異常からCVDに至る経路について新たな知見を提供した。

結論として、本研究では、中国の入院T2DM患者において、第1因子および第2因子で抽出されたアシルカルニチン代謝物の一部、すなわちC2、C4、C6、C8、C10、C12、C14、C14OHおよびC14：1 の血漿レベルの上昇がCVDリスクに関連していたことが判明した。

Data Availability Statement

本研究のデータセットは、MetabolightsのMTBLS1427で見ることができ、http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1427経由でアクセスすることが可能である。

Ethics Statement

ヒトを対象とした研究は、遼寧医科大学第一付属病院臨床研究倫理委員会の審査と承認を受けました。

著者貢献

Z-ZF、SZ、XYは研究を設計した。 SZとX-FFはデータを分析し、原稿を執筆した。 H-HLとMGはデータを収集した。 JL，Y-FC，X-YSは批判的なコメントを与え，原稿執筆に貢献した。 SZ、TH、J-XC、JZ、DSはこの原稿の改訂に参加した。

資金

本研究は、国家重点研究開発計画（2019YFA0802300）、遼寧省自然科学基金（20170540364）、遼寧省教育庁一般科学研究プロジェクト（L2015326）、遼寧省重点研究開発計画（2019JH8/10300036）の支援により行われたものです。第13次5ヵ年計画・都立大学人材プロジェクト（11601501/2016KJ0313）、大腸がんの個別診断・治療（LNCCC-B05-2015）、天津市科学技術委員会の基金（15JCYBJC54700）、中国ポストドクター科学基金（2016M590210）、天津保健局科学基金重点プロジェクト（16KG154）、天津千青年才能プロジェクト。

利益相反

著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。

謝辞

著者らは、この研究に参加してくれた錦州LMUFAHのすべての医師、看護師、研究スタッフに感謝する。

補足資料

この論文の補足資料は、オンラインで見ることができる。 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00212/full#supplementary-material

1. フェデレーションID IDF糖尿病アトラス-8th Edition. (2017). でオンライン公開されています。 https://diabetesatlas.org/IDF_Diabetes_Atlas_8e_interactive_EN/: International Diabetes Federation.

Google Scholar

2. フォーブスJM、クーパーME. 糖尿病合併症のメカニズム. Physiol Rev. (2013) 93:137-88. doi: 10.1152/physrev.00045.2011