HIV-1感染制限の構造的基盤の解明-完全長二重ドメインAPOBEC3GによるHIV-1感染制限の構造的基盤の解明。APOBEC3G

Overall structural features of fl rA3G

fl double-domain APOBEC proteinの構造研究において大きなハードルは溶解性の低さであった。 そこで、我々は霊長類のA3Gのホモログを調べ、アカゲザル由来のA3Gが溶解性に優れていることを見出した。 2つのfl rA3G変異コンストラクト（FKLおよびE/Qと呼ぶ）は、良好な挙動を示すタンパク質が得られ、異なる条件（補足表1）でそれぞれ2.47および2.40 Åまで回折する結晶が得られた（補足表1および2、補足図1）。 これらの2つのコンストラクトにおける追加の変更は、8残基のCD1ループ8をhA3G-CD2からの4残基のループ8で置換すること（E/QおよびFLKコンストラクトの両方と同様、補足表1、補足図1）を含むrA3Gの溶解度と収率を向上させた。 1）、CD1ループ7上の更なる変異F126Y、CD1 h6上のK180S/L184S、およびCD2ループ3の8残基欠失（FKL構築物におけるように、補足表1、補足図1B）。 なお、異種間感染のバリアーとして働くrA3GのK128は、ヒトA3G（hA3G）36と同様にアスパラギン酸残基（D128）へ変異している。 また、組換えタンパク質発現時の潜在的な毒性を回避するために、触媒のE259からQ/Aへの変異を含むコンストラクトを作成した。 変異した残基と構造上の位置を補足図1Bに示す。 CD1とCD2の構造はどちらも5残基の短いリンカー（R194からD198）でつながれた独立したドメインになっている（図1a, b）。 この2つの構造は、全体的な構造の類似性（図1a、b）にもかかわらず、CD2のコンフォメーションとCD1とCD2の間のパッキング方向（図1c、補足図2A）に明らかな違いが見られる。

rA3GFKLおよびE/Q構造はどちらも同じ正規のCD1構造を持っていて互いによく重なり合う（補足図2B、rmsd 0.445Å）． FKLとE/Q構造をCD1ドメインで並べると、E/Q構造のCD2ドメインはFKL構造のCD2ドメインと比較して約29°回転し、E/QのCD2ドメインはCD1に向かって約15 Å下方に、約8 Å移動し、CD1とのパッキング相互作用がより近くなる（補足 図2 A）。 CD1-CD2のパッキング界面の埋もれた表面積は、FKL構造では約623Å2、E/Q構造では約700Å2であった。 E/Q構造ではCD1-CD2パッキングがタイトなため、FKL構造よりも埋もれた表面積がわずかに大きくなっているが、これはリフォールディングとそのCD2の構造要素（h2-loop3）を配置する界面の密度が欠落しているためと思われる。

2種類のCD1とCD2ドメインの相互作用

FKL構造ではCD2ドメインは正規の折り畳みを示すが（補足図2C）、E/Q構造はCD2のコンフォメーションに大きな変化を示し（補足図2D）、ヘリックス2（h2）、ループ3、ループ4、Zn活性中心が大きく変化していることがわかった。 FKL構造（補足図2C）ではCD2の長いh2が、E/Q構造（補足図2D）では310の短いヘリックス（h2′）になり、ループ3とh2の一部（残基A246からE259）にまたがる14残基の無秩序なストレッチが生じた（補足図1A）。 このタイトパッキング構造での衝突を避けるためには、短い310個のh2と伸びたランダムコイル構造へのシフトが必要である（図1e）。 しかし、これによってh2とループ3の領域内のCD2 Zn活性中心のコンフォメーションも乱れ、Znの配位が取れなくなった（補足図2D）。 このようなZn配位の欠如は、他のAPOBEC、APOBEC3F (A3F) CD2構造でのみ観察されている46,47。 しかし、Znを含む、あるいは含まないA3F-CD2構造は本質的に同一であり、他のいくつかのAPOBEC構造ともよく整合する（補足図2E）。一方、E/Q CD2はリフォールドしたh2ループ3および4とZn中心構造においてユニークである（補足図2E）。 2E, F）。

E/Q構造におけるZnの消失とCD2のリフォールディングはこのコンストラクトの変異の結果である可能性もあるが、我々はE/Q変異体が触媒活性に欠陥があるかどうかを調査した。 E/Q構造中のE259QをWT触媒のE259に戻すと（E/Q*構造）、HEK293T細胞発現ライセートを用いた脱アミノ化アッセイで変異体の活性は完全に戻った（補足図3）。 さらに、個々の変異F126Y、K180S/L184S、またはCD2Δloop3（FKL構造と同様）を有するE/Q*は、複合変異を有するFKL*コンストラクト（E259AがE259に戻った）の活性はE/Q*およびWTより低いが、すべて活性を有していることがわかった。 これらの結果は、CD2ドメインのZnを欠いた結晶化したE/Q構造が触媒的に不活性なA3Gの構造状態を表していても、触媒残基をE259に戻すことでWTと同等のデアミナーゼ活性を完全に回復させることができることを示唆するものである。 FKLの複合変異は触媒活性に一部影響を与える。

FKLとE/Q構造では各ドメイン間のパッキングにおける回転角度が約29°異なるため、CD1とCD2間の詳細な分子間相互作用は2つの構造間で異なっている。 FKL構造におけるCD1とCD2ドメインは、主にCD1のh3、h4、ループ7とCD2のh1、h2、β2、ループ3を通して相互作用する（図1a、d）。 E/Q構造では、2つのドメインは主にCD1のh3、h4、h6とCD2のh2′、β2、ループ4、ループ10を介して相互作用している（図1b、e）。 その結果、CD1とCD2間の相互作用残基の約40%が2つの構造で異なっており（相互作用残基の完全リストは補足図4を参照）、同じ残基がこの相互作用に参加していても、2つのドメイン間のパッキング角が変化することにより、しばしば異なる結合接触をしていることが分かった。 CD1とCD2ドメインが異なる角度と残基相互作用でパッキングできることは、fl A3Gのドメイン配列にある程度の可塑性があることを示している。

完全長rA3G二量体と二量化領域の特徴

E/Q構築物は異なるpHと塩条件で結晶化したが（付表1）、常に同じ構造を示しCD1-CD1相互作用を介して二量体化していた（Fig. 2a, b）、主に両サブユニットのh6（K180, L184, A187）、ループ1（I26）、ループ7（F126, W127）のいくつかの残基の直接パッキングを介している（補足図5A, B）。 興味深いことに、これらの相互作用は、rA3GをHIV-1 Vif非感受性から分解感受性に変えるために重要なK128D変異を含んでいるにもかかわらず、以前にrA3G-CD1ドメイン単独で報告されたものと同じであった18。 このようなrA3Gの二量体化は、単量体の85Åから二量体の95Åへと最大寸法をわずかに増加させるだけであることは注目に値する（図2a, b）。 2: 全長rA3G二量体の全体的な特徴と二量体接合部の強化された静電ポテンシャル。

ヒトA3G（hA3G）の溶解度が低いため、同様の変異体を評価するために同じタイプの生化学アッセイができなかったので、rA3G CD1 h6がhA3G CD1 h6で置換されたrA3G-hA3Gキメラ変異体（h6 chimera）を作成した（補足表3参照）。 このh6キメラは精製中、RNase A処理前後の二量体／多量体化（補足図7A、B）、およびRNA会合、特にRNase A処理後（補足図7C、D）においてrA3G WTと同様の挙動を示した。 注目すべきは、補足図7A, Bに示すように、H6キメラタンパク質もRNase A処理後は二量体（D）、単量体（M）画分に移行する（補足図7BのSDS-PAGEゲル）のに対し、RNase A処理後は二量体（D）画分にも移行する点である（補足図7BのSDS-PAGEゲル）。 これは、キメラタンパク質がhA3Gの3つの残基（Y181, I183, I187）を持ち、rA3Gの残基（H181, T183, A187）よりも疎水性が高く、安定性や可溶性が低いためと思われた。 これらの結果は、CD1 h6がrA3GとhA3Gの間で交換可能である可能性を示唆しており、その結果、両方のタンパク質に本質的に同じ表面残基のセットを持つ同じPEP領域が存在することになる。

PEP mutation effect on RNA association and multimerization

次に我々は、二量体接合部の周りにできた増強PEP表面（図2、挿入部b）はRNA会合にとって重要かどうかを調べた。 R24を中心とした4つの正極性残基を変異させてrM12を作成した（R24T-S28A-N176A-N177D, Supplementary Table 3）。 R24Tを単独で含む変異体も含まれる。 rM12のRNA結合はR24TやWTに比べて減少しており（図3b, cのレーン4, 6, 7）、PEP領域内のこれらの残基がRNA結合を強化する役割を担っていることが示された。 しかし、rM9 (F126A/W127A/A187Y) と比較すると、rM12はRNase A処理前後でまだ相当量のRNAが結合していた（図3b, cのレーン1、4）。おそらくrA3Gの他の領域ではなく、PEP領域へのRNA結合が一部阻害されたためであると思われる。 予想外なことに、SEC解析の結果、rM12はRNase A処理前でも主要な単量体のピークを持っており（図3d, e, 補足図6A, B）、二量体化界面を直接変異させずに二量体／多量体化を崩壊させたことが明らかになった。 このPEP変異がRNAの会合や二量体化・多量体化に及ぼす負の効果は、PEP変異を含むさらに2つのrA3G変異体、rM13とrM14によってさらに確認された（補足表3、補足図7）。 これら2つの変異体は、試験条件下でRNase A処理前でも異なるレベルのRNA会合（補足図7A）および二量体化／多量体化の阻害を示した（補足図7CのSECプロファイルおよびゲル）。 3b, cでR24T変異体とWTが同程度のRNA量を示したにもかかわらず、RNase A処理前のSECピーク画分を詳細にSDS-PAGE解析すると、R24Tタンパク質のほとんどがモノマーピーク（M）位置付近に広がる画分に分布し（補足図6A）、WTがほとんどが空隙容量（V）画分に分布するのと対照的であることが明らかになった。 これらの結果は、PEP領域内の単一のR24T変異によってRNAの会合や多量体形成の挙動が変化することを示しており、R24A変異に関する先行研究14,30,38,40と一致するものであった。 これらの結果を総合すると、これらのアッセイ条件下では、二量体接合部の強化されたPEP領域内の残基（R24/S28/N176/N177）がRNA会合を仲介する重要な役割を果たし、これらの残基を介したRNA会合は逆に二量体の安定化とその後の高次多量化に必要であることが明らかとなった。

Effect of PEP/dimer mutations on in vitro RNA/DNA binding

fl rA3G構造は、図2cに示すように、増強したPEP領域の外側にも正電荷残基のある領域を追加していることがわかった。 PEP 領域の外側にあるこれらの正に帯電した残基は、大腸菌細胞溶解物から観察されたように、安定した A3G-RNA 複合体の形成に大きな役割を果たさないかもしれないが、定義した ssRNA および ssDNA 基質の結合にまだ寄与しているかもしれない。 このことを調べるために、精製したタンパク質をRNase処理し、結合したRNAを可能な限り除去し、50 nt ssRNAまたはssDNAオリゴマーに対する結合親和性をゲルシフトアッセイで調べた。 すべての変異体は50 nt ssRNAあるいはssDNAと結合し、推定解離定数（Kd、補足表3）により、ほとんどの変異体はWTおよびE/Qと比較して結合が減少していることが示された。 これらの結果は、高濃度のタンパク質と核酸が存在するこの再構成されたシステムにおいて、これらの様々なrA3Gダイマー界面およびPEP領域変異体は、ダイマー接合部のPEP領域外の他の残基を介してRNAやssDNAに結合する能力をまだ持っていることを示している。 興味深いことに、これらのrA3G変異体（rM9-rM12とrM15）の精製タンパク質を用いたデアミナーゼアッセイでは、これらのダイマー界面変異体とRNA結合変異体はすべてWTと比較してデアミナーゼ活性が低下していた（補足図8）。 これらの変異体のssDNA結合が低下していることが、少なくとも部分的にはデアミナーゼ活性の様々なレベルの低下を説明できる可能性がある。 しかし、ssDNA結合の低下の程度は、デアミナーゼ活性の破壊レベルと厳密な相関はないようである。 例えば、rM12は最も低いssDNA結合を示したが（補足表3）、最も低いデアミナーゼ活性を持つものではない（補足図8）。

Effects of PEP/dimer-interface mutations on HIV restriction

ヒトA3G（hA3G）上のW127A変異はビリオンのパッケージング、ひいてはHIV restrictionを乱すことが知られているが、おそらくこの残留物が仲介してRNA結合がなくなることによるものと考えられている。 しかし、Vprペプチド融合によってhA3G W127変異体のパッケージングを誘導した研究では、HIVの制限に欠陥があることが確認されている15。 hA3GによるHIV-1制限のメカニズムについてさらに理解を深めるために、我々はrA3Gの構造と変異データをもとに、さらにhA3G変異体を設計した。 これらのhA3G変異体（補足表4）の意図は、分子内のCD1-CD2相互作用を乱すこと（M2、M3、M4）（補足図9A、B）、極性/荷電残基の変異数を増やすことでダイマー接合部周辺のRNA結合を乱す（M12、M13、M14）、埋まった残基を変異させてタンパク質-タンパク質ダイマー相互作用を乱す（M6、M10、M11）（補足図）、であった。 9C）。

予想通り、WT hA3GはVif存在下ではHIV-1制限活性を持たないが、Vif非存在下ではHIV-1を完全に制限し、Vif耐性M1（D128K）構築物はVifの有無にかかわらずHIV感染を完全に制限した（図4a-c）。 一方、RNA結合と二量体化の両方を阻害することが知られているW127A含有変異体M9 (with mutations F126A/W127A/I187Y, Supplementary Fig. 9C) はVifの存在に関わらず制限活性を持っていなかった (Fig. 4a-c). このことは、W127がHIVの制限活性にとって重要であり、その理由はhA3Gビリオンのパッケージングと脱アミノに依存しない逆転写の制限に必要なRNA結合能にあるとする先行文献と一致している14,15。 実際、Vif分解に対する感受性が低下しているにもかかわらず（補足図10A）、M9変異体タンパク質のビリオンへのパッケージングは、WT hA3Gに比べてVifの有無にかかわらず、5〜10倍少なかった（図4a、b）。 図4：A3G野生型および変異体によるウイルス封入と制限

分子内CD1-CD2相互作用に影響を与えるように設計された変異体については、CD2側のドメイン間界面の近くまたは内部の複数の残基をM2およびM3について、CD1側でM4について変異を与えた（補足図9A、B）。 M2とM3は共にVif非存在下でHIV-1制限活性が著しく低下していた（図4C）。 CD1との界面付近のCD2ループ1および3に変異を有するM2は、触媒活性を完全に失った（図4e）。これは、H216などのこれらの変異残基の一部が、ssDNA基質相互作用に重要であるためと思われる49。 リンカー残基R194/H195から始まるCD2とCD1との界面に変異を持つM3（補足図9A, B）は、WTデアミナーゼ活性が10%程度しかなく（図4e）、これはおそらくCD2とCD1が適切に相互作用せず、効率の良い触媒活性のためのssDNA基質結合に影響を与えるためであろう。 CD1上のドメイン間界面周辺に複数の変異を持つM4は、WTと同様の特性を示し、これらの変異が制限能力に明らかな影響を及ぼさないことが示された。 興味深いことに、この変異は完全な触媒活性を有しており（図4e）、機能に対するCD1-CD2界面相互作用のある種の可塑性を示唆している。

M12 とM13はダイマー接合部のPEP領域へのRNA結合のみを破壊するよう設計されており、M14はM12とM13の変異のほとんどに、A3G-CD1に残る唯一の正電荷表面を除去すべく追加のR/K 残基4個（K52/K63/R69/K76）を含む（補足図9C）。 驚くべきことに、これらの変異体はすべてVif非存在下で約70%のHIV-1制限活性を示した（図4c）。 Vif感受性アッセイではM12、M13、M14の発現量が低く、Vif感受性の定量化が困難であったが（補足図10A）、3変異体ともWTと同様にVif存在下でHIV制限活性を示さず（図4c）、実際にはまだ十分にVifによる分解に敏感であったことが示唆された。 M12-14のHIV-1制限活性が70%しかない理由は、HEK293T細胞ライセートで検出される定常状態のタンパク質量が低いためではなかった（図4a、b）。M12-M14と同様の細胞発現レベルになるようにWT発現プラスミドを少なくトランスフェクションしてもWTから約4倍のHIV-1制限がもたらされた（補足図10B）からである。 これは、これら3つの変異体が脱アミノ化活性を破壊していたことから、脱アミノ化非依存的な制限活性と一致する（図4d, e）。 特にM14はデアミナーゼ活性が完全に失われていた(図4e)。 このことは、プロウイルスDNAの塩基配列決定結果に基づくM14のバックグラウンド変異率（補足表5）と一致していた。 それなのに、HIV-1制限活性は〜70%であった。 これらの結果は、CD1上のPEPとその近傍のRNA結合を破壊するためにM12-14で変異した残基は、HIVを制限する上で部分的な欠陥しか示さず、あるレベルのビリオンのカプセル化とHIV-1制限を保持していることを明確に示しており、ビリオンのパッケージ化とHIV制限に重要であるM9変異体のW127を含む変異を通じて媒介するRNA結合の役割とは対照的だった（図1参照）。 4a-c）。

変異の数が増えるにつれてタンパク質-タンパク質二量体相互作用のみを破壊することを意図した変異体は、M6からM11までである（補足表4、補足図9C）。 M7はCD2上の3つの変異により95%の触媒活性を失ったが、M6とM7はVif非存在下で部分的にしか制限活性を失わなかった（図4e）。 従って、M6とM7の変異はHIV制限に重要ではないことがわかった。 M10は、Vifがない場合、触媒活性を保持していても、HIV-1制限においてより厳しい表現型を示した（図4e）ことから、M10上の変異は、ビリオンのパッケージングとHIV制限に重要であることが示唆された。 M11は、デアミナーゼ活性はM10と似ているが、制限活性と統合性の点ではそれほど深刻な表現型ではない（図4c, d）。 M11はM10よりもRNA結合能を保持しており（rA3G変異体解析のrM10-11より、図3a-e）、その結果、表現型がより重篤でなかった可能性がある。 これらの結果を総合すると、埋もれたタンパク質-タンパク質二量体界面内の残基を変異させるだけでは、HIV制限活性は低下したまま保持され（図4c）、これらの変異体のデアミナーゼ活性の破壊（図4e）がHIV制限活性の低下を一部説明する可能性があることが示された。 このことは、HIV制限活性を示さなかったM9変異体（図4a-c）とはまた対照的である

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