Identifying tandem Ankyrin repeats in protein structures

ここで TP は正しく予測された既知のAnkyrin repeatタンパク質の数である。 FN -我々のアプローチによって見逃された既知のアンキリンリピートタンパク質の数、FP -我々のアプローチによってタンデムANKリピートを含むと予測されたがアンキリンタンパク質として注釈されていないタンパク質の数、TN -我々のアプローチによって非アンキリンタンパク質として正しく予測されたタンパク質の数です。 次に、予測されたアンキリンタンパク質について、125の既知のアンキリンリピートタンパク質のデータセットで正しく予測されたANKモチーフの数を分析し、最近の構造ベースのアプローチであるConSoleおよび配列ベースのアプローチであるRADARと比較した。 UniProtデータベースにおいて、これら125のタンパク質には合計584のANKモチーフがアノテーションされているが、提案するアプローチでは582、ConSoleでは528、RADARでは458のANKモチーフが予測された。 解析の詳細を表3(b)に、感度、精度として定義してまとめた。

where, TPは125タンパク質の既知のデータセットにおいて本手法により正しく予測したANKモチーフの数である。 FPは本手法で予測されたがUniProtデータベースで注釈されていないANKモチーフの数、FNは本手法で注釈されなかったANKモチーフの数である。 提案手法であるAnkPredの感度と精度はともに〜0.88であり、ConSole（0.72と0.79）およびRADAR（0.68と0.86）に比べて適度に良いことが観察されます。 末端コピーは配列保存性が低いことが知られており、その結果、RADAR法の感度が低くなっています。

提案する手法で予測されたリピート境界の精度を分析するために、125の既知のアンキリンタンパク質のデータセットで予測された582のANKモチーフのMultiple sequence alignment（MSA）をCLUSTALWで構築した。そして、予測された ANK モチーフのコンセンサスを SeaView を用いて 50%の同一性で構築し、以下に示す。

これは Kohl らと Mosavi らによって提案されたコンセンサス ANKモチーフと非常に良く一致する。 また、4-7位にTPLH、2位と13位にグリシン、21-22位にロイシンが保存されていることから、提案手法によるリピート境界の予測精度を確認することができた。 タンパク質またはタンパク質と核酸の複合体として表される総数98,341の構造がダウンロードされた。 短い断片 < 50 残基（これらは ANK モチーフの連続したコピーを含む可能性が低いため）と二次構造が割り当てられていないタンパク質を削除すると、合計 94,975 構造が解析に使用されました。 提案したアルゴリズムにより、少なくとも2つのタンデムに繰り返されるANKモチーフを含む819のタンパク質構造が同定されました。 これらのうち181個はUniProt、Pfam、PROSITE、PDBで既知のANKタンパク質として注釈されており、そのうち約50個の構造は設計されたANK反復タンパク質（DARPINS）であった。 正しく予測されたアンキリンリピートタンパク質の数は178であり、我々のアプローチでは3つだけ見逃されました。 最初の2つのケースでは、UniProtに注釈された繰り返し領域が3-4個のらせんを含むため、提案されたアプローチではANKモチーフの検出を逃しました。 3ZRHでは、2つの注釈付きANK反復配列は連続ではなく、23残基離れているため、我々のアプローチでは見逃されました。 したがって、残りの641個の構造は、これまで認識されていなかったアンキリンリピートとして提案され、追加ファイル2にリストアップされています。 これらのタンパク質のうち27個は他のリピートタイプを含むと注釈されている。すなわち、9 TPR、7 Pumilio repeat、2 HEAT、2 Annexin repeat、2 Tumor necrosis factor receptor (TNFR-Cys) 、2 Mitochondrial termination factor repeat (MTERF) 、2 Clathrin heavy chain repeat (CHCR) および 1 HAT (Additional file 2)である。 TPR、HEAT、HATモチーフはANKモチーフと構造的に非常によく似ており、それぞれがHelix-Turn-Helixコアを形成する2つの逆平行ヘリックスからなり、長さも30-34残基とほぼ同じであった。 大きな違いは、ANKモチーフにはβターンで終わる長いループがあり、TPR、HEAT、HATモチーフには存在しないことである。 このような構造モチーフの強い類似性があるにもかかわらず、我々のアプローチでは13件（TPR 9件、HEAT 3件、HAT 1件）しか偽陽性が報告されていません。 また、PymolのCealignモジュールを用いて、予測されたANKリピート領域と1N0RのDARPinモチーフの構造-構造重ね合わせを行い、予測の信頼性を確認した。 例えば、タンパク質1OUV（鎖A）では、図10（a）のPDBsumからの二次構造表現に示すように、H 1-H 14のヘリックスを含む29-278のUniProtデータベース（追加ファイル2）に7個のTPRのコピーが報告されている。 図10（b）に示すように、予測された3つのANK反復単位すべてについて二乗平均平方根偏差（RMSD）が< 3Åと良好な重ね合わせができた。 図10（c）の185から292までのアンキリン予測領域のA levcプロファイルも、図1（a）の典型的なANKモチーフのプロファイルと非常によく似ている。 この場合、予測されたANKリピートモチーフはTPR注釈領域内にあり、隣接する各TPRリピートから1つのヘリックスで構成され、H 2 i T i H 1 i + 1として表すことができる。ここでH 2 iはi番目のTPRモチーフの第2ヘリックス、H 1 i + 1は（i + 1）番目のTPRモチーフの第1ヘリックスである。 7つのアノテーションされたTPR領域の構造アラインメントを設計タンパク質1NA0の代表的なTPRモチーフで行ったところ、各繰り返し単位のRMSD < 2 Å（結果示さず）であり、UniProtアノテーションも正しいことが示唆された。 しかし、TPRモチーフ内の2つのヘリックス間のβターンは、典型的な設計されたTPRモチーフのそれよりも長く、ANKモチーフの末端ループに似ていることが観察された。 このことは、複雑なタンパク質にマルチリピート構造が存在する可能性を示唆している。 他の21のリピートタンパク質についても、同様のマルチリピートアーキテクチャが観察された。 HEATリピートタンパク質3LWW（chain A）の場合、UniProtでのアノテーションは、124-441の連続した6つのコピーと602-641と687-726の離れた2つのコピーであった。 ANKリピートは520-621の非HEAT領域にあり、HEATリピートとの重複は20残基と非常に小さいことが予測される。 この場合、2つの異なる繰り返しがタンパク質内の異なる領域に存在し、互いに重ならない2つの異なる繰り返しタイプを含む合計10個のタンパク質が観察された（追加ファイル2で’*’をマーク）。 これらのタンパク質では、相互作用部位を解析することで、複雑な構造を持つタンパク質の複数のアノテーションや機能を確認することができると思われます。 このように、ここで提案した構造に基づくアプローチは、タンパク質中のタンデム構造反復を検出するのに有望であり、アンキリンとTPR/HEAT/HATのような非常に類似した構造反復を区別するのに十分強力である。 (a）PDBsumからの二次構造表現（b）予測されたANK反復コピー（青色で示す）と設計されたANKタンパク質1N0Rの反復コピー（オレンジで示す）の構造アライメント（c）予測されたANK境界の開始と終了を示す点線と実線によるlevcプロット（a）。

モデルの構造で予測した結果を示す。 (a) インテグリン結合型プロテインキナーゼ（UniProt Id：Q99J82）。 AnkPredによって予測された5つのアンキリンモチーフの繰り返し境界（異なる色で示す）は、Uniprotにおいて注釈された5つのコピーとよく一致する。 (b) ANKRDタンパク質（UniProt Id: Q7Z3H0）。 この場合、3つのアンキリンモチーフのみがUniProtに注釈されている（中間コピー）のに対し、AnkPredは両側にさらに2つのコピーを予測する。