Inhibitor of Apoptosis Proteins: 基礎知識を臨床に活かす

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カスパーゼ阻害剤Inhibitor of Apoptosis Proteinファミリー

IAPは、カスパーゼ3、7、9を特異的に阻害し、それによってアポトーシスを防ぐカスパーゼ阻害剤ファミリーである。 Crookら（17）は、SF21バキュロウイルス細胞におけるvAcAnh誘発アポトーシスの研究中に、偶然にも最初のIAPファミリーのメンバーを同定した。 p35の作用を模倣し、vAcAnhによるアポトーシスを阻害するバキュロウイルス遺伝子を探索したところ、彼らは亜鉛フィンガー様モチーフを持つ31kDaの抗アポトーシス蛋白質をコードする1.6kbの新規遺伝子を同定した(17)。 その後、様々な生物種でIAPが同定され、IAPがカスパーゼを阻害することによりアポトーシスを抑制することが明らかになった（文献18参照）。 IAPタンパク質は、1〜3個のバキュロウイルスIAPリピート（BIR）ドメイン（約70アミノ酸からなる亜鉛結合領域）の存在により、このファミリーに分類される。 BIRドメインはIAPファミリーへの参加に必要であるが、すべてのBIR含有タンパク質が抗アポトーシス機能を持つわけではないので（19、20、21、22）、BIRドメインの存在はこのタンパク質ファミリーへの参加に必要ではあるが十分ではない。 IAPタンパク質は、RINGドメインやカスパーゼ活性化リクルートメント（CARD）ドメインを含むこともある（文献18に総説あり）。 IAPタンパク質は、RINGフィンガーの有無とBIRドメインの相同性に基づいて3つのクラス（クラス1、2、3）に分類されている（23）

図2.

IAPファミリータンパク質。 現在までに、共通のBIRドメインに基づいて、8つのヒトIAPファミリーのメンバーが同定されている。 IAPメンバーはまた、CARDドメインとRINGフィンガーモチーフを含むことがある。 BRUCEはE2ユビキチン化酵素モチーフ（Ubc）を持ち、NAIPはヌクレオチド結合ドメイン（NB）を持っている。 IAPタンパク質をグループ化するために、RINGフィンガーの有無とBIRドメインの相同性に基づいて3つのクラス（クラス1〜3）に分けられている。

クラス1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

クラス1のIAPは相同なBIRドメインとRINGフィンガーモチーフを含む。 X-linked IAPは3つのBIRドメインとRINGフィンガーを持っている。 このクラスで最初に同定されたIAPであり、現在でも最も特徴的なIAPである。 Duckettら（24）は、1996年にバキュロウイルスIAPに相同な哺乳類遺伝子の探索の結果、XIAPを同定した。 cIAP1 (別名 MIHB, hiap2, BIRC2) と cIAP2 (別名 MIHC, hiap2, BIRC3) はXIAPと構造的に関連があり、3つのBIRドメインとRINGフィンガーを持つ。 これらのIAPは、死の受容体TNF-R2に関連するタンパク質の生化学的精製によって同定されたが、この受容体における役割はまだ不明である(27)。 cIAP1とcIAP2はほとんどのヒトの組織で発現しているが、cIAP1は胸腺、精巣、卵巣で、cIAP2は脾臓と胸腺で最も発現が高い (27) 。cIAP1とcIAP2はXIAPより弱いとはいえカスパーゼ3と7に結合して阻害する (25)． カスパーゼ1、6、8を阻害することはない。 ML-IAP（livin、KIAP、BIRC7としても知られている）とILP-2はRINGフィンガーと1つのBIRドメインを持っているが、そのBIRドメインはXIAP、cIAP1、cIAP2のBIR3ドメインと最も相同性が高い（それゆえこのクラスに含まれているのであろう）。 ML-IAPは、正常な胎児肝臓、腎臓、成人の精巣や胸腺、またメラノーマやリンパ腫の細胞株で発現している。 ML-IAP は、カスパーゼ 3 と 9 を cIAP1 と同様の親和性で阻害するが、カスパーゼ 1、2、6、8 には結合せず阻害しない (28)。 ILP-2 の発現は、通常、成人の精巣に限定されているが、リンパ芽球系の細胞株でも確認されている。 ILP-2はカスパーゼ9を阻害するが、カスパーゼ3、7、8は阻害しない(29)。

Class 2 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

クラス2 IAPファミリーのNAIPは3つのBIRドメインを持っているがRING fingerモチーフは持っていない． そのBIRドメインはクラス1のIAPのBIRドメインとより遠縁にある。 NAIPは1995年にRoyら(30)が小児脊髄性筋萎縮症の原因遺伝子を5q13で検索しているときに同定された。 NAIPは成人の肝臓、胎盤、中枢神経系に発現している。

Class 3 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

クラス3のIAPメンバー、例えばサバイビンは単一のBIRドメインだけを含み、RINGフィンガーを持たない。 サバイビンは胎児の肝臓、腎臓、肺、消化管で発現しているが、ほとんどの正常な成人組織では発現していない(32)。 胎児組織で優先的に発現していることから、サバイビンが発生に関与していることが示唆される。 肺、膵臓、結腸、乳房、前立腺の腺癌を含む様々な悪性腫瘍でサバイビンは頻繁に過剰発現している(32、33、34、35、36)。

正常と悪性の細胞間の発現差は、治療目的で利用することが可能である。 例えば、サバイビンプロモーターは、目的の遺伝子が悪性細胞ではオンになるが、正常細胞ではオンにならない腫瘍特異的プロモーターとして使用することが可能である。 このような転写ターゲティングは、癌の遺伝子治療において価値があると思われる（37）。 あるいは、サバイビンの発現は、以下に詳述するように、悪性腫瘍の早期同定のための腫瘍マーカーとして使用され得る。

Inhibitor of Apoptosis Proteins Inhibit Active Caspases

Caspase inhibition is the best understood mechanism by which IAPs prevent apoptosis.これは、最もよく知られたIAPのアポトーシスを防止するメカニズムである。 酵素反応において、リコンビナントXIAPはカスパーゼ3、7、9を阻害するが、カスパーゼ8は阻害しない。 In vitroでは、293T細胞でXIAPを過剰発現させると、BAXとFASによるプロカスパーゼ3の切断とアポトーシスが阻止される(38)。 XIAPのカスパーゼ活性化に対する効果は、そのBIRドメインにマッピングされており、BIR2ドメインはカスパーゼ3と7を阻害し、BIR3 RINGドメインはカスパーゼ9を阻害する。

Structural Basis of Caspase Inhibition by X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.XIAP は、カスパーゼ活性化に対するXIAPの効果を示す。

IAPがカスパーゼを阻害することを示す細胞および酵素のデータを受けて、IAPとカスパーゼの物理的相互作用を調べる努力がなされた。 XIAPはリコンビナントで生産でき、結晶化も可能であることから、ほとんどの研究がXIAPに焦点をあてている。 XIAPは、カスパーゼ3、7とカスパーゼ9を別々のドメインで阻害する。 BIR2ドメイン（アミノ酸163-240）とそのNH2-末端延長部（アミノ酸124-162）はカスパーゼ3と7を阻害し、BIR3ドメイン（アミノ酸241-356）はカスパーゼ9を阻害する（39）。

BIR2 Domain Inhibits X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

XIAPがカスパーゼ3を阻害する仕組みとして、「フック、ライン、シンカー」モデルが提案されている（図3）⇓。 フック」（NH2末端の138-146残基）は、カスパーゼの活性部位を横切ることによってカスパーゼ3を阻害し、それによって活性型カスパーゼ3の基質結合ポケットをブロックしている。 線」はVal147上の2つのペプチド結合を表し、フックとシンカーをつなぐ。 シンカー」（残基148-150）はXIAPとカスパーゼ3との相互作用を安定化させる(40)。 このモデルでは、XIAPは立体障害によってカスパーゼ3を阻害する。 このように、カスパーゼ基質と結合ポケットで競合するベンジルオキシカルボニル-VAD-フルオロメチルケトンなどのペプチド性カスパーゼ阻害剤とは異なるメカニズムでカスパーゼ3および7を阻害する

図3.

XIAPによるカスパーゼ阻害のフック、ライン、シンカーモデル。 フック、ライン、シンカーモデルは、XIAPが立体障害によってカスパーゼ3を阻害する方法を説明することができる。 XIAPのBIR2ドメインのNH2末端にあるフックは、カスパーゼの活性部位を横切ってカスパーゼ3を阻害し、それによって活性型カスパーゼ3の基質結合ポケットをブロックしている。 このラインは、フックとシンカーをつなぐ2つのペプチド結合によって形成されている。 シンカーはXIAPとカスパーゼ3の相互作用を安定化させる。

BIR3 Domain Inhibits X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

初期の研究では、XIAPのBIR3ドメインがカスパー9を阻害することがわかったが (26, 41) 、最近になってメカニズムが明らかにされたばかりであった。 XIAPのBIR3ドメインは単量体のカスパーゼ9とヘテロ二量体を形成し、それによってカスパーゼ9の二量体化と活性化を防いでいる。 また、カスパーゼ9を単量体のまま捕捉することに加え、カスパーゼ9の活性部位を不活性なコンフォメーションに保つこともできる(42)。 このように、XIAPは活性部位に物理的に触れることなくカスパーゼ9を阻害することは興味深い。

構造研究の延長として、BIRドメインの変異がXIAPの抗アポトーシス作用に及ぼす影響も検討されている。 BIR2のNH2末端に影響を及ぼす変異（例えば、D148A）は、Fasリガンド（カスパーゼ活性化の外因性経路の刺激）またはBax誘発アポトーシス（カスパーゼ活性化の内因性経路の刺激）を阻止するXIAPの保護機能を消失させた。 一方、BIR3ドメインに影響を与える変異（例えば、W310A）は、XIAPによるBAXによって誘導されるアポトーシスの抑制を減少させるが、CD95によって誘導されるアポトーシスの抑制は減少させない（43）。 したがって、これらの変異は、BIR2ドメインがカスパーゼ3の阻害に必要であり、BIR3ドメインがカスパーゼ9を阻害することを示す構造研究を支持する。

Survivin.

一方、XIAPが直接相互作用を通してカスパーゼ3、7及び9を阻害するのに対し、サバイビンのカスパーゼ阻害メカニズムはあまり明確ではない。 いくつかの研究（44, 45）によると、サバイビンは活性化したカスパーゼ3および7に結合して阻害するが、カスパーゼ8は阻害しない。 一方、他の研究（46）では、サバイビンとカスパーゼ3との相互作用は検出されていない。 Marusawaら(47)の研究では、サバイビンは、酵素反応や、あらかじめチトクロームcとdATPで刺激した細胞質抽出物中では、組み換えカスパーゼ3、7、9を阻害しないことが報告されている。 しかし、シトクロムcとdATPを加えてカスパーゼ9を活性化する前にサバイビンを細胞質抽出液に加えると、カスパーゼ3/7の活性化を阻害した。 したがって、これらの結果は、サバイビンが活性型カスパーゼ9を阻害するが、活性型カスパーゼ3および7を阻害しないこと、およびカスパーゼ9の阻害には補酵素が必要であることを示唆している。 このような補酵素を同定するために、Marusawaら（47）は、ツーハイブリッドスクリーンを用いて、サバイビン結合タンパク質を同定し、HBXIPを同定した。 酵素反応において、survivinとHBXIPを併用すると（どちらのタンパク質も単独では）カスパーゼ9活性が阻害された。 これらの矛盾した研究を解決し、survivinがカスパーゼを阻害するメカニズムを解読するためには、さらなる研究が必要である。 さらに、HBXIPがサバイビンの必要な補因子であることの重要性を一般化するためには、他の細胞系で評価する必要がある。

Beyond Caspase Inhibition

カスパーゼ阻害剤としてのIAPに最も注目が集まっているが、IAPは細胞周期進行、細胞分裂、シグナル伝達への影響を通じてアポトーシスを阻害することができるという証拠が複数存在する。

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Division.

IAPタンパク質は、おそらく細胞分裂に関与している。 例えば、酵母はカスパーゼを持たないが、1つのBIRドメインを含むIAPホモログを持つ。 酵母のIAPを欠損させると胞子形成が非効率的になることから、少なくとも酵母ではIAPが減数分裂に関与していることが示されている（20, 21, 22）。 哺乳類細胞では、surivin は B tubulin、微小管、中心体、キネトコアなどの有糸分裂装置と共局在している (48, 49, 50)。 サバイビンを抗サバイビン抗体で阻害すると、メタフェースが遅延し、有糸分裂紡錘体が短く密度が低い有糸分裂細胞が生じる（48、50）。

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.

IAPも細胞周期の調節因子として関係していることが証明された。 例えば、XIAPの過剰発現は細胞を細胞周期のG0-G1期で停止させ、この成長停止はサイクリンAおよびD1のダウンレギュレーションとサイクリン依存性キナーゼ阻害剤p21およびp27の誘導に関連している(51)。 また、XIAPは細胞周期制御因子であるMAGE-D1やNRAGEと結合するが、この相互作用の意義は不明である(52)。 Survivinもまた、細胞周期の調節に関与しているとされている。 HeLa細胞では、サバイビンはG1細胞ではほとんど検出されず、S期とG2-M細胞でそれぞれ約 5倍と40倍に上昇する(50)。 サバイビンのmRNAレベルの変化は、サバイビンタンパク質やプロモーター活性の増加とも相関している。

アポトーシス抑制タンパク質は細胞シグナルを制御する

IAPタンパク質ファミリーは、核因子（NF）-KABを活性化することによって細胞シグナルに関与している。 例えば、XIAPとNAIPは、TAK1キナーゼとその補因子であるTAB1と複合体を形成し、c-Jun-NH2-terminalキナーゼ1の活性化につながる(53)。 活性化されたc-Jun-NH2-terminalキナーゼ1は、その後、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化カスケードを通じて、NF-κBを活性化する(54)。 さらに、XIAPはNF-κB p65サブユニットの核への移動を促進し、これはNF-κB活性の必要条件である(55)。 最後に、XIAPはNF-κB阻害剤Iκβの分解を促進する（51）。

細胞分裂、細胞周期、シグナル伝達を制御するIAPの役割が明らかになるにつれ、これらの活動を担うIAPドメインを特定することが重要になると思われる。 カスパーゼ、細胞周期、シグナル伝達を阻害するタンパク質のドメインを別々に特定することができれば、これらの機能を解離させた変異型IAPを作製することが可能になります。 この研究は、IAPが細胞周期およびシグナル伝達の調節因子としての役割を維持しながら、IAPによるカスパーゼの阻害を特異的にブロックするIAP阻害剤の開発につながる可能性がある＜1904＞＜6213＞内因性阻害タンパク質によるアポトーシス阻害タンパク質機能の調節＜2647＞＜627＞IAPファミリーメンバーは遺伝子、メッセージ、タンパク質のレベルで調節されているが、その詳細は本レビューでは取り扱えない。 むしろ、このレビューでは、治療用化学IAP阻害剤のプロトタイプとして機能するため、内因性阻害タンパク質によるIAPの制御に焦点を当てる。

制御IAP結合タンパク質は、ショウジョウバエで最初に同定された。 Reaper、Hid、Grim（56）、Sickle（57）というタンパク質は、ショウジョウバエのIAPであるDIAP1に結合して阻害することが明らかにされた。 その後、ヒトのReaper（Rpr）、Hid、Grim（Grm）、Sickle（Skl）が同定され、SMAC/DIABLOおよびHTRA2と命名された。 これらのIAP阻害剤は、NH2末端に相同な配列を持ち、IAPに結合して阻害する役割を担っている（図4）⇓.

図4.

IAP阻害剤のSMACファミリー。 IAP阻害剤のSMACファミリーのメンバーは、相同なNH2-末端領域を共有している。 NH2末端はXIAPのBIR3ドメインと結合するのに十分である。

SMAC と HTRA2.

ヒトSMACとHTRA2はミトコンドリアタンパク質で、ミトコンドリアの破壊時にシトクロムcと一緒に放出される。 放出されると、活性型に切断される。 SMACとHTRA2は活性化された状態でIAPと結合し、IAPとカスパーゼの結合を阻害する(58, 59, 60, 61)。 SMACファミリーのIAP阻害機能は、そのNH2末端にコードされている。 NH2末端の7つのアミノ酸に対応するペプチドは、XIAPと結合することができる(62)。 NH2末端のアラニンをグリシンに変異させると、SMACペプチドがIAPと結合し、プロアポトーシス機能を発揮する能力は失われる(63)。 SMACのNH2-末端7アミノ酸に相当するペプチドは、細胞内に取り込まれると、H460肺癌細胞をシスプラチンやタキソールに対して感作し(64)、神経芽腫細胞を腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して感作する能力がある。 同様の結果は、ショウジョウバエの HTRA2 や IAP 阻害剤でも観察されている。 SMACペプチドの抗腫瘍特性は、異種移植片にも拡大され、細胞透過性のこれらのペプチドをシスプラチン (64) やTRAIL (65) と組み合わせると、それぞれ肺癌や神経膠腫の異種移植片で腫瘍が縮小されることがわかった。 このように、これらのSMACペプチドは、SMACの作用を模倣し、IAPを阻害する小分子のプロトタイプとして役立ち、様々な悪性腫瘍に対して治療上有用であると考えられる。 構造研究により、SMACは2つの異なる部位でXIAPと結合することが示された。 活性型SMACのNH2末端（残基56-59）はXIAPのBIR3ポケットに結合し、BIR3ドメインがカスパーゼ9を結合するのを競合的に阻害する。 カスパーゼ9との結合を阻害するBIR3ドメインの変異（例えば、W310）は、BIR3ドメインがSMACと結合することも阻害することから、SMACとカスパーゼ9の結合部位は重なっていることが示唆される。 しかし、BIR3のいくつかの変異（例えば、H343A）はBIR3のカスパーゼ9への結合を消失させるがSMACには結合しないので、結合部位は同一ではない。

SMAC 全長タンパク質およびNH2末端ペプチドもXIAPのBIR2ドメインに結合するが、BIR3に対するものより約5倍から10倍低い親和性を持つ。 SMACがカスパーゼ3からBIR2の結合を阻害するメカニズムは不明であるが，競合的結合というよりは立体障害に関係しているのかもしれない(63)． HTRA2は活性化状態では3量体として存在し、3量体形成を阻害する変異を起こすと不活性化する。 BIR3ポケットに結合してIAPを阻害することに加え、HTRA2はXIAP、cIAP1、cIAP2を含む複数のIAPを切断して不活性化することができるが、サバイビンには結合しない(68)

SMAC β.

SMAC と HTRA2 もIAP結合とは別の作用でプロアポプトス活性を発揮する可能性がある。 Robertsらによる研究(69)では、ミトコンドリア標的配列を欠く、SMAC βと呼ばれるSMACの天然に存在する代替スプライスフォームが報告された。 SMAC βはXIAP、cIAP1、cIAP2と相互作用しなかったが、これはおそらくそのNH2末端が欠損しているためであろう。 IAPと結合できないが、SMAC βは293細胞においてTRAILおよびVP-16を介したアポトーシスを促進した。 同様に、IAPと結合できないHTRA2の変異体（67）は、MCF7乳癌細胞で過剰発現させると、依然としてアポトーシスを誘導することが可能である。 この研究からは、これらの代替スプライスフォームがどのようにしてアポトーシスを誘導することができるのかが不明である。 おそらく、IAPをユビキチン化する能力を維持し、それによってIAPの破壊を促進しているのだろう。 あるいは、SMACとHTRA2は、IAPとは無関係の結合パートナーを持ち、そのパートナーを通じてプロアポトーシスの影響を及ぼしている可能性もある。 HTRA2の場合、IAPとの結合とは無関係にプロテアーゼ活性を持ち、このプロテアーゼ活性がある系でアポトーシスを制御している可能性がある（68）＜1904＞＜1217＞XAF1＜8391＞＜627＞XAF1もIAP阻害剤の1つである。 XAF1は核タンパク質であり、XIAPと結合して核内に隔離される。 生化学反応において、XAF1はXIAPと結合し阻害する。 細胞内では、XAF1を過剰発現させると、XIAPによるアポトーシスの抑制が阻害される。 しかし、XIAPが核に隔離されることで、単にXIAPと細胞質カスパーゼが分離されるのか、それとも核に位置するXIAPからさらなる効果があるのかは、まだ不明である(70)。 XAF1を模倣する分子は、おそらくSMACとは異なる機能を持ち、XIAP阻害剤の開発に対する代替戦略となるだろう

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