Integrative Genomic Analysis of APOBEC-変異シグネチャー。 expression and germline deletion of APOBEC3 genes, and immunogenicity in multiple cancer types

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Distinct patterns of APOBEC3 genes.The BMC Genomics in the Multiple Gancer Type: In the integration genomics in the APOBEC-1, and its its germline deletion, and immunogenicicity in the multiple cancer types.The BMC Genomics in multiple Gancer type, associated with APOBEC-mutational signature in multiple cancer types

APOBEC-mutational signatureの前回の解析に続き、10種類のがん種で各サンプルごとにTCW trinucleotide motif change to TまたはG変異内にあったdeaminase Cの数を用いて変異を測定した（Methods参照）。 APOBEC-mutationalシグネチャーとAPOBEC3AおよびAPOBEC3Bの全体的な遺伝子発現レベルとの関連を評価するために単変量解析を実施した。 その結果、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、肺腺がん、頭頸部がん、甲状腺がんの計6種類のがんにおいて、APOBEC3Aの発現量はAPOBEC-mutational signatureと正の相関があることが確認された。 残りのがん種では、同じ相関の方向が観察されたものの、有意な相関は観察されなかった（Additional file 1: Table S1）。 興味深いことに、肺扁平上皮癌を除くすべての癌種で、APOBEC3Bの発現量がAPOBEC-mutational signatureと正の相関を示すことが観察された（Additional file 1: Table S1）。 APOBEC3Aからの関連と比較して、APOBEC3Bは胃癌、膵臓癌、腎臓癌においてAPOBEC-mutational signatureと特異的に関連し、それぞれP = 5.2 × 10- 11、P = 2.0 × 10-3、P = 1.1 × 10- 4であった（追加ファイル 1: Table S1）。 これらの知見は、先行研究と一致した。 さらに、APOBEC-mutational signatureと他のAPOBEC3遺伝子の遺伝子発現との関連も評価した。 APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hの遺伝子発現との関連も調べた。 その結果、これらの遺伝子の発現とAPOBEC-mutational signatureの関連は、異なるがん種で異なることが示された（Additional file 1: Table S2）。 例えば、APOBEC3Cの発現は、子宮頸がんや頭頸部がんでAPOBEC-mutational signatureの増加と関連する一方で、胃がんではAPOBEC-mutational signatureの減少と関連していた。 また、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3Gの発現は、APOBEC-mutational signatureの増加と関連していたが、APOBEC3Gの結果は、これまでの知見と一致していた。 興味深いことに、子宮頸がんではAPOBEC3Hの発現がAPOBEC-mutational signatureの増加と関連していたが、乳がんでは観察されなかった。

Distinct patterns of the isoforms of APOBEC3A and APOBEC3B, associated with APOBEC-mutational signature in multiple cancer types

更に、APOBEC3AおよびAPOBEC3Bから翻訳される各アイソフォームの発現レベルとの関連性を評価した。 APOBEC3Aから転写されるuc003awnとuc011aob、APOBから転写されるuc003awo、uc003awp、uc003awq、さらにAPOBEC3Aの最後のイントロンから最後のエキソンまでの領域に関わる融合イベントから得られたuc011aoc、合計6つのアイソフォームを分析した（図1a、b）。 その結果、uc003awnとuc003awoはそれぞれAPOBEC3AとAPOBEC3Bから主に転写されることが確認された（Additional file 1: Figure S1）． 予想通り、uc003awnとuc003awoの発現量とAPOBEC-mutational signatureの関連性は、すべてのがん種における遺伝子発現量と一致した（図1c、d；追加ファイル1；表S3）。 意外なことに、uc011aoc（APOBEC3A/B）の発現量は乳がんにおいてのみAPOBEC-mutational signatureと正の相関を示した（P = 5.0 × 10- 10）（図1e、追加ファイル1: 表S3）。 しかし、残りのアイソフォームについては、uc011aob（APOBEC3A）に頭頸部がんとの弱い関連が観察された（P = 0.02; 追加ファイル1: 表S3）以外、どのがん種でも関連は観察されなかった。

Figure1
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APOBEC-mutational signatureと関連するAPOBEC3AおよびAPOBEC3Bのアイソフォームの特徴的パターン。 a APOBEC3Aから転写される2つのアイソフォームuc003awnとuc011aob、APOBから転写される3つのアイソフォームuc003awo、uc003awp、uc003awq。 b APOBEC3Aの最後のイントロンからAPOB3Bの最後のエキソンまでの融合事象から派生したアイソフォームuc011aoc。 c, d, e 分布図は、APOBEC-mutational signatureとアイソフォームuc003awn (c), uc003awo (d), uc011aoc (e)

APOBEC3A, APOBEC3B 共に全てのアイソフォームを含む重回帰分析により関連性が示された。 その結果、uc003awn (APOBEC3A) および uc003awo (APOBEC3B) の発現量は、複数のがん種で評価されたAPOBEC-mutational signatureと独立かつ共通して関連していることがわかった。 膀胱がん（uc003awnの関連はわずか）、乳がん、子宮頸がん、肺腺がん、頭頸部がん（表1）。 同様に、uc011awn（APOBEC3A）については甲状腺で、uc003awo（APOBEC3B）については胃がん、膵臓がん、腎臓がんで追加の関連性が観察された。 単変量解析と同様に、uc011aoc（APOBEC3A/B）とAPOBEC-mutational signatureとの顕著な関連は乳癌で観察され（P = 5.3 × 10- 11）、さらに肺腺癌でも関連が見られた（P = 0.01） （表1）。 これらの結果から、uc011aocは主に乳癌においてAPOBEC-mutational signatureに影響を与える組織特異的な役割を果たし、uc003awnとuc003awoはヒト癌全体に遍在するが異なる役割を果たすことが示唆された。 また、uc011aocとAPOBEC3Aは、乳がんを中心とした様々ながん種で発現量の正の相関があることがわかりました（Additional file 1: Table S4）。

Table 1 APOBEC-mutational signatureとAPOBEC3AおよびAPOBEC3Bのアイソフォーム発現レベルとの関連

さらに、乳癌の臨床サブタイプで層別した関連解析も実施した。 その結果、uc003aawn（APOBEC3A）およびuc011aoc（APOBEC3A/B）のアイソフォームとAPOBEC-mutational signatureとの関連は臨床サブタイプによって異なり、LumAサブタイプで最も有意な関連が認められた（付加ファイル1：表S5）。

Germline APOBEC3A/B deletion affecting expression levels of the isoforms of the APOBEC3A and APOBEC3B genes

To investigate how germline APOBEC3A/B deletion affects expression of the isoforms of APOBEC3A and APOBEC3B.胚芽のAPOBEC3Aの変異が、APOBEC3AとAPOBEC3Bのアイソフォームの発現に、どのような影響を及ぼすかを調べるために、APOBEC3A/Bの変異を調べた。 まず、ホモ接合体欠失が予測される30サンプル、ヘテロ接合体欠失が予測される239サンプル、欠失がないと予測される2287サンプルを同定した（Additional file 1: 表S6、Methods参照）。 次に、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失と各アイソフォームの発現量との関連を単変量解析により評価した（方法参照）。 予想通り、生殖細胞系のAPOBEC3A/B欠失は、P=0.14の膵臓がんを除くすべてのがん種で、P < 0.05でアイソフォームuc003awo（APOBEC3B）の発現量低下と有意に関連していることが観察された。 また、uc003awn（APOBEC3A）の発現量低下との有意な関連は、膀胱、乳房、甲状腺の3種類のがんで観察された（図2；表2）。 一方、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失は、胃がん、膵臓がん、腎臓がんを除くすべてのがん種でuc011aoc（APOBEC3A/B）の発現レベルの上昇と有意に関連していることが示された。 これらについては、統計的な有意差はなかったが、同じような関連性の方向性を示した（図2；表2）。 特に、頭頸部がんはP=3.8×10-65と最も有意な関連を示し、乳がん、膀胱がんはそれぞれP=3.0×10-8、P=2.9×10-7と有意な関連であった。 さらに、同じ解析を人口で層別して行ったところ、これらのがん種で同様の傾向が見られた（データ未掲載）。 以上の結果から、ほぼすべてのがん種において、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失はuc003awnとuc003awoの発現量低下と有意に関連するが、uc011aocの発現量上昇も認められた

Figure. 2
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APOBEC3A, APOBEC3Bのアイソフォーム発現量と生殖細胞系列APOBEC3A/B欠失との関連 a APOBEC3Aの最後のイントロンからAPOBEC3Bの最後のエキソンまでを覆う生殖細胞系列の欠失から得られた融合領域から転写されたアイソフォームuc011aoc． b, c, d 箱ひげ図は、uc003awn (b), uc003awo (c), uc011aoc (d) の各アイソフォームの発現量を示している。 表2 APOBEC3AおよびAPOBEC3Bのアイソフォーム発現量と生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失との関連性

Germline APOBEC3A/B deletion influences APOBEC->

Table 2mutational signature, 乳がんにおけるネオアンチゲン負荷と相対的な免疫細胞組成

以前の研究で、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失は乳がんにおけるAPOBEC-mutational signatureの増加と関連しており、同様のパターンは膀胱など他の多くのがん種でも観察されたが統計的有意差はなかったことが示されている。 APOBEC3A/Bの生殖細胞欠失がAPOBEC-mutational signatureに及ぼす影響を単変量解析で調べたところ、乳がんにおいてのみAPOBEC-mutational signatureの増加と有意に関連していた（P = 5.6 × 10- 3; Table 3; Fig 3a）。 しかし、他のほとんどのがん種では、ほとんどの関連は統計的に有意ではなかったが、反対の傾向が観察された（表3）。 特に膀胱癌では、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失がAPOBEC-mutational signatureの減少と有意に関連していることが観察された（P = 1.7 × 10- 3; Table 3）。 生殖細胞由来APOBEC3A/B欠失のAPOBEC-mutational signatureへの影響が遺伝子発現への影響によるものかどうかをさらに明らかにするために、アイソフォームの発現を調整した上でAPOBEC-mutational signatureと欠失の関連をさらに評価した（Methods参照）。 その結果、乳がんにおいてのみ、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失がAPOBEC-mutational signatureの増加と有意に関連していた（P = 2.8 × 10- 6；表3；図3b）。 全体的な効果の最初の観察（ベータ＝-0.281；表3）と比較すると、アイソフォーム発現を調整した欠失のより高い効果サイズ（ベータ＝-0.620）が観察された。 生殖細胞欠失がAPOBEC-mutational signatureの割合に寄与しているかどうかを評価するために、各サンプルの全変異に対するAPOBEC-mutational signatureの割合も分析した（Methods参照）。 APOBEC-mutationalシグネチャーの最初の観察と一致して、生殖細胞欠失は乳癌においてのみAPOBEC-mutationalシグネチャーの割合の増加と有意に関連することが観察された（全体効果および遺伝子発現調整による効果についてはBeta = – 0.287, P = 4.8 × 10- 3およびBeta = – 0.5, P = 1.4 × 10- 4；表3参照）。 これらの結果は、APOBEC-mutational signatureの増加をもたらす生殖細胞APOBEC3A/B欠失は、uc011aocの発現増加に対する効果とは別に、欠失から転写されるuc011aocの異なる機能である可能性を示すものである。 乳がんの生殖細胞系APOBEC3A/B欠失を持つサンプルでは、APOBEC3HハプロタイプI (APOBEC3H-I) がAPOBEC-mutational signatureに大きく寄与している可能性が報告されている。 我々はさらに、生殖細胞系列のAPOBEC3A/B欠失を有すると予測される合計76検体について、APOBEC3H-Iハプロタイプを解析した（方法参照）。 その結果、APOBEC-mutational signatureとAPOBEC3H-Iハプロタイプは、生殖細胞APOBEC3A/B欠失がホモあるいはヘテロであると予測されたサンプルにかかわらず、有意な相関は認められなかった（Data not shown）。 しかし、今回の結果は、in vitroの機能アッセイから得られた、欠失によって生成されたAPOBEC3A/Bタンパク質がAPOBEC3Aタンパク質よりも高い発現量を持つというこれまでの知見と一致するものである。

Table 3 APOBEC変異シグネチャーと生殖細胞APOBEC3A/B欠失の関連性
Fig.2. 3
figure3

乳癌におけるAPOBEC-mutational signature、ネオアンチゲン負荷、T細胞（CD8＋）の相対組成と関連する生殖細胞APOBEC3A/B deletion。 APOBEC-mutationalシグネチャーの絶対値（a）および相対値（b）が有意に高い。 乳がんにおいて、欠失がないと予測されるサンプルと比較して、ホモおよびヘテロ接合型欠失を有すると予測されるサンプルにおけるネオアンチゲン負荷（c）およびT細胞（CD8+）の相対組成（d）

アイソフォームuc011aoc発現（APOBEC3A/B欠失から転写）が関与していると考えられる異なる機能および経路についてさらに調査するために、APOBEC3B欠失のアイソフォームがどのような経路をたどるかを調べた。 生殖細胞系のAPOBEC3A/B欠失が予測されるサンプルにおいて、アイソフォームuc011aocと共発現している遺伝子を解析した（Methods参照）。 IPAを用いた正規のシグナル伝達経路における濃縮解析の結果、これらの共発現遺伝子は、がん種によって異なる正規のシグナル伝達経路に有意に濃縮されていることが明らかになった。 具体的には、膀胱ではHIPPOシグナル、乳房ではPTENシグナル、肺腺癌ではiNOSとインターフェロンシグナル、胃ではアシル-コア加水分解、膵臓ではDNA二本鎖切断修復と脂肪酸α-酸化、甲状腺ではEIF2シグナル、腎臓ではGPCR-Mediated Integrationなどが上位のエンコード経路として確認された（いずれもP < 0.01; Additional file 1: Table S7）。 さらに、膀胱、乳房、子宮頸部、肺腺がん、肺がんを含む複数のがん種で、細胞死と生存における機能濃縮が共通して観察された（P < 0.05 for all）。

我々はさらに、生殖腺APOBEC3A/B欠失と新抗原負荷との関連性を評価した。 APOBEC変異シグネチャーの観察と一致するように、我々の結果は、生殖細胞APOBEC3A/B欠失が乳がんにおいてのみネオアンチゲン負荷の増加と有意に関連し（P = 6.5 × 10- 3；図3c）、他の多くのがん種では逆の傾向が見られた（追加ファイル1：表S8）。 同様に、生殖細胞欠失は、TILs中のT細胞（CD8+）の組成の相対的存在量とわずかに関連していたが、乳癌でのみ見られた（P = 0.08; 図3d）。 この有意な関連は、ホモ接合型とヘテロ接合型の両方の欠失を持つサンプルを組み合わせて、欠失を持たないサンプルと比較したときに検出された（Wilcoxon signed-rank test, P < 0.05）。 しかし、他の免疫細胞については関連は認められなかった。 この結果は、生殖細胞APOBEC3A/B欠失が乳がんにおけるAPOBEC-mutational signatureと免疫原性に組織特異的な役割を果たすことを示しており、乳がんリスク上昇との関連についての潜在的メカニズムに関するこれまでのゲノムワイド関連研究の知見を補強するものと思われる。

APOBEC-mutational signature significantly contributing to neoantigens

APOBEC-mutational signatureがどの程度ネオアンチゲンに貢献しているかを調べるために、過去の研究（方法参照）から集めた各標本の予測ネオアンチゲン負荷量を解析した。 単変量解析を用いて，各癌種についてAPOBEC-mutational signatureとネオアンチゲン負荷の関連を評価した。 予想通り、APOBEC-mutational signatureはすべてのがん種でネオアンチゲン負荷と正の相関を示したが（すべての比較でP < 1.0 × 10- 4）、最も有意な相関は乳がんおよび膀胱がんで見られ、それぞれP = 5.1 × 10- 125、P = 1.5 × 10- 90だった（追加ファイル1：表 S9）。 同様に、予測されるネオアンチゲン負荷とAPOBEC-mutational signatureの割合の間には、胃がんを除いて全体的に正の相関傾向が見られた（図4、追加ファイル1: 表S10）。 具体的には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、肺腺がん、頭頸部がん、甲状腺がんなど、複数のがん種で有意な関連性が認められた。 特に、乳癌と膀胱癌は、それぞれP = 8.9 × 10- 29, P = 2.8 × 10- 27 と最も良い関連を示した（追加ファイル1: 表S10）。 この結果は、APOBEC-mutational signatureがヒトの癌におけるネオアンチゲンの生合成に重要な役割を果たすことを示唆している（図1）。 4

figure4

予測されるネオアンチゲン負荷と APOBEC- の割合の関連性。変異シグネチャー

ネオアンチゲン負荷とTILsにおける免疫細胞組成の相対量とAPOBEC-mutational signatureとの関連性

ネオアンチゲン負荷とTILsとの関連性を調べるために、APOBECは、TILsの免疫細胞組成の相対量とネオアンチゲン負荷との関連性を調べた。 腫瘍組織の遺伝子発現データを用いて、TILにおけるB細胞ナイーブ、B細胞メモリー、T細胞CD8、T細胞CD4メモリー活性化などの免疫細胞タイプごとの相対的細胞組成の存在量を測定した（Methods参照）。 単変量解析を用いて、各がん種について、ネオアンチゲン負荷と免疫細胞組成の相対的存在比の関連を評価した。 甲状腺と腎臓を除くすべてのがん種で、ネオアンチゲン負荷とT細胞CD8+およびCD4+メモリー活性化型の両方に正の相関傾向があることが観察された（T細胞CD8+およびCD4+メモリー活性化型についてはそれぞれ二項検定P = 0.11 および P = 0.02）。 肺腺癌を除くすべての癌種で、B細胞ナイーブ型とメモリー型の両方で反対のパターンが観察された（B細胞ナイーブ型とメモリー型それぞれについて二項検定P = 0.02 とP = 2.2 × 10- 16）。 特に、膀胱癌では、ネオアンチゲン負荷がT細胞CD8+およびCD4+メモリー活性化型、B細胞ナイーブおよびメモリー型の相対的存在量と関連していることが示された。 乳癌ではB細胞ナイーブ型とメモリー型の両方に、肺腺癌、頭頸部癌、膵臓癌ではT細胞CD4メモリー活性化細胞型に関連があった（追加ファイル1: 表S11）。 APOBEC-mutationalシグネチャーがネオアンチゲンに有意に寄与していることから、TILsにおける免疫細胞組成の相対量とAPOBEC-mutationalシグネチャーとの関連性を追加的に評価した。 ネオアンチゲン負荷の関連性解析から得られた観察と一致して、同様のパターンがAPOBEC-mutational signatureにも見出された（追加ファイル1：表S12）。 この結果は、APOBEC-mutational signatureが、ネオアンチゲン負荷の増加を介して、TILsの特定の免疫細胞を引き寄せるなど、がんの免疫原性能力に影響を与えることを示唆している

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