New insights into apoptosome structure and function

Early structural information was critical in reveal the domain organization of apoptosome … ヒトのアポトーソームは、7つのApaf-1分子が車輪型の構造に対称的に配置され、7本のHD2アームが伸びたNODからなる中心ハブを形成し、それぞれが2つのβ-プロペラが形成するV字型の領域で終わっている。 NBDとHD1のα/β-フォールドはその間にADP/dATPを結合し、WD40の繰り返しは7枚と8枚の羽根のβ-プロペラを形成している . 以前の提案とは異なり、隣接するApaf-1分子のα/β-フォールド間の横方向の相互作用が中心ハブを組織化するのに用いられ、N末端のCARDはこのリングの上に位置し、pc-9がない場合は無秩序になっていることがわかった（PDB 3J2T） 。 しかし、最近の近傍原子構造から、Apaf-1 CARDはpc-9 CARDの存在下で活性アポプトソーム表面にディスク状の特徴を形成し、この配置はCED-4やDarkに見られるものとは異なることが明らかになった（図1および図2）． 中心ハブの安定性は、隣接するApaf-1分子のNBDとHD1モジュールの間のα-ヘリカル相互作用、水素結合、塩橋の複雑なネットワークによって維持されている。 隣接するプロトマー上のWHD/HD1接触は、WHDドメインが隣接するNBDとHD1ドメインを橋渡しして、アポプトソームの組み立てをサポートしているように見える。 Darkで起こるように、Apaf-1のISMヘリックス（α12）は、広範な疎水性相互作用を通してヘリックスα13と対になり、各サブユニットでヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフを形成し、それが隣接するサブユニットと横に相互作用してリングの中央孔に並ぶヘリックスピケットフェンスを形成している …

健康な細胞では、Apaf-1モノマーはNBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) の界面の隙間にADPを埋め込んだ閉じた不活性な状態で存在している。 この閉じたコンフォメーションは、アポトーソームの形成を促進するために、モノマーに広範なコンフォメーション変化が必要であることを示唆している。 一方、線虫やショウジョウバエのアポトーソーム形成とは対照的に、アポトーシスのシグナル伝達中にミトコンドリアから放出されたシトクロムcは単量体のApaf-1に結合し、これが構造変化を引き起こしてヌクレオチド交換（ATPまたはdATPがADPの代わりに作用）を行い、さらに拡張Apaf-1のオリゴマー化を経てアポトーソームが形成される（図3） 。 このような構造変化を理解するためには、Apaf-1の非活性状態と伸長状態の正確なモデルが必要である。 ADPが結合した不活性なApaf-1単量体の結晶構造が2つ決定されており、1つはβ-プロペラを、もう1つは結晶化を容易にするためにN末端のCARDドメインを欠いたものである。 しかし、これら2つの結晶のNODはほとんど同一であり、このことから、ADPを結合したApaf-1モノマー全体のコンセンサスモデルを構築することができた。 現在、いくつかのグループが単粒子低温電子顕微鏡を用いてヒトのアポトーソームの原子構造に近い構造を取得し、pc-9非存在下および存在下でのApaf-1の拡張構造に関する洞察を得ている（PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE；図3）。 予想通り、Apaf-1の中心ハブ、HD2アームおよび制御領域の構造は、不活性および活性アポプトソームのいずれにおいても本質的に同一であった。 これらの研究により、Apaf-1分子のドメイン間ファンデルワールス接触に関与する特定の残基の重要な詳細が明らかになった。また、活性アポトーソームを安定化するドメイン相互作用に重要な残基も明らかになり、シトクロムc結合面を形成するタンデム7-および8-ブレードβプロペラのV型センサードメイン内の相互作用を示した

Apaf-1アポプトソームにおいて、dATP結合部位はNBD-HD1界面にあり、一部はウォーカーAループとHD1とWHD間のループにより形成されている。 Apaf-1は不活性状態ではADPを結合することができるが、in vitroではアポトーソーム形成にdATPを使う方がわずかに好ましい（文献参照）、一方in vivoではATPの方がはるかに多い（ATPが2 mMに対してdATPは10 μM）。 NBDのアルギニン残基（Arg265）、HD1のSer325とTyr359と結合したATP/dATP分子との間の相互作用によって、ある程度の安定化が起こっている。 NBD-HD1ペアがWHDのα-helix 20を中心に回転することにより、HD1-HDループがヌクレオチドポケットの底に位置し、NBD-HD1ペアが組み立て中に中央ハブ内で円周方向に相互作用を形成することが可能になる 。

Sensor β-propeller and cytochrome c binding

アポプトソームの車輪の「スポーク」はHD2ドメインによってハブから外側に突き出し、それぞれのアームは2つのβ-propellerセンサードメインを含むV字型領域のベースを形成しています。 ほとんどの組織で発現している最も長いApaf-1アイソフォーム（Apaf-1XL）では、15本のWD40反復配列がタンデムに7枚および8枚の羽根のβプロペラを形成しており、最近の低温電子顕微鏡研究によって、これが新しい閉鎖機構を持っていることが示された。 このβプロペラのトポロジーは、アクチン相互作用タンパク質（Aip1p）に見られるものと似ており、HD2からのリンカーは、8枚羽根のβプロペラの最後の羽根（図1aの7枚羽根プロペラの最初に存在する小さな青い領域で示される）のdストランドを形成し、その後7枚羽根のβプロペラにクロスオーバーするようになっている … このトポロジーはマウスApaf-1の3.0Å分解能の結晶構造で確認され、Dark β-プロペラに保存されていると思われる。

Apaf-1アポプトソームでは、V字型β-プロペラがシトクロムc結合ポケットを形成し、水素結合と塩橋によってシトクロムcとの相互作用が安定化されていると思われる 。 還元型と酸化型の両方のシトクロムcがアポプトソームと相互作用し、その活性化を媒介することができる。 興味深いことに、シトクロムcは8枚羽根のβプロペラと優先的に相互作用し、7枚羽根のβプロペラとはより限定的な接触面を形成しているようである。 シトクロムcは、局所的な運動により、新しいマップでは約6Åの分解能で分解され、分子は約90°回転している。これは、らせんが分解されていないマップへの分子ドッキングに基づいた以前のモデルとの比較である。 その結果、シトクロムcはApaf-1のβ-プロペラと安定的に結合するために重要な残基を発見し、これらの残基（G56、P76、I81）はアポトーソーム形成とその後のカスパーゼ活性化にとって重要であることがわかった。 このことから、β-プロペラはApaf-1アポトーソームを安定化させながら、その集合をある程度抑制している可能性が示唆された。 しかし、Apaf-1アポトーソームのβ-プロペラは高半径に位置しており、隣接するサブユニットとは相互作用せず、HD2を除くモノマー内の他のドメインとも相互作用しないことが判明した。 したがって、その不安定化機構は謎のままである。 推測ではあるが、切断されたアポプトソームではβ-プロペラがないため、HD2と中心ハブの相互作用が弱まり、時間依存的に分解が進む可能性がある。

シトクロムcが結合するとβプロペラが上向きに回転し、7枚羽根のβプロペラと不活性なApaf-1モノマーのNBD-HD1ペアとの間の結合を破壊し、7枚羽根のβプロペラは8枚羽根のβプロペラに向かいクランプ運動をしているということが明らかになった。 これらのイベントは、自己抑制されたApaf-1のコンフォメーションを不安定にし、ADP結合ポケットを露出させてATP/dATP結合を可能にするコンフォメーション変化を促進することによって、ヌクレオチド交換を促進する。 これによりApaf-1単量体は拡張したコンフォメーションで安定化し、隣接するプロトマーと相互作用することができるようになる。 バンドシフトの実験から、Apaf-1のヌクレオチド交換とそれに伴う構造変化が、チトクロームcの結合に反応して起こっていることが示唆された。なぜなら、チトクロームcがない状態でdATPを添加しても、Apaf-1の構造には大きな変化が認められなかったからである。 これらのデータを総合すると、シトクロムcの結合がヌクレオチド交換の前に起こり、Apaf-1の閉じた状態から伸びた状態への移行を促進するという連続的なモデルが支持される。 さらに、これらの知見は、WD40リピートがセンサーとして働き、シトクロムcを結合することによって最初のアポトーソーム集合を引き起こすことを示している。

Possible mechanisms of procaspase-9 activation

Procaspase-9 is recruited by the apoptosome to form a holoenzyme that increases its catalytic activity . 溶液中ではApaf-1と結合していないときpc-9は構成的な単量体であるが，一般に活性を持つカスパーゼは二量体である． 結晶格子上で2つのpc-9単量体が相互作用すると、一方の触媒サブユニットに活性部位が形成され、他方のサブユニットは不活性な状態になる（PDB 1JXQ）という驚くべき現象や、高濃度のCED-3二量体でも同様の現象が起こることがわかった。 pc-9のN末端CARDはApaf-1のCARDと相互作用して、アポトーソームへのアピカルプロカスパーゼのリクルートを行い、長いリンカーでCARDから分離されている触媒ドメインの活性化を促進する（図2a） 。 さらに、触媒ドメインのp20とp10サブユニットは、自己切断を起こすリンカーで連結されている。 このように、pc-9がどのように活性化されるかを理解するためには、ホロ・アポプトソームにおけるCARDとpc-9リンカーの役割を理解する必要がある。

アポプトソームによるpc-9活性化のメカニズムを説明する様々なモデルが提案されている。 近接型二量体化モデル」はpc-9分子がApaf-1アポプトソームに動員されることで二量体化が促進され、pc-9の自己活性化につながると考えられている． しかし、最近までpc-9がアポトーソームと結合したときにホモダイマー化することを証明する構造的・生化学的証拠はなかった（下図参照）。 そこで、Apaf-1アポトーソームがpc-9と結合して活性化するプラットフォームであるという「誘導型コンフォメーションモデル」が提唱された。 最近のモデリングでは、pc-9の活性化は主にアポトーソームプラットフォームによるアロステリックな制御を介して行われることが示唆されている . これらのすべてのモデルにおいて、アポプトソームの主要な機能は、Apaf-1とpc-9 CARD間の多量体複合体を形成し、酵素原の局所濃度を高めることによってpc-9の活性化を促進することである . さらに、溶液中で構成的な二量体であるpc-9を操作したデータから、CARDとそのリンカーが触媒ドメインを阻害している可能性が示唆された .

活性化において二量体化は重要な役割を果たすと考えられるが、アポプトソーム上でどのように起こるかは未解明のままであり、実際最近のデータでは、pc-9分子のホモ二量化およびApaf-1のNBDと単一のpc-9触媒ドメインによる二量体形成の両方を含むより複雑な活性化メカニズムの可能性が提案されている。 興味深いことに、Apaf-1単量体の不活性型構造は、CARD-CARD相互作用を介したpc-9の結合を妨げないことがバンドシフト実験により示された 。 このように、pc-9/Apaf-1ヘテロダイマーは、アポトーソームが活性化される過程で、アポトーソームに動員される可能性がある（図3）。 pc-9の存在下でのApaf-1の組み立てが、新生ディスクのCARD間の追加的な相互作用によって導かれるのかどうかは未解決の問題である。

最初の結晶構造から、Apaf-1とpc-9のCARDドメイン間の安定な1：1複合体が、pc-9活性化に不可欠な補体制御（タイプIとして知られる）であることが判明した …。 しかし、この安定な1:1複合体はpc-9を活性化するには不十分であることが後に示された 。 Apaf-1とpc-9のCARDは、他のデスドメイン複合体にも見られる3つのインターフェース（TypeI、II、III）のうちの2つで安定化された高次オリゴマー複合体を形成している。 CED-4、Dark、Apaf-1アポプトソームのCARD-CARDディスクに関与する相互作用を比較すると、タイプIIとIIIのインターフェースがある程度保存されており、タイプIのCARD相互作用はヒトのアポプトソームにのみ見られることが明らかになった。 最近の2.1Å分解能の結晶構造から、2つのApaf-1 CARDとその間に挟まれたpc-9 CARDからなるヘテロ三量体複合体が発見された。 pc-9 (Arg36/ Arg65) と Apaf-1 (Glu78) CARDs の残基が関与するタイプII相互作用が、先に述べたタイプI相互作用と同様に、pc-9の活性化に重要であることが示された … さらに、1つの残基（Apaf-1 CARDのGlu41）がpc-9 CARDと最小限のタイプIIIのインターフェースで分岐した相互作用を形成することがわかった。 さらにApaf-1 CARDのLys58とLys62との相互作用もpc-9の活性化に必要であることが示され、Apaf-1 CARDをプラットフォーム上に配置するのに役立つと思われる 。 このように、ヘテロ三量体CARD複合体の形成は、複数のpc-9触媒ドメインをアポプトソームのプラットフォームに繋ぎとめる手段を提供する。

活性化したApaf-1アポプトソームの二つの原子分解能に近い構造から、Apaf-1とpc-9 CARDディスク配列の全体構造が、中央ハブの上に座る傾いたディスクであることがわかった（図2および3）。 ディスクとプラットフォーム間の対称性の不一致により、CARDディスクを上から見ると、中心がずれた位置にある（図3）。 ディスクは、Apaf-1 CARDとpc-9 CARDのペアが螺旋状に配置され、4枚のApaf-1 CARDが底面の「層」を形成し、上面には3枚または4枚のpc-9 CARDが存在していると言える（図2b-d）。 さらに、Apaf-1 CARDは左巻きで上方に螺旋状に移動するため、中央ハブの表面からさらに離れた位置にあり、そのためリンカーコンフォメーションが異なり、中央ハブの同族NBDと異なる相互作用をしていることがわかった。 Apaf-1とpc-9のCARDペアはタイプIIインターフェースを通して相互作用し、主にタイプIの相互作用を通して螺旋の周りに横方向に結合している。 驚くべきことに、7つのApaf-1 CARDのうち4つだけが、円盤のpc-9 CARDと相互作用している。 これは、残りの3つのApaf-1 CARD分子がスパイラルのサブユニット結合パターンに容易に適合せず、CARD-NBDリンカーが短すぎるためスパイラルを継続できないためである。 アポトーソーム内の隣接するサブユニットのApaf-1 CARDは、螺旋が垂直方向に伸長するのを止める継ぎ目（1aと7aの間）に位置している（図2c, d）。 Apaf-1/pc-9 CARDディスクの形成はアポトーソームの活性化に必要であり、pc-9触媒ドメインはリンカーを介してCARDに柔軟に接続されている（図2a）。 ある構造では、4つのApaf-1 CARDと3つのpc-9 CARDからなるディスクが可視化され、弱い密度は、4番目のpc-9 CARDが低い占有率でらせんの頂点に結合しうることを示していた。 もう一つの構造では、ディスクの優勢な配置は8枚のCARDを含み、らせん内のCARDのコンフォメーションは、独立して解かれた二つの構造間で非常によく似ていた（Fig. 2dのオーバーレイ参照）。 pHと塩濃度の違いにより、8番目の位置の占有率が異なることが説明できるかもしれない。

最近の解析（MALSとSAXSによる）では、CARD複合体形成は濃度依存的であり、同量のApaf-1とpc-9 CARDがより強いType Iインターフェースを通してペアとして結合し、溶液中で高濃度で3：3複合体を形成することが示された。 このCARD複合体を結晶化し、3.0Å分解能で構造を決定したところ、Apaf-1/pc-9 CARDの3つのペアが左巻きらせんを描いており、アポプトソームで観察されるのと似た構造をしているが、いくつかの違いが見られた（PDB 5WVC；図2e)。 しかし、結晶中の環境は、格子接触や、CARD-NBDリンカーによる拘束を受ける核形成面がないこともあり、アポトーソームが形成されているときとはかなり異なっている。 このことが、観察されたCARDらせん構造の違いを説明する可能性がある。 これには、ホロ・アポプトソームの円盤状の螺旋に1つか2つのCARDが追加されていることや、円盤の基部を形成するApaf-1 CARDが、溶液中や結晶中に見られる3つではなく、4つであることが含まれる。 8 CARDディスクと結晶構造の6 CARDスパイラルの最適な位置合わせを行ったところ、2p、3a、4pの位置のCARDはよく一致し、6 CARDスパイラルの後半ではいくらか乖離していた（図2f, g)。 特に、7a位置のApaf-1 CARDは、1a位置のApaf-1 CARDが存在しないため、垂直方向の中間位置に誤って配置されている（図2g）。

ディスクの組み立ての際、スパイラルの核形成は、2つのApaf-1 CARDと1つのpc-9 CARDからなるCARD heterotrimerの形成、Apaf-1 CARDがスパイラルの底部（1a位置）に配置されるなど、異なる方法で起こることがある。 その後、2つのApaf-1/pc-9 CARDのペアが追加され、それらのType I インターフェイスを通して相互作用し、場合によってはpc-9 CARDが8p位でスパイラルを最終的にキャップすることが起こりうる。 しかしながら、Apaf-1 CARD-NBDリンカーの柔軟な性質から、他の組み合わせも可能である。例えば、3つのApaf-1/pc-9 CARD「タイプI」ペアが、組み立ての初期段階において、スパイラルの底部（1a位置）にApaf-1 CARDを追加しながら中央ハブから連続して核形成されるかもしれない … 重要なことは、ディスクの組み立ては、スパイラルの基部を形成するアポプトソーム上の4つのApaf-1 CARDの適切な間隔を維持するために協力的である可能性があることである。

活性アポプトソームについては、発表された構造（図3および4）を比較すると、中心ハブにおいて一つの大きな違いが明らかである。 簡単に言うと、pc-9の触媒ドメイン（p20/p10）と同定された密度は、最近の3Dマップでは中央のハブ上にあり、この特徴は複合体の約50％に存在することが分かった。 さらに、以前の低解像度のホロ・アポプトソームの立体地図でも同様の密度が確認され、予備的ではあるがp20/p10サブユニットのドッキングが可能であったことから、この特徴は再現可能であることがわかった。 しかし、この新しい密度は低分解能でしか可視化されておらず、これはp20/p10サブユニットの中央ハブへの付着に柔軟性があることを反映しているのかもしれない。 Yigong Shiのグループによって決定された原子分解能に近いマップでは、CARDディスクに隣接する中央ハブ上に、さらに鎌状の密度が約7Åの分解能で分離された。 この密度には、中央のpc-9 CARDが含まれており、2つの結晶構造で観察されたのと同様に、両側に位置する2つのApaf-1 CARDと相互作用していることが明らかになった。 しかし、このヘテロ三量体構成は粒子の10%程度しか解像できなかった。 このように、試料調製時およびグリッド凍結時の実験条件が、pc-9と中心ハブ上の潜在的結合部位との相互作用に影響を与えると思われる。 ホロ・アポプトソームの最近の2つの非対称構造をそのCARDディスクに基づいて並べると、中央ハブ上に位置する新規の密度ピークはかなり異なる位置にあることがわかった（図4）。 pc-9触媒ドメイン（p20/p10）は2つの位置にある可能性があるが（図4c）、3つのCARD密度は回転しており、pc-9触媒ドメインの密度とは側面から見て異なるプロファイルを持っている（図4b, d）。 Apaf-1 CARD-NBDリンカー密度のパターンから、6つのApaf-1 CARDが並んだ3 CARDホロ・アポプトソームにおいて、関連するすべてのCARD-NBDリンカーを正確にマッピングすることができた（図4d）。 リンカーの長さ（約25-30Å）とリンカーの相対的な位置は、3つのCARDモジュールが中央ハブの1番か2番のどちらかに結合することを妨げる可能性があることが決定的になった。 このように、中央ハブには複数の部位があり、pc-9 CARDや触媒ドメインを結合させるために、それぞれ異なる方法で利用されているようだ。 4

プロカスパーゼ-9はApaf-1分子7個に対して2-5個のジムゾンがアポプトソームに結合すると推定されているので、アポプトソームに結合するpc-9分子の数は組み立て時の状況により正確に変化し、このタンパク質分解装置の動的性質を反映しているかもしれないと思われた。 このことは、立体的な制限か、あるいは結合したpc-9 CARDを安定化させるために、より大きなオリゴマーが必要であることを反映しているのかもしれない。 重要なことは、いくつかのpc-9触媒ドメインは、長いCARD-p20リンカーによる柔軟な取り付けのために、現在の低温電子顕微鏡密度マップでは見られないことである。これは、活性化の正確なメカニズムの解読と理解を困難にし、さらなる1分子研究の必要性を強調している。 構造的研究によりpc-9の活性化に関する知見が得られているが、一連の生化学的アッセイにより、近接型二量体化と単量体pc-9のアロステリック制御の両方がアポトーソームの機能を制御するために重要であり、アポトーソームの活性持続時間も支配すると考えられることが明らかにされた。 まず、アポトーソームによるpc-9の動員は、pc-9の局所濃度を高め、ホモ二量体化を可能にし、その複合体への親和性を高める。 興味深いことに、切断されていないpc-9は、切断されたカスパーゼ-9よりもホモダイマー化の傾向が強く、アポプトソーム内でのプロテアーゼ活性（カスパーゼ-3切断）が上昇することが分かっている。 その結果、触媒ドメインのサブユニット間p20/p10リンカーが切断されると、pc-9のアポトーソームへの親和性が低下し、一度処理されたカスパーゼ9は放出されてアポトーソームと再結合することがない。 重要なことは、これらの研究により、pc-9のホモダイマー化が活性化に必要な重要なイベントであり、アポトーソームがこのイベントを促進するように作用していることが示されたことである 。 このことは、カスパーゼ-2やドロンクなど他のCARDカスパーゼの生化学的研究と一致している。カスパーゼでは、最初の活性化には、酵素原子の切断よりも二量体化が必要である。 アポトーソームへのpc-9の結合の安定化には、CARD-CARD相互作用だけでなく、GCFNF404モチーフを介してpc-9スモールサブユニット（p10）が相互作用し、ホモおよびヘテロダイマーを形成する必要がある …。 現時点では、pc-9のホモダイマー形成がCARD-CARDディスクの安定性にどのような影響を与えるかは明らかではない。触媒ドメインの二量体は、部位特異的トロンビン分解によってホロ・アポトゾームから放出され、対称性なしに精製した低温電子顕微鏡マップでは分解されないので、かなり柔軟であるようだからである。 pc-9のGCFNFモチーフはApaf-1のNODと相互作用し、pc-9/Apaf-1ヘテロダイマーを形成し、カスパーゼ3を効率的に切断する。 このデータは、アポプトソームと直接相互作用するpc-9の触媒ドメインが活性を持つ可能性を示唆している。 このカスパーゼ-3切断の推定活性部位は、これまでp20/p10分子と解釈されてきた中央ハブ上で観察された新規密度に対応している可能性があり、この点に関するさらなる研究が必要である。 これらの知見を総合すると、pc-9はアポトーソーム内で2つの異なる活性構造をとり、1つまたは2つのホモダイマーがCARDディスクに結合し、pc-9/Apaf-1ヘテロダイマーが中心ハブに結合していることがわかった。 中央のハブに結合した3つのCARDモジュールを持つホロ・アポプトソームを考慮すると、3〜5個のpc-9触媒ドメインの配置について、少なくとも6通りの組み合わせが可能である（図5）。 このように、活性化されたpc-9触媒ドメイン（ホモダイマーおよびヘテロダイマー）の数は、Apaf-1 CARDを介した結合部位を埋めるためにアポプトソームに動員されるpc-9分子の数によって変化することになる。

最後に、カスパーゼ3によるpc-9の完全切断は、サブユニット間のリンカーを除去してカスパー9活性を完全に回復させることから、カスパーゼ3もpc-9に対してタンパク質分解のフィードバックを持ち、アポトーシス信号を増幅させると思われる． カスパーゼ-2についても同様のメカニズムが提唱されている。 これらの生化学的研究により、カスパーゼ9のアポトーソームからの解離速度は、p20-p10リンカーが最初に切断され、アポトーソームとの結合親和性が低下することによって決定されるという分子タイマーモデルが提示された . しかし、切断されたカスパーゼ9がホロ・アポトソームから完全に解離するためには、そのCARDがディスクまたは3つのCARDモジュールから解放されることが必要である。 このように、活性化したカスパーゼ9分子は、そのCARDの局所的な環境に依存した解放の階層が存在するのかもしれない。 また、すべてのpc-9 CARDが上面に位置するCARDディスクのデザインは、カスパーゼ-9の放出を促進する可能性がある

。