Ocotea macrophylla（Lauraceae）由来のアスポフィンアルカロイド
ARTIGO
Ludy Cristina Pabon*; ルイス・エンリケ・クーカ
国立ボゴタ大学科学部（Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Ocotea macrophylla (Lauraceae) の木材から4つのアポルフィンアルカロイドを単離し、(S)-3-methoxy-nordomesticine (1) として特性評価した。 (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticine (3), (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine(4)の4種がある。 アルカロイド2-4は初めて報告された。 単離された化合物の構造は，スペクトルデータおよび文献値との比較により決定した。 アルカロイド画分と化合物1はFusarium oxysporum f. sp. lycopersiciに対して抗真菌活性を示し、また化合物1はStaphylococcus aureus, Enterococcus faecalisに対しても抗菌活性を示した。 Ocotea macrophylla; aporphine alkaloids; Lauraceae.
INTRODUCTION
オコテア属（Lauraceae）は、アメリカ大陸とアフリカ南部に350種以上生息しています1、2 コロンビアには、主にアンデス森林に35種のオコテア属が分布します3 伝統医学において、いくつかのオコテア種は異なる用途を示しています。 O. quixosは消毒薬、局所麻酔薬、下痢止めとして使用されます。4 O. lancifoliaは抗寄生虫剤として、O. caparrapiは虫刺され、蛇刺され、気管支炎、癌性腫瘍の治療に使用されます5,6。
化学的には、オコテア属は主に代謝物のタイプフロフラン7とテトラヒドロフランリグナン8、ビシクロオクタン9とベンゾフランネオリグナン10、ベンジルイソキノリン11とアプロフィンアルカロイドの源として知られています5。 これまでの研究で、Ocotea macrophyllaの木材から4つのアポルフィンアルカロイドが単離され、nantenine, glaucine, isocorydine, dehydronantenineと同定された12,13。 本稿では、(S)- 3-methoxy-nordomesticine 1の他に3種の新しいアポルフィンアルカロイド2-4の単離と構造決定、および化合物の抗菌・抗真菌活性に関する報告について述べる。 macrophyllaの茎のエタノール抽出物を酸塩基抽出し、アルカロイド画分を得、さらにクロマトグラフィーによる分画と精製を行い、4種類のアルカロイドを単離した。 (S)-3-methoxy-nordomesticine (1), (S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticine (3) および (S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticine (4) の4種類のアルカロイドが分離された。 アルカロイド1-4の構造を図1に、分光学的データを表1に示す。
δH 6.30 (1H, s) の信号はHMQC実験では連結性を示さず、フェノールのOH基の存在を示し、IRで裏付けられた。 HMBCスペクトルの分析により、δH 5.94 および 5.95 (メチレンジオキシ基) のシグナルとδC 145.9 (C-9) および 146.0 (C-9) のシグナルの間に観察される相関に従って、置換基の位置を確認することができた。2 (C-10)のプロトンと、これら最後の2つのシグナルはそれぞれδH 6.70 (H-8)と7.90 (H-11)のプロトンと一致し、9位と10位にメチレンジオキシ基、芳香環上にパラ配位の水素が2個存在することが示唆された。 1位の水酸基の存在は、C-11bに割り当てられたδH 6.30 とδC 116.5 のシグナルの相関を利用して決定された。 C-2およびC-3のメトキシル基の位置は，δH 3.96 および 3.86 の水素と，それぞれδC 138.4 (C-2) およびδC 147.8 (C-3) の炭素の相関から決定した。
CD曲線においてC-6aは280 nmで負のCotton効果を持ち，240 nmで正のCotton効果があるので絶対配置はSとした17． また、旋光度25D = +51.7 (c 0.38, CHCl3) の正の値によって確認された18。したがって、アルカロイド1は、同じラウラエス科のNectandra sinuata19から以前に報告されたアスポフィンアルカロイド、 (S)-3-methoxy-nordomesticine と断定された。 この化合物の分光学的データを修正・補完した。
アルカロイド2はDragendorff試薬に陽性反応を示す黄色オイルとして得られ、その旋光度は25D 25D = +33.3 (c 0.60, CHCl3)であった。 1H NMR では，δH 4.29 (2H, m) と 1.29 (3H, m) に新しいシグナルが出現し，近接した脱保護基の存在によりシグナル H-5 が変位していた． COSY 実験では、シグナル δH 4.29 と 1.29 の相関が見られ、これはエチル基の存在を示し、その変位によりヘテロ原子に結合していることが示唆された。 13C NMRとDEPTスペクトルでは、δC 158.8 (C), 61.0 (CH2), 14.8 (CH3) に、窒素原子に結合したエトキシカルボニル基の典型的なシグナルが新たに出現した。 C-6aの絶対配置は1と同じCotton効果を示すことからSと決定した。したがって、アルカロイド化合物2は(S)-N-ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticineであると同定された。 そのESIMSスペクトルは、分子式C22H22NO7に対応するm/z 414 +に擬分子イオンピークを与え、断片化はそれぞれm/z 382 +とm/z 368 +にCH3OHとCH3CH2OHが消失したことに起因していた。 負イオンモードのESIスペクトルでは、m/z 412 -とm/z 383 .にピークを示し、最後のピークはエチル基の消失であった。 この種のアルカロイドはN-エトキシカルボニルを置換基としてLindera angustifolia (Lauraceae) から単離されている21
アルカロイド3は黄色オイルとして得られ、旋光度は25D 25D = +7.5 (c 0.53 CHCl3)であった。 IRスペクトルはアルカロイド1、2と同様であった。 また、ホルミル基に特徴的な2830, 2700, 1739 cm-1 の吸収が観察された。 HRESIMS のネガティブモードでは、分子式 C20H20NO6 に対応する m/z 369.1133 の擬分子イオンが観測された。 ESI-MSスペクトルのネガティブイオンモードでは、m/z 339 .にホルミル基の脱離が見られた。 NMRプロファイルはアルカロイド1および2のものと同様であった。 1H NMRでは2つの異性体の3:1の混合物に属する異なるシグナルが現れた。 NMRで主要異性体をアルカロイド1と比較すると，芳香環の置換パターンは同じであったが，3にはホルミル基の1HにδH 8.25 (1H, s), 13CにδC 161.9 という新しいシグナルが現れた．この窒素上の官能性は回転異性体を形成し，これはN-ホルミルおよびN-アセチル基のアルカロイドで以前に記述したものである22． したがって、このアルカロイド3は(S)-N-formyl-3-methoxy-nordomesticineと同定した。
アルカロイド4は融点222-223℃ (MeOH), 光学回転25D 25D = +47.0 (c 0.55 CHCl3) の白い固体として得られた。 4のNMRデータを解析した結果、2と同じ基本骨格を持つが、2のエチル基のシグナルの代わりに4のδH 3.76 (3H, s) とδC 52.6 のシグナルを持つことから、メチルエステルであることがわかった。HRESIMSでは分子式C22H22NO7に対応するm/z 398.1233 の疑似分子イオン-が確認できた。 そこで、アルカロイド4は(S)-N-methoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticineと同定した。
抗真菌活性は、トマト作物に影響を与え、農家に多大な損失をもたらす植物病原性真菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici 23に対してディスク拡散法により評価された。 アルカロイド画分は250μg/μLでF. oxysporumに対して有効であった。 (S)-3-methoxy-nordomesticine 1は5μg/μLで中程度の発育阻止活性を示したが、他のアルカロイドは無効であり、窒素原子上の電子吸引性置換基の存在が抗真菌活性を低下させることが示唆された。
アポルフィン類の抗真菌活性に関する報告は少ないが、Candida albicansなどの菌類には活性があるが、Cladosporium herbariumなどの菌類病原体には無効であることが判明している26。 これらの結果は，これらのアルカロイドの抗真菌活性の新しい評価報告であり，アポルフィン類の窒素上の置換基の種類が，それらが示す抗真菌活性に影響を与えることが強調された。 Staphylococcus aureus 6538とEnterococcus faecalis 29212の2つのGram（+）標準株と3つのGram（-）標準株に対してLerhrer27の報告するラジアル拡散法で抗菌活性を評価した。 Escherichia coli 25922, Salmonella tiphymurium, strain MS7953 and 14028s. アルカロイド1（2.5μg）は、表2に示すように、評価した両方のグラム陽性菌に対して30AUの値で抗菌活性を示した。 coliに対して活性を示さない。
抗真菌活性と同様に、窒素上の置換基の性質が抗菌活性に影響を及ぼすことが示された（表2）。
一般的手順
融点はメルテンプフィッシャージョンズ、ラボ装置を用いて測定した。 UVスペクトルはPerkin Elmer Lambda 2Sで、CDスペクトルはJASCO J-720スペクトロメーターで記録した。 IRスペクトルは、薄膜としてPerkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000で得た。 光旋光はSchmidt-Haensch偏光計で記録した。 1H (400 MHz) および13C (100 MHz) NMRスペクトル、ならびに2Dスペクトル（COSY、HMQC、およびHMBC）は、内部参照としてCDCl3を使用してBruker Avance 400MHzスペクトロメーターで行った。 HRMSは島津製作所製LCMS-IT-TOF質量分析計システムでESIを用い、ポジティブイオンモードおよびネガティブイオンモードで測定した。 カラムクロマトグラフィー(CC)はシリカゲル(70-230および230-400 mesh, Merck)を、分析クロマトグラフィーはシリカゲル60 PF254 (0.25 mm)を用いて行った。
植物材料
O. macrophyllaの茎はW. Delgadoによって2006年7月にコロンビア、Nocaimaから採取されたもの。 植物標本はA. Jaraによって同定され、バウチャー標本（COL-517191）となり、コロンビア国立大学（コロンビア、ボゴタ）のコロンビア国立植物園に寄託された。抽出と分離 Ocotea macrophyllaの乾燥した粉状の茎（2.0 kg）を室温で浸漬してEtOHで抽出、真空中で濃縮して抽出液(102.6 g)を得た。 この抽出液のサンプル（48.9 g）を超音波を用いて水に可溶化し、5% HClでpH 2.0に酸性化した。 この酸性懸濁液を濾過し、20%NaOHでpH8.0まで塩基性化した後、順次クロロホルムで抽出を行った。 クロロホルム画分（3.01 g）をシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに付し、石油エーテル：AcoiPr（4：6〜0：10）およびAcoiPr：MeOH（10：0〜0：10）の勾配で溶出し、4つの画分（I-IV）を得た。 フラクションI（347mg）をシリカゲルのカラム（CC）で反復クロマトグラフィーし、n-ヘキサン：AcOiPr（9：1〜8：2）、CHCl3、Tol：AcOiPr 7：3で溶出させた。 これにより、アルカロイド1 (7 mg) および2 (4 mg) を得た。 フラクションII（250mg）をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに供し、CHCl3：AcOEt（85：15）で溶出した後、Sephadex LH-20（CH3OH）のCCに供し、アルカロイド3（8mg）を得た。 フラクションIV（1433mg）を、溶出系としてCH2Cl2：MeOH 97：3およびCH2Cl2を用いたシリカゲル上の反復カラムクロマトグラフィーによって精製した。 最後に、MeOHで連続的に洗浄することにより、アルカロイド4（98 mg）を得た。
抗真菌アッセイ
F. oxysporumは、クンディナマルカ大学（農学部、植物病理学研究室）の培養コレクションから入手した。 抗真菌活性測定用培地にはPDAを用いた。 培地には、105個の胞子の溶液を100μL接種した。 試料は，アルカロイド画分50，25，10μg/μL，純アルカロイド5，2.5 1.0，0.5，0.2，0.1 μg/μLに相当する，濃度の異なる溶液を調製した。 10マイクロリットルの試料をろ紙ディスクに塗布し、接種した培地上に置いた。 プレートを密封し、25℃で3日間インキュベーターに放置した。 生育している菌に対して現れる明確なゾーンは、菌の成長を阻害するために必要な最小限の画分またはアルカロイドの量を示していた。 各処理について3つの複製を作成した。 Benomyl (benzimidazole – 5 μg) をポジティブコントロールとして使用し、アセトンをネガティブコントロールとして使用した23
抗菌アッセイ
抗菌活性は、Lehrerによって以前に発表された方法を応用した放射拡散法にて評価した27。 Staphylococcus aureus ATCC 6538およびStreptococcus fecalis ATCC 29212の2つのGram (+)株と3つのGram (-)株に対して評価した。 Escherichia coli ATCC 25922，Salmonella tiphymurium，ATCC 14028s，Salmonella tiphymurium MS7953の3種類のGram（-）菌に対して評価した。 各株から分離したコロニーを、Gram (+)株は3 mLの大豆トリプシーゼ（TSB）、Gram (-)株はLuria Broth（LB）に沈め、微生物が対数期になるまで37℃で攪拌しながら培養を行った。 上清を除去し、得られた沈殿物をリン酸緩衝液（PBS）に再懸濁し、その後PBSで洗浄し、遠心分離した。 最後に沈殿物をPBSに再懸濁し、620nmで光学密度を測定し、1mlあたりのCFU（colony forming units）数を算出した。 各ディッシュに4×107CFUを含む一定量を分散させる。 測定した体積を、多かれ少なかれ45℃に融解した15mLのアガロース中で混合し、ホモジナイズした。 この菌懸濁液をシャーレに供し、室温で固化させた後、滅菌パンチで直径2mmの穴を開けた。
試験試料は、純化合物1mgをDMSO500μLに溶解して調製し、これを8μLずつ二重に入れ、37℃で30分間インキュベーションした。 この後、溶融寒天とTSBを含む栄養培地を加え、37℃で18時間培養した後、阻害帯の直径を化合物の活性で測定した。 ポジティブコントロールには、アンピシリン（50 mg/mL）、カナマイシン（10 mg/mL）、テトラサイクリン（4.12 mg/mL）をPBSで1：100に希釈し、ネガティブコントロールとしてDMSOとPBSを使用し、各コントロールには8 μLを各ウェルで使用しました。 阻害帯の直径をミリメートルで測定し、結果は、1Unit of Action（UA）が阻害帯の0.1mmに等しいと規定する比率に従って活性の単位として報告された。 また，NMRスペクトルの記録には核磁気共鳴研究室，HR-ESI-MSの記録には質量分析研究室がそれぞれ協力してくれたことに感謝する。 さらに，光回転を提供していただいたJaveriana University，CDスペクトルを記録していただいたFIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) ，特に抗菌活性を測定していただいたProf. J. M. Lozanoに感謝する
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Received 26/6/09; accepted 6/11/09; published on web 10/3/10
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