PLOS ONE

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Discussion

化学療法薬の大半は、DNA合成、細胞代謝、細胞分裂を妨げるように特別に設計されています。 この作用機序により、これらの薬剤はいくつかのタイプの突然変異を引き起こすと予想される。 化学療法剤の正常細胞に対する変異原性は，二次悪性腫瘍やダウン症候群，クラインフェルター症候群，ターナー症候群などの異常生殖を誘発する可能性があり，化学療法における最も深刻な問題の一つである。 従って、化学療法剤の正常細胞に対する変異原性作用を明らかにすることは必須である。 小核試験は、修復されていないゲノムの損傷を測定するために広く用いられており、小核頻度の増加は、ヒトの発癌リスクを予測する。 MNは染色体切断（clastogenicity）または染色体の遅れ（aneugenicity）に起因するため、FISHアッセイのようにMN内部の染色体全体を同定できるアッセイを含めれば、MNの検出は数値的な染色体異常誘発のスクリーニングとして利用できる可能性がある。

骨髄MNテストにより、in vivoでの分裂期におけるエピルビシンのクラストジェニック活性が報告された . 現在、エピルビシンによるMNがどのような由来で起こるかは未解明である。 そこで本研究では、雄マウスの体細胞および生殖細胞におけるエピルビシンの異数性誘発能を検討することを目的とした。 本法の効率を調べるため、2種類のモデル変異原、コルヒチンおよびマイトマイシンCを、それぞれ無数体形成作用およびクラスタ形成作用を有することが知られているポジティブコントロールとして用いた。 本研究で観察されたMNPCEの結果、およびコントロールと2つの陽性変異原におけるMNあたりのシグナルの分布は、公表されたデータ , とよく対応していた。 MN試験の結果、エピルビシンはin vivoのマウス骨髄において用量依存的にMN形成を増加させ（図1）、セントロメア陰性および陽性染色MNの増加を示し、クラストジェニックおよびアネウジェニックの両方を誘発することが示された（図2）。 体細胞におけるエピルビシンの造血能と無精子能の両方が二次腫瘍の発生を生じさせる可能性がある。 この結果は、過去のin vivo試験において、エピルビシン投与後に同様の用量範囲においてマウス体細胞のMN形成および構造的染色体異常の増加が観察された結果を裏付けるものである。 また、これらの研究結果は、以前に報告されたマウス癌細胞 in vitro、孵化鶏卵の赤血球およびヒトリンパ芽球様細胞株TK6におけるエピルビシンによる小核の誘発と一致している。 さらに、エピルビシンを含む化学療法を受けたがん患者において、構造的および数値的な染色体異常が誘発されることも以前に報告されている。 また、これまでの研究で、エピルビシンは培養HeLa細胞において構造的染色体異常を、チャイニーズハムスター細胞株において構造的および数値的染色体異常と姉妹染色分体交換を、in vitroでエピルビシンを含むレジメンによる治療を受けた乳癌女性の末梢血リンパ球培養において染色体異常を誘導することが示されている。

ヒトにおける研究では、特定の化学療法レジメンが生殖細胞における異数性の頻度を増加させることが示されており、そのような患者は、特に生殖年齢において異常な生殖結果のリスクが高い可能性があることが示唆されている。 したがって、異数性発生のリスクを低減し、生殖細胞異数性を検出し、その原因メカニズムを理解することは一般的な関心事である。 本研究では、マウス8、X、Y染色体に特異的なDNAプローブを用い、それぞれ異なる色で標識した精子-FISHアッセイにより、生殖細胞の異数性を決定した。 方法の信頼性を判断するために、陽性対照物質として異数性優勢であることが知られているコルヒチンを用いたところ、陽性対照と陰性対照の結果は先行研究の結果と同じ範囲であった 、-. これらのデータは、試験化合物の異数体形成作用の検出における実験プロトコルの感度を確認した。

エピルビシンは細胞周期のS期とG2期で最も活性があるが、細胞周期のすべての期で何らかの検出できる活性を持っている . 化学物質が減数分裂と有糸分裂の両方で細胞分裂の進行を変化させることはしばしば報告されている． 本研究では、BrdU-incorporation assay を用いて、精子細胞の減数分裂から精巣上体精子への発達時間を評価した。 その結果、エピルビシンはマウス精子細胞の減数分裂の期間を48時間延長させることが明らかになった（Fig.3）。 このことは、エピルビシンによるトポイソメラーゼIIの機能阻害が、細胞周期の異なる段階において細胞周期の進行を遅らせ、細胞をG2/M期で停止させるというこれまでの知見を裏付けるものであった。 このようなG2/M期の停止は、細胞が次の細胞周期段階に移る前に損傷したDNAを修復するG2チェックポイント機構の誘導によるものと考えられる。

エピルビシンの減数分裂中の非分裂への影響に関するin vivoの情報は限られているが、ドキソルビシンやその誘導体のイダルビシンなど他の特定のアントラサイクリンは染色体の分配を阻害して、二倍体および二倍体の精子の割合に著しい増加を引き起こす … さらに、チャイニーズハムスターの培養液をエピルビシンで処理すると、低倍数体および高倍数体という形で数的異常が誘発されることがin vitro研究で示された。 また、マウス精子形成のフローサイトメーターおよび組織学的分析では、エピルビシン処理後に異数性の指標であるDNAヒストグラムにおける変動係数が増加し、2倍体精子が増加することが示された … 以上の報告と一致するように、本実験では、エピルビシン曝露により、ジソミック精子および二倍体精子の頻度が用量依存的に有意に増加し、異数性の誘発がエピルビシン0〜12 mg/kgの間で線形用量反応性を示した（図4）。 これらの in vivo 観察結果は、健康な人とがん患者から採取したヒトリンパ球を培養し、ドキソルビシン曝露によって 7 番染色体および 17 番染色体のトリソミーが増加したという以前の in vitro 報告とも一致する。 さらに、Ganapathi らは、モノソミー 8 を唯一の核型変化として持つヒト白血病 HL-60 細胞が、ドキソルビシンへの曝露により 7q21 マーカーを獲得したことを報告している。 さらに、細胞遺伝学的所見では、アントラサイクリンによる全身化学療法を受けた患者においてトリソミー8が認められた。 アントラサイクリンを含む化学療法を受けた患者では、7番モノソミー、7q-、および7番染色体を含むアンバランス転座が観察された。 さらに、1番、9番、16番の構造的な染色体異常は、アントラサイクリンを含む化学療法剤と関連している。

他のクラスのトポイソメラーゼII阻害剤の中で、エトポシドは以前にマウスの精子細胞で研究されている 、 。 これらの研究の結果は、エトポシドが遺伝毒性物質として作用し、パキテン細胞を処理した後、主に減数分裂の生殖細胞に異数性を誘発することを示している。 一方、KallioとLähdetieは、マウスにおけるエトポシドの感受性は、初代精母細胞の複核-双子葉期が最も高く、後期分裂期は低く、前胞体期は低いことを見出し、DNAアルキル化剤とは全く異なるパターンであることを明らかにした。 このことから、エトポシドによる染色体組み換えの失敗が、細胞周期の停止とアポトーシス経路の起動に関連していることが示唆された。 Marchettiらの詳細な細胞遺伝学的研究により、パキテンは構造的染色体異常および異数性の誘発に関して精子形成の最も敏感な段階であることが報告された。 SchmidらのデータおよびKallioとLähdetieのデータは、エトポシドが減数分裂の細胞周期を延長することを証明できたので、Marchettiらが24.5日交配群の最初の分裂で見た効果は、実際にはより遅い段階、すなわち、次の段階で誘発された可能性があると思われる。 本研究では、低用量のトポイソメラーゼII阻害剤エピルビシンを亜急性期に投与することで、前駆期がエピルビシン投与に含まれるため、効果があるかどうかを調べるために精子FISH試験を計画した。 0.25、0.5、1 mg/kgのエピルビシンを12日間連続して注射し、エピルビシンの最終投与から23日後に精子を採取した。 減数分裂の前段階全体に合計12 mg/kgのエピルビシンを投与すると、ジソミックおよび二倍体の精子頻度が有意に増加したが、合計3および6 mg/kgのドキソルビシンは陰性だった（Fig.5）。 一方、6 mg/kgのエピルビシンをMMI/MMII中の精母細胞に単回投与すると、陽性となった（図4）。 これらのデータは、エピルビシンによって誘発される雄性生殖細胞の異数性には、より早いプロフェーズの段階での寄与が比較的少ないことを示唆している。

本研究では、エピルビシンによって自倍数精子（XX88およびYY88）が顕著に増加することが明らかにされた。 エピルビシン投与後、MMIIの停止による自家倍数精子はMMI中の停止による二倍体精子（XY88）より多かった。 このように、第二減数分裂は第一減数分裂よりもエピルビシン処理に敏感であった。 第二減数分裂が第一減数分裂よりもエピルビシン処理に敏感であるという結論は、観察されたディスオミックの性染色体の頻度によっても支持される。 XX8またはYY8のシグナルを持つ精子は、XY8のシグナルを持つ精子より頻度が高かった。 これらの観察から、ディスオミあるいは倍数体に関する精子FISHアッセイは、以前に報告したように、両方の減数分裂中に誘発される影響を検出することができ、両方の減数分裂の感度を比較することができることを確認した , .

本精子FISHアッセイにおいて、ディスオミあるいは倍数体を引き起こす最低陽性量はエピルビシン6mg/kgであることが判明した。 しかし、マウス骨髄のMN試験では、3 mg/kgのエピルビシンに曝露すると、MNPCEが有意に増加することが示された。 このことは、骨髄の MN は精子の二倍体や二重体よりも低用量で誘発されることを示唆している。 従って、骨髄はより感受性の高い組織である。 しかしながら、このアッセイは異なるエンドポイントを測定する。 染色体損失および切断はMN試験で測定され、非分裂は精子-FISHアッセイで検出される。 したがって、本データは、骨髄 MN 試験の結果が陽性であれば、生殖細胞における化合物の遺伝毒性 の可能性を示す指標となるという危険性評価の一般的なパラダイムを確認するものである。 しかし、生殖細胞における異数性の定量化はリスク評価上重要である。

DNA トポイソメラーゼ阻害剤は、主にセントロメア陰性のMNを形成する二本鎖DNA切断を引き起こす傾向が明確である 。 同様に、エピルビシンが有効なトポイソメラーゼII阻害剤であることは、エピルビシンがこのメカニズムを通じてそのクラストゲン効果を発揮することを示唆している。 エピルビシンの代謝物はまた、細胞を活性化して細胞内の活性酸素種の産生を促進し、そのうちの安定で拡散性のある形態が核DNAを損傷する可能性がある . 細胞の修復機構に負荷がかかると、一次DNA損傷は構造的または数値的な染色体異常を引き起こし、最終的に腫瘍を引き起こす可能性がある . この示唆は、最初の悪性新生物に対する治療後に第二の悪性新生物を発症した人は、第二の悪性新生物を発症しなかった人に比べて、DNA二本鎖切断の修復能力が低いという事実（γH2AX強度によって測定）からも支持されている。 エピルビシンによるセントロメア陽性MNの誘導は、エピルビシンが遺伝毒性効果を誘導する別のメカニズムが存在する可能性を示している。 この観察は、誘導されたMNの起源を決定するために、MNアッセイのFISH改良版を用いることの重要性を強調している。 エピルビシンが無脳化効果を発揮するメカニズムとして考えられるのは、トポイソメラーゼIIの阻害であり、これは細胞分裂時に染色体の誤分節を引き起こす可能性がある。 これは、DNAトポイソメラーゼIIが細胞分裂の際に姉妹染色分体を適切に分離するのに必要であり、それがない場合は非分裂と切断の両方が起こるためである , . このように、エピルビシンはトポイソメラーゼIIの2つの重要な役割を阻害することができる。新しく複製された染色体を適切に分離する機能と、一過性の二本鎖DNA切断を再び結合させる機能である。 BrdU-incorporation法により、エピルビシンによる減数分裂の遅れは約48時間であることが示された。精子FISH解析により、エピルビシンは減数分裂中に異数体を誘発し、ディスオーム精子を生じるとともに、完全減数分裂停止により二倍体精子を生じることが明らかにされた。 自家倍数体（XX88、YY88）とディスオミック（XX8、YY8）精子の存在は、第2減数分裂が第1減数分裂よりもエピルビシンに対して敏感であることを示している。 また、前段階ではエピルビシンによる異数性誘発への寄与が相対的に少ないことが示唆された。 エピルビシンの造血能と異数性能は、エピルビシンを含む薬物療法にさらされたがん患者や医療従事者に二次腫瘍の発生や異常な生殖機能を生じさせる可能性がある。 エピルビシンは、ドキソルビシンや他のアントラサイクリン系抗腫瘍薬に比べ、全身および心臓への毒性は低いものの、非腫瘍細胞において異数体形成作用および細胞毒性作用を有する。 この異数体形成作用は、エピルビシンを含む化学療法により原発性がんの治療が成功した後に、一部のがん患者で見られる生殖機能の異常や二次性腫瘍の発現に関与している可能性があります

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