Jaderný translokátor arylových uhlovodíkových receptorů (ARNT/HIF-1β) je ovlivněn hypoxií a hypoxickými mimetiky

Abstrakt

Původ: Arylhydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT, HIF-1β) je členem rodiny proteinů basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) a důležitým transkripčním regulátorem, pokud jde o vývoj a fyziologické adaptační procesy. ARNT je spojován s rakovinou a dalšími chorobami. Je známo, že ARNT je translokován do buněčného jádra, kde dochází k akumulaci proteinu. ARNT je heterodimeračním partnerem xenobiotickými ligandy aktivovaného arylového uhlovodíkového receptoru (AhR), proteinů Single Minded (SIM), kardiovaskulárního helix-loop-helix faktoru 1 a proteinů Hypoxia Inducible Factor (HIF-α). ARNT je povinný pro vazbu HIF-1, HIF-2 a HIF-3 na DNA. Zatímco degradace podjednotek HIF-α je hypoxií potlačena, ARNT je obecně považován za konstitutivně exprimovaný v nadbytku v buňce a jeho stabilizace je obvykle považována za nezávislou na kyslíku. My však poskytujeme důkazy, že regulace ARNT je mnohem složitější. Cílem naší studie bylo přehodnotit regulaci exprese ARNT. Metody: Zkoumali jsme buněčné linie různého původu, jako jsou MCF-7 a T47D (lidský karcinom prsu), HeLa (lidský karcinom děložního čípku), Hep3B a HepG2 (lidský hepatom), Kelly (lidský neuroblastom), REPC (lidská ledvina) a Cos7 (primární ledvina primátů). Použili jsme imunoblotovou analýzu, denzitometrii, RT-PCR a transientní transfekci. Výsledky a závěry: Naše výsledky ukazují, že hladiny proteinu ARNT jsou ovlivněny hypoxií a hypoxickými mimetiky, jako je kobalt(II)-chlorid (CoCl2) a dimethyloxalylglycin (DMOG), způsobem specifickým pro buněčnou linii. Prokázali jsme, že tento účinek může být vyvolán HIF-1α, který hraje důležitou roli v procesu stabilizace ARNT v hypoxii.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Úvod

Nukleární translokátor receptoru arylových uhlovodíků (ARNT) je členem rodiny proteinů basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) a klíčovým transkripčním regulátorem, pokud jde o organogenezi a vývoj nervové soustavy i fyziologické adaptační procesy na hypoxii a škodliviny . Kromě ARNT (HIF-1β) existují u různých druhů další dvě izoformy ARNT2 a ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1). ARNT a ARNT2 mají >90% aminokyselinovou identitu. ARNT má v dospělé tkáni všudypřítomnější expresní vzorec než ARNT2. Nedávné studie uvádějí souvislost ARNT s několika buněčnými dysfunkcemi a chorobami, jako je rakovina a diabetes .

Stejně jako všechny molekuly bHLH musí ARNT dimerizovat, aby vytvořil aktivní vazebné komplexy DNA. Je známo, že ARNT tvoří heterodimery s xenobiotickým ligandem aktivovaným arylovým uhlovodíkovým receptorem (AhR), s nímž jsou indukovány metabolické enzymy, s podjednotkami HIF-α (Hypoxia Inducible Factors) při nízké hladině kyslíku, SIM (Single Minded) proteiny pro nervový vývoj a CHF1 (cardiovascular helix-loop-helix factor 1) . Dříve jsme ukázali, že ARNT je s největší pravděpodobností translokován do jádra klasickým jaderným importem zprostředkovaným importiny α/β . Navzdory koexistujícímu jadernému exportu se ARNT hromadí hlavně v jádře .

Při hypoxii jsou α-podjednotky faktorů indukovaných hypoxií (HIF-α) stabilizovány a tvoří heterodimery s ARNT (HIF-1β), které regulují buněčnou odpověď na nízké hladiny kyslíku. V současné době jsou identifikovány tři různé izoformy podjednotek HIF-α závislých na kyslíku: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) a HIF-3α . Za normoxických podmínek podléhají proteiny HIF-α hydroxylaci pomocí enzymů s prolyl-hydroxylázovou doménou 1-3 (PHD1-3). Prolyl-hydroxylovaný HIF-α slouží jako rozpoznávací motiv pro polyubikvitinaci proteinem Von Hippel-Lindau (pVHL) a následnou proteazomální degradaci. ARNT však postrádá degradační doménu závislou na kyslíku (ODDD) a má se za to, že je za normoxických podmínek neustále exprimován . Podle současného názoru nemá hypoxie na hladinu ARNT žádný vliv . Existují však rozptýlené studie, které pozorovaly částečné současné zvýšení hladin proteinu ARNT při hypoxii . Zde předkládáme důkaz, že exprese ARNT je skutečně ovlivněna a modulována v závislosti na hodnoceném typu buněk. To naznačuje, že nádorové buňky mohou během tumorigeneze ztratit schopnost regulace ARNT. Naše údaje ukazují, že regulace exprese ARNT je mnohem složitější, než se obecně předpokládá.

V naší studii jsme zkoumali expresi ARNT při různých typech hypoxie, hypoxických mimetikách a hypoxií indukovatelných faktorech, přičemž jsme odhalili vzorce exprese specifické pro buněčné linie a závislé na kofaktorech.

Materiál a metody

Buněčné kultury, indukce hypoxie a hypoxická mimetika

Buněčné linie MCF-7 (lidský duktální karcinom prsu), T47D (lidský duktální karcinom prsu), Hep3B (lidský hepatocelulární karcinom), HeLa (lidský adenokarcinom děložního hrdla), HepG2 (lidský hepatocelulární karcinom) a Cos-7 (buňky ledvin podobné fibroblastům primátů) byly inkubovány v kultivačním médiu DMEM (Gibco). Buněčné linie REPC (primární lidská ledvina, ) a Kelly (lidský neuroblastom) byly kultivovány v médiu RPMI-1640 (Gibco). Kultivační médium bylo doplněno 10% fetálním telecím sérem (FCS, Gibco) a 100 IU/ml penicilinu / 100 µg/ml streptomycinu, resp. Buňky byly pěstovány ve zvlhčeném prostředí při 37 °C, 5 % CO2 a 20,9 % O2 (normoxie). Pro hypoxické studie byly buňky umístěny ve zvlhčené atmosféře při 37 °C, 5 % CO2, vyváženém N2 s 1 % nebo 3 % O2. Jako hypoxické mimetikum byl použit kobalt(II)-chlorid (CoCl2) v ředění 50 µM a dimethyloxalylglycin (DMOG) v ředění 1 mM.

Přechodná transfekce

Buněčné linie MCF-7, T47D a Hep3B byly transfekovány siRNA pomocí transfekčního činidla Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen). Buňky byly před transfekcí vypěstovány do 50% konfluence v 6jamkových kultivačních destičkách podle protokolu výrobce. Před aplikací hypoxie bylo kultivační médium vyměněno a buňky byly inkubovány dalších 6 hodin v normoxických podmínkách.

Imnoblotová analýza a denzitometrie

Pro Western blotting byly buňky po ošetření odebrány, promyty ledovým PBS, extrahovány močovinovým lyzačním pufrem a sonikovány za vzniku celobuněčných lyzátů. Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí testu Bio-Rad DC Protein Assay podle protokolu výrobce. Proteinové extrakty byly elektroforézovány pomocí SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózové membrány polosuchým elektroblotováním. Membrány byly blokovány pomocí 5% odtučněného mléka v PBS. Primární protilátky (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) byly inkubovány přes noc a poté byly přidány HRP odpovídající sekundární protilátky (DAKO 1:5000) po dobu 2 hodin. Jako detekční činidlo bylo použito ECL (GE Healthcare). Množství proteinů bylo porovnáno pomocí Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) podle protokolů. Pozadí každého Western blotu bylo odečteno od jednotlivých měřených ploch. Příslušné zatížení laminu A/C bylo považováno za 100 % a byla vypočtena poměrná hodnota.

Izolace RNA a RT-PCR

Pro měření specifických kvantitativních hladin mRNA byla z buněk izolována celková RNA pomocí přípravku ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) podle pokynů výrobce. Poté bylo 0,2 µg RNA reverzně přepsáno pomocí programu Superscript III (Invitrogen). Vytvořená cDNA byla použita jako templát pro kvantitativní analýzu PCR v reálném čase (RT-PCR). RT-PCR byla provedena pomocí systému ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) a KAPA SYBR FAST Universal (Peqlab). Amplifikace byla provedena pomocí TaqMan Gene Expression Assays (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) podle protokolů výrobce. Pro normalizaci byly použity primery specifické pro housekeepingový gen L28 (sense: 5`-ATGGTCGTGCGGAACTGCT-3` a reverse: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`). Cyklické podmínky zahrnovaly počáteční aktivační krok polymerázy při 95 °C po dobu 10 minut, následovaný 45 cykly při 95 °C po dobu 15 s, 55 °C po dobu 30 s a při 72 °C po dobu 20 s. Vzorky byly analyzovány ve čtyřech opakováních a relativní množství mRNA bylo vypočteno pomocí metody ∆∆CT.

Statistika

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad InStat. Byl použit nepárový t-test. Grafy jsou zobrazeny jako průměr ± směrodatná odchylka (SD). Byly provedeny testy přežití MTT (údaje nejsou uvedeny), aby se zajistilo, že se přežití buněk mezi vzorky neliší.

Výsledky

Exprese ARNT je indukována při hypoxii u MCF-7, HeLa, Hep3B a REPC buňkách

Zkoumali jsme množství hladiny proteinu ARNT pěstováním buněk MCF-7 v normoxických podmínkách (21 % O2) po dobu 24 hodin s následnou 48hodinovou normoxií (Nox) nebo 24hodinovou normoxií a 24hodinovou 1% hypoxií (Hox 1% 24h, 1% O2) nebo pouze 48hodinovou 1% hypoxií (Hox 1% 48h, 1% O2). Celobuněčné extrakty byly analyzovány pomocí imunoblotu s použitím monoklonální myší protilátky anti-ARNT. Pro potvrzení hypoxické indukce buněk byl pozorován protein HIF-1α. Jak ukazuje obr. 1, hladiny proteinu ARNT byly v reakci na hypoxii v buňkách MCF-7 zvýšené. Inkubace 24 hodin s 1% hypoxií vedla k významnému zvýšení hladiny ARNT ve srovnání se 48 hodinami s 1% hypoxií.

BuňkyMCF-7 byly inkubovány až 96 hodin v 1% hypoxii, aby se odhalily dlouhodobé účinky hypoxie. Buňky MCF-7 vykazovaly po 12 hodinách zvyšující se koncentraci ARNT. Při dalším vystavení hypoxii začala koncentrace ARNT klesat až na výchozí hodnotu (obr. 2).

Indukce ARNT v důsledku různé intenzity hypoxie byla měřena při kultivaci buněk MCF-7 v 3% hypoxii (3% O2) a 1% hypoxii (1% O2) po dobu 12 hodin a 24 hodin (obr. 1). 3a).

Pro objasnění rozdílů mezi odlišnými buněčnými liniemi jsme kultivovali buňky HeLa, Hep3B a REPC podobně jako buňky MCF-7 (obr. 3b-d). U všech typů buněk ošetřených hypoxií byly hladiny proteinu ARNT zvýšené. Hypoxie 1 % vedla k rychlejšímu zvýšení hladin proteinu ARNT, ale také k dřívější normalizaci než hypoxie 3 %. 3% hypoxie vykazuje maximální indukci ARNT po 24 hodinách.

Různé buněčné linie vykazují různé reakce na hypoxii a mimetika hypoxie, pokud jde o hladiny proteinů ARNT

Pro zkoumání vztahu mezi hladinami ARNT a HIF-α byly buňky MCF-7, HeLa, Cos7, REPC, HepG2, Hep3B a Kelly ošetřeny mimetiky hypoxie kobalt(II)-chloridem (CoCl2) a dimethyloxalylglycinem (DMOG) (obr. 1). 4a-g).

Buňky HepG2 a Kelly nereagovaly na 24hodinovou hypoxii zvýšením hladiny proteinu ARNT. Buňky HeLa vykazovaly mírnou indukci ARNT při hypoxii a při léčbě mimetiky hypoxie, ale tento účinek nebyl statisticky významný. U buněk MCF-7 bylo zřetelné zvýšení hladiny proteinu ARNT při 24hodinové 3% hypoxii a zvýšení hladiny proteinu ARNT v důsledku léčby CoCl2. Na druhou stranu léčba DMOG neměla na hladiny ARNT v buňkách MCF-7 žádný vliv, přestože DMOG je velmi silný stabilizátor HIF. Buňky Cos7 vykazovaly silný účinek indukce ARNT na hypoxii i na hypoxická mimetika CoCl2 a DMOG. Buňky REPC vykazovaly silnou odpověď na hypoxii, avšak indukce ARNT CoCl2 byla poměrně malá. DMOG snížil hladinu proteinu ARNT v buňkách REPC. Buňky HepG2 nereagovaly indukcí hladiny proteinu ARNT na hypoxii ani na DMOG. Buňky HepG2 však vykazovaly velmi silnou indukci ARNT působením CoCl2. Buňky Hep3B reagovaly zvýšením hladiny proteinu ARNT na všechna ošetření. Kellyho buňky nevykazovaly žádnou reakci hladiny proteinu ARNT ani na hypoxii, ani na mimetika hypoxie.

Změny hladin mRNA ARNT nekorelují s hladinami proteinu ARNT pod vlivem hypoxie a mimetik hypoxie

Pomocí kvantitativní metody RT-PCR jsme zkoumali hladiny mRNA související s pozorovanými změnami hladin proteinu ARNT. Buňky MCF-7, HeLa, REPC a Hep3B byly kultivovány v normoxických podmínkách před aplikací 3% hypoxie, 1% hypoxie, CoCl2 a DMOG po dobu 24 hodin (obr. 5). U buněk MCF-7 došlo v reakci na hypoxii k nevýznamnému poklesu hladin mRNA ARNT. Bylo však pozorováno významné snížení hladin ARNT mRNA v důsledku působení CoCl2 a DMOG. Zatímco buňky HeLa a REPC nevykazovaly po ošetření žádný vliv na hladinu mRNA ARNT, buňky Hep3B reagovaly na hypoxii silným snížením mRNA ARNT. U těchto buněk byla pozorována mírně se snižující reakce na CoCl2.

Protein ARNT je stabilizován v přítomnosti HIF-1α

BuňkyMCF-7, T47D a Hep3B byly transientně transfekovány siRNA HIF-1α, aby se objasnil vliv Hif-1α na hladiny proteinu ARNT (obr. 6). Buňky byly inkubovány 48 hodin v normoxii s transfekčním činidlem RNAiMAX a siRNA, po nichž následovala 6hodinová fáze zotavení. Následně byly buňky ponechány v 1% hypoxii po dobu 24 hodin. Pozorovali jsme, že hladiny proteinu ARNT se v hypoxii snížily, pokud byl blokován HIF-1α. Nespecifická transfekce siRNA však neměla vliv na pozorované zvýšení hladin proteinu ARNT v hypoxii.

Diskuse

Nukleární translokátor receptoru pro arylové uhlovodíky (ARNT/HIF-1β) hraje roli klíčového transkripčního regulátoru v buněčné homeostáze. Funguje jako heterodimerační partner různých hlavních regulačních proteinů, jako jsou HIF-α, SIM proteiny, AhR a CHF1. Proto je zapojen do spousty různých regulačních buněčných drah . Vzhledem k tomu, že se předpokládá, že ARNT je konstitutivně exprimován a není ovlivňován fyziologickými nebo farmakologickými změnami, například hypoxií, nebyl v dřívějších zprávách považován za limitující faktor a možný terapeutický cíl . Nedávné studie však uvádějí souvislost mezi ARNT a několika onemocněními, například rakovinou . Je známo, že HIF-1α a HIF-2α mají zásadní funkce při vývoji a/nebo léčbě rakoviny . Deplece ARNT jako jejich povinného kofaktoru by vedla k neaktivitě nebo snížení hladin komplexů HIF-α . Abychom dále zdůraznili význam ARNT, poprvé jsme prokázali, že hypoxie, mimetika hypoxie a HIF-1α hrají důležitou roli v regulačních mechanismech exprese ARNT v závislosti na hodnoceném typu buněk.

Zkoumali jsme osm různých buněčných linií dvou různých druhů hostitelů, abychom prokázali vliv hypoxie a mimetik hypoxie na expresi proteinu ARNT. Buňky karcinomu prsu MCF-7 reagují na hypoxii zvýšením hladiny proteinu ARNT, zatímco hladina mRNA ARNT se zřejmě snižuje nebo zůstává nezměněna. To znamená, že mezi stabilizací proteinu a syntézou de novo existuje vzájemná zpětná vazba. Podobné poklesy a vzestupy genové transkripce při hypoxii jsou známy u několika enzymů a molekul . Naše zjištění nejsou nutně důsledkem obecného snížení syntézy mRNA v buňce jako odpovědi na buněčný stres, protože transkripce genu ESR2 je indukována při hypoxii a knock-down HIF-1α (nepublikované údaje).

Vystavení hypoxii po dobu delší než 48 hodin vede k návratu k bazálním hladinám proteinu ARNT, které lze pozorovat při normoxii. Podobný vrchol exprese je znám u proteinu HIF-1α po 4 až 12 hodinách při hypoxickém působení. Další hypoxická inkubace vede k poklesu hladin HIF-1α až do dosažení ustáleného stavu . Tato skutečnost by mohla naznačovat stabilizační účinek nadměrné exprese HIF-1α vůči ARNT. Tvorba komplexů HIF-1α/ARNT v jádře by mohla zabránit degradaci ARNT prostřednictvím proteazomů, což je v souladu s Choi et al. a Mandl et al. Abychom prozkoumali naše zjištění, přechodně jsme v buňkách MCF-7 vyřadili HIF-1α a pozorovali jsme až 90% snížení hladiny proteinu ARNT v hypoxii ve srovnání s normoxií. Tento účinek byl pozorován také u buněk T47D a Hep3B. Zkřížená reakce siRNA HIF-1α knokautující ARNT kvůli silné sekvenční homologii mezi ARNT a HIF-α byla vyloučena analýzou siRNA a genových sekvencí in silico. Tato zjištění naznačují silnou korelaci mezi expresí ARNT a proteinu HIF-1α. Vysvětlením by mohl být stabilizační účinek vazebných partnerů ARNT nezávislých na O2, jako jsou AhR, SIM a CHF1, vůči ARNT v normoxii. Při hypoxii by snížené hladiny AhR, SIM a CHF1 mohly být kompenzovány nadměrnou expresí HIF-α, pokud jde o stabilizaci ARNT. Vyřazení HIF-1α by proto mohlo vést k vysoce sníženým hladinám ARNT prostřednictvím snížené syntézy de novo a menší stability vůči ubikvitinaci a proteasomální degradaci, protože chybí dimerizační partneři. Tato hypotéza by zdůrazňovala regulaci ARNT vysoce závislou na vazebných partnerech, což by bylo v souladu s Choi et al. a Mandl et al . Abychom zjistili, zda indukce HIF-α vede k současnému zvýšení exprese ARNT, ošetřili jsme buňky CoCl2 a DMOG. Navzdory tomu, že HIF-α stabilizující účinek CoCl2 a DMOG je analogický, buňky MCF-7 po DMOG reagují méně výrazně zvýšením proteinu ARNT než po ošetření CoCl2. Tato pozorování jsou v souladu se stabilizačním účinkem HIF-α na ARNT. Opačné chování mezi CoCl2 indukujícím ARNT na rozdíl od DMOG bylo možné pozorovat u buněk HepG2. Zajímavé je, že buňky REPC reagují snížením hladin ARNT při léčbě DMOG. Ačkoli HIF-α stabilizující účinek DMOG je podobný jako u CoCl2, odlišná buněčná reakce DMOG není neobvyklá vzhledem k odlišnému způsobu účinku. Na druhou stranu buňky Cos7 a Hep3B reagují na hypoxii a obě hypoxická mimetika silným zvýšením hladiny proteinu ARNT, což je v souladu se stabilizačním účinkem HIF-α postulovaným Mandlem et al. . Skutečnost, že na rozdíl od různých nádorových buněčných linií jsou hladiny ARNT v primární buněčné linii Cos7 dobře ovlivněny hypoxií a hypoxickými mimetiky, by mohla znamenat ztrátu funkce během tumorigeneze u některých nádorů. Údaje týkající se ARNT v buněčném vývoji nádorů jsou vzácné, a proto je zapotřebí dalšího zkoumání.

Buněčná linie Hep3B vykazuje významné zvýšení hladin proteinu ARNT v důsledku všech tří hypoxických ošetření, zatímco hypoxie a CoCl2 významně snižují mRNA ARNT. Tato zjištění podporují hypotézu mechanismu vzájemné zpětné vazby, kterou lze předpokládat i u buněk MCF-7. Buněčná linie ledvin REPC vykazuje odchylné chování. Tyto buňky reagují silným zvýšením proteinu ARNT v důsledku hypoxie, ale s méně intenzivní indukcí v důsledku CoCl2 a v nesouladu s klesajícími hladinami proteinu ARNT při léčbě DMOG, jak bylo uvedeno výše. Dále však buňky REPC nevykazují žádné rozdíly v hladinách mRNA ARNT při různých ošetřeních, což naznačuje regulaci na proteinové bázi.

Kellyho buňky vykazují stabilní hladiny proteinu ARNT. Hypoxie ani mimetika hypoxie nejsou schopny ovlivnit ARNT. Takové stabilní hladiny ARNT lze pozorovat i u buněk HepG2 při hypoxii a léčbě DMOG, ale tato buněčná linie reaguje silným nárůstem proteinu ARNT při léčbě CoCl2. Buňky HeLa nevykazují významné změny hladin ARNT, ani pokud jde o protein, ani o mRNA. Tato zjištění podporují současný názor, že ARNT je exprimován neustále a není ovlivněn hypoxií, jak uvádí Semenza . My i jiní jsme ukázali, že tento názor nelze zobecnit . Tímto poskytujeme údaje, které jsou v rozporu s hypotézou o neustále exprimovaném a neregulovaném heterodimeračním partnerovi ARNT, která je však v souladu s názorem Chilova et al, . Rovněž podporujeme Choi et al. a Mandl et al. a ukazujeme, že heterodimerizace s HIF-α je důležitým mechanismem stabilizace proteinu ARNT při hypoxii .

Na závěr naše údaje naznačují obecnou stabilizační regulaci vazebných partnerů ARNT, jako jsou HIF-α, AhR, SIM a CHF1, pokud jde o expresi ARNT. Dále můžeme ukázat, že každá buněčná linie/typ reaguje na hypoxii a hypoxická mimetika odlišně, pokud jde o indukci syntézy proteinů ARNT. Proto není přípustná univerzální predikce buněčného rozpětí exprese proteinu ARNT. Tato zjištění ukazují, že regulace ARNT by měla být dále zkoumána, zejména pokud jde o nádorové bujení, protože regulace ARNT je mnohem složitější, než se dnes předpokládá.

Poděkování

Jsme vděčni T. Svenssonovi, B. Rudzewskému a A.-K. Hellbergovi za vynikající technickou podporu. The authors declare that they have no conflict of interest.

Kontakty autora

Údaje o článku / publikaci