Miniaturní bioreaktory: současné postupy a budoucí příležitosti

Úvod

Příchod molekulární biologie a technologie genetické manipulace v posledním čtvrtstoletí dramaticky ovlivnil farmaceutický/zdravotnický průmysl, přičemž velké množství z mnoha aplikací této technologie je založeno na schopnosti vytvářet rekombinantní buněčné linie pro lidský terapeutický prospěch. Kromě vývoje těchto geneticky modifikovaných organismů zůstává potřeba zlepšit produktivitu divokého typu, urychlit screening nově objevených mikrobů a pokračovat v pokroku souvisejících úkolů, jako je zlepšování růstových médií a optimalizace procesů. Vývoj procesů kultivace buněk tradičně vyžadoval screening velkého počtu buněčných linií v protřepávacích baňkách a z toho další testování úspěšných kandidátů ve stolních bioreaktorech před studiemi v pilotním měřítku. Potřeba provádět obrovské množství vývojových kultivací vedla k pokroku a stále širšímu nasazení malých bioreaktorových systémů, které nabízejí miniaturizované HT řešení pro vývoj procesů.

Hlavními typy buněk používanými k výrobě terapeutických produktů jsou bakteriální a savčí buňky, z nichž každý má jedinečné výhody a omezení, které ovlivňují typ bioreaktoru používaného pro vývoj procesů. Bakteriální buňky jsou obecně robustní a nejsou náchylné k poškození smykem, což znamená, že lze použít vysoce smykové radiální oběžná kola (např. Rushtonovy turbíny) a vysoké rychlosti míchání. Díky tomu mají takové bioreaktory vysokou schopnost přenosu hmoty, což umožňuje podporovat rychle metabolizující kultivace mikrobiálních buněk s vysokou hustotou buněk a zvyšuje množství produktu, které mohou takové bioprocesy poskytnout. Ačkoli savčí buňky nemají ochrannou buněčnou stěnu, a proto jsou obvykle náchylnější ke smyku a vyžadují šetrnější zacházení než jejich bakteriální protějšky, většinu komerčně používaných buněčných linií lze pěstovat v bioreaktorech s míchanou nádrží, i když s konstrukčními úpravami. Například místo Rushtonových turbín lze použít axiální oběžná kola s nízkým smykem, která jemně cirkulují buňky a živiny v prostředí bez přepážek, a do buněčných kultivačních médií lze přidávat ochranné látky proti smyku, jako je sérum nebo Pluronic F-68 .

Kromě vývoje terapeutických léčiv lze MBR použít pro vývoj růstových médií; zlepšování kmenů pomocí metabolického inženýrství nebo řízené evoluce; a takzvaný biorozbor přírodních produktů – což jsou všechno procesy, které s sebou nesou velkou zátěž bioreaktorů, kterou lze zmírnit použitím miniaturních zařízení HT. MBR mohou zejména snížit pracnost a materiálové náklady na obrovské množství buněčných kultivací nezbytných při vývoji bioprocesů, čímž se zvýší dosažitelná úroveň paralelismu a propustnosti, a proto se těší rostoucímu zájmu . Je důležité, aby se tato zařízení používaná pro vývoj procesů mohla spolehnout na to, že přesně napodobují bioreaktory v laboratorním a pilotním měřítku, takže lze očekávat, že kinetika růstu a exprese produktů – optimalizovaná v miniaturním měřítku – se bude kvantitativně rozšiřovat.

Ačkoli jsou MBR nepochybně schopnější provozu HT než konvenční bioreaktory v laboratorním měřítku, jsou v současné době obvykle méně instrumentovány a mají také omezenou možnost off-line odběru vzorků kvůli malým používaným objemům (od cca 0,1 ml do cca 100 ml); to znamená, že v současné době existuje kompromis mezi obsahem informací ve smyslu kvality a množství údajů dostupných z bioreaktoru získaných jak on-line, tak off-line měřením a průchodností experimentu, což je znázorněno na obrázku 1. Vzhledem k tomu, že žádné zařízení dosud nevyřešilo všechny problémy miniaturizace, tj. přesného napodobení procesních podmínek ve velkém měřítku, a přitom si stále zachovává plnou funkčnost konvenčních bioreaktorů, je záměrem autorů provést přehled současného vývoje a následně uvést, kam se technologie v budoucnu pravděpodobně posune, aby bylo možné rozšířit současné výhody HT a snížit informační mezeru, která v současnosti existuje mezi miniaturními a laboratorními bioreaktorovými platformami. V tomto přehledu jsou různé popsané MBR seskupeny podle způsobu míchání (tj. třepání, míchání nebo plnění plynem) s odkazem na typ konvenčního bioreaktoru, který buď napodobují, nebo jsou z něj odvozeny; klíčové specifikace a vlastnosti prototypů a komerčních miniaturních zařízení pro kultivaci buněk schopných paralelního provozu jsou shrnuty v tabulce 1.

Miniaturní třepané bioreaktorové systémy

Třepané systémy se v bioprocesech používají již od prvních pokusů o pěstování mikrobiálních kultur produkujících antibiotika ve 40. letech 20. století. Stále se hojně využívají v průmyslu i na akademické půdě jako nástroj pro objevování léčiv, optimalizaci médií, kmenů a produktů a vývoj procesů . Zahrnují mnoho různých provedení a objemů, od protřepávacích baněk o objemu stovek mililitrů až po mikrotitrační destičky (MTP) o objemu několika mikrolitrů.

Protřepávací baňky

V posledních padesáti letech vědci používají kultivaci buněk v protřepávacích baňkách jako prostředek pro vývoj procesů v malém měřítku s objemy od cca 10 ml do 500 ml . Protřepávací baňky mají různé podoby, mohou být vyrobeny ze skla nebo plastu a některé mají přepážky, které napomáhají provzdušňování a míchání. Lze je míchat pomocí orbitálního nebo lineárního třepání a mohou být umístěny ve skříni s řízenou teplotou. Mezi faktory, které ovlivňují kultivaci v protřepávacích baňkách, patří velikost nádoby, objem náplně, konstrukční materiál, geometrie přepážek, frekvence protřepávání a typ zátky použité k uzavření nádoby. Büchs tvrdí, že třepací baňky se podle odhadů používají pro více než 90 % všech kultivačních pokusů v průmyslu i na akademické půdě, přičemž se v nich pěstuje široká škála mikroorganismů, např. bakterie, houby a kvasinky, jakož i buňky savců. Je snadné pochopit, proč jsou tak široce používány: představují levný a účinný způsob reprodukovatelného provádění mnoha typů průmyslově relevantních buněčných kultivací pro vývoj procesů. Navíc se snadno ovládají a jsou do značné míry odolné vůči mechanickým komplikacím. Po většinu dlouhého období jejich používání docházelo jen k málo významným úpravám technologie , bez online monitorování kultur a ručního přidávání a odběru vzorků. Teprve v poslední době byly zavedeny přístrojově vybavené protřepávací baňky, které jsou určeny k měření a případné online kontrole pH a hladiny DOT . pH a rozpuštěný kyslík lze měřit pomocí barviva oxidu ruthenia, které v přítomnosti vodíkových iontů, resp. kyslíku, kvantifikovatelně fluoreskuje při excitaci LED lampou. Toto barvivo může být buď zabudováno do náplasti a nalepeno uvnitř baňky, nebo naneseno na hrot sondy s optickým vláknem a ponořeno do zájmové kultury. Mezi další parametry, které lze nyní měřit online, patří rychlost přenosu kyslíku (OTR) a rychlost vývinu oxidu uhličitého (CER) – a z nich lze odvodit respirační kvocient (RQ). Sledování těchto parametrů online by umožnilo provádět sofistikovanější strategie kultivace buněk, například podávání substrátu na základě změn pH kultivačního bujónu v důsledku metabolismu buněk . Kromě toho Akgün a kol. nedávno vyvinuli nový systém protřepávacích baněk, který je schopen kontinuálního provozu, a tím rozšiřuje možnosti paralelního vývoje bioprocesů pomocí protřepávaných systémů.

Hlavním omezením protřepávacích baněk je však jejich závislost na povrchové aeraci, což vede ke sníženému přenosu kyslíku ve srovnání s reaktory s míchanou nádrží (STR). Wittmann a kol. uvedli hodnoty celkového objemového koeficientu přenosu hmoty (kLa) v protřepávacích baňkách až 150 h-1. V novém systému protřepávacích baněk ve tvaru krabice, který vyvinuli Kato a Tanaka , byly zaznamenány hodnoty kLa 151 h-1 (600 ml, 200 otáček za minutu) až 277 h-1 (100 ml, 200 otáček za minutu), které jsou dostatečně vysoké pro provádění většiny dávkových kultivací buněk bez inhibice mikrobiálního růstu. Tito výzkumníci do horních rohů svých prototypů baněk zabudovali plynopropustné membrány, které umožnily účinnější proudění plynu do nádoby během protřepávání, čímž byl překonán problém, který se vyskytuje u běžných protřepávacích baněk, kdy se do systému sterilním způsobem dostává více vzduchu. Pro účely kultivace, kde je potřeba kyslíku vysoká, může zavedení přepážek zvýšit OTR při nižších frekvencích třepání ; vysoké rychlosti však mohou vést k nadměrnému rozstřiku, který může způsobit ucpání plynopropustné zátky (často vyrobené z vaty) v horní části baňky v důsledku nasycení kapalinou. Bylo prokázáno, že takové ucpání výrazně snižuje schopnost systému přenášet kyslík, což by mohlo způsobit problémy, pokud by se pěstoval rychle reagující aerob. Hladovění po kyslíku by mohlo zpomalit rychlost růstu, změnit rychlost tvorby produkce a/nebo vytvářet nežádoucí toxické vedlejší produkty, např. tvorbu acetátu u Escherichia coli .

Mikrotitrové destičky

MTP (nazývané také mikrobuněčné destičky) byly poprvé zavedeny v roce 1951 jako platforma pro diagnostické testy a stále se široce používají v biologických vědách . Zvládají diagnostické testy, jako jsou enzymatické imunosorbentní testy, které využívají možnosti provádět mnoho identických reakcí paralelně a ve velmi malém měřítku. Právě tato výhoda vedla k tomu, že se MTP používají jako miniaturní protřepávané bioreaktory ve fázi screeningu při vývoji procesů pro hodnocení buněčných linií . Desky jsou obvykle vyrobeny z plastu, i když existují i skleněné a kovové verze. Míchání lze dosáhnout pomocí aspiračních pipet nebo magneticky rozrušených míchadel; zdaleka nejběžnější metodou je však orbitální třepání celé desky na vyhřívaném bloku schopném regulovat teplotu kultury. Počet jamek obsažených v MTP je obvykle 6, 12, 24, 96 a 384, přičemž pro ultravysoce výkonný screening (UHTS) je nyní k dispozici až 1536 a 3456 jamek. Jamky mohou být obdélníkové nebo válcové, přičemž čtvercová geometrie napomáhá míchání a přenosu kyslíku tím, že napodobuje působení přepážek. Destičky se čtvercovým dnem působí podobně, protože omezují víření kapaliny uvnitř jamky, a tím zvyšují turbulenci systému. Vzhledem k nárůstu plochy povrchu způsobenému větším rozptylem kapaliny po stěnách každé mikrotrubičky a zvýšené hnací síle pro kyslík způsobené lepším mícháním je OTR úměrná amplitudě a frekvenci chvění, proto může být zvýšení těchto parametrů prospěšné . Kromě toho Hermann a kol. uvádějí, že OTR je nepřímo úměrná objemu náplně, zejména při vyšších frekvencích třepání . Existuje však bod, za kterým jakékoli zvýšení míchání vede k rozlití procesní kapaliny (pokud není vrt uzavřen – což má své vlastní problémy se sníženým přenosem kyslíku do vrtu). Stejně jako u protřepávacích baněk vyplývá relativně nízká kapacita přenosu kyslíku u MTP (hodnoty kLa až 200 h-1 u 96jamkových destiček) ze skutečnosti, že se jedná o protřepávané systémy, které jsou při přenosu hmoty závislé na povrchovém provzdušňování. Naproti tomu Kensey a kol. uvedli hodnoty kLa při použití sulfitové oxidační metody až 1600 h-1 v MTP se 48 jamkami, standardní geometrií a 3 mm orbitálním záběrem při 1400 otáčkách za minutu za použití plnicího objemu 300 μl, což je srovnatelné s běžnými STR. Pomocí vypočtené konstanty úměrnosti byl tento tým schopen vztáhnout kapacitu přenosu kyslíku získanou chemickou metodou k biologickým médiím.

Existují také metody pro stanovení kLa v malém měřítku, které poskytují údaje přímo srovnatelné s hodnotami získanými v procesních podmínkách. Například Duetz et al. a Doig et al. odhadli kLa pomocí hmotnostní bilance v podmínkách omezení kyslíku z lineárního růstu Pseudomonas putida v MTP, respektive Bacillus subtilis v prototypu miniaturního bublinkového kolonového reaktoru (MBCR). Kromě toho je pro stanovení hodnot kLa často vhodnější metoda dynamického zplyňování než sulfitová oxidační metoda, protože se obvykle provádí ve vodě . V důsledku toho je tento systém koalescenční, a i když není totožný s biologickým prostředím, je reprezentativnější pro podmínky kultivace buněk než zcela nekoalescenční podmínky metody siřičitanu sodného. Tuto techniku je však obtížné používat v MTP, protože před měřením DOT se často musí zastavit třepání, aby se dosáhlo přesných hodnot, čímž se v kritickém okamžiku změní prostředí pro přenos hmoty. Vzhledem k problémům spojeným s používáním zavedených metod pro stanovení kLa v MTP jsme nedávno vyvinuli novou metodu, která je založena na biooxidaci katecholu enzymem katechol-2,3-dioxygenázou . Tato metoda poskytla podobné hodnoty kLa ve srovnání s metodou dynamického zplyňování, a protože je rychlá a nevyžaduje žádné předpoklady o kinetice, domníváme se, že tato metoda je vhodná pro hodnocení kLa v MTP a dalších zařízeních malého rozsahu.

MTP také do jisté míry trpí právě tou vlastností, která je činí atraktivními jako vysoce výkonná zařízení – malými objemy – protože odpařování může odstranit značnou část tekutiny v jamce . Na horní část destiček lze umístit prodyšné membrány, které toto odpařování omezí, avšak pak se sníží schopnost přenosu kyslíku. Zimmermann a kol. informovali o membráně, která dosáhla mírného stupně zadržování vody a přenosu kyslíku; hodnoty kLa však byly sníženy pětinásobně, což dále prohloubilo problém nízké schopnosti přenosu kyslíku, který je vlastní protřepávaným systémům. Ačkoli odpařování je potenciálním problémem u všech MBR, zdá se, že MTP jsou k němu náchylnější, protože obvykle používají nejmenší procesní objemy. MTP s 3456 jamkami nabízejí nejvyšší propustnost ze všech dostupných miniaturních zařízení pro kultivaci buněk a bylo prokázáno, že kvantitativně udržují růst buněk vaječníků čínského křečka (CHO), ačkoli tak miniaturní procesní objem (1 – 2,2 μl) znamená, že toto zařízení pravděpodobně nebude schopno napodobit mechanismy, kterými fungují větší protřepávané nádoby; například účinky povrchového napětí by se rozšířily do celé jamky, což by výrazně omezilo schopnost míchání. Kromě toho by nebylo možné odebírat médium pro off-line odběr vzorků.

Ačkoli se MTP hojně používají v objevitelském výzkumu, trpí nedostatkem přístrojového vybavení podobně jako protřepávací baňky, což omezuje rozsah údajů, které lze shromažďovat. V poslední době však byly vyvinuty techniky pro měření pH a DOT v těchto systémech . Například Lye a jeho kolegové studovali vliv regulace pH na výtěžek biomasy a kinetiku růstu vláknité bakterie v MTP . Navzdory některým omezením, která jsou MTP při provádění kultivace buněk vlastní, bylo dosaženo pokroku v charakterizaci míchání, přenosu hmoty a přístrojového vybavení těchto nádob, což znamená, že jedinečné výhody těchto zařízení z hlediska automatizačního potenciálu a vlastní schopnosti HT vedou k jejich rostoucímu využití jako MBR v raných fázích vývoje.

Točivé baňky

Vývoj procesů malého měřítka kultivace savčích buněk se tradičně provádí v T-baňkách a bioreaktorech malého měřítka (často točivé baňky, obvykle o objemu 500 ml) . Ačkoli se zpočátku jednalo o značně nedefinovaná zařízení, byly provedeny práce na charakterizaci technického prostředí ve spinnerových baňkách, což usnadnilo jejich použití jako nádob pro zmenšení měřítka . Nicméně faktem zůstává, že jejich relativně velký objem je činí neživotaschopnými jako HT technologii, což znamená, že existuje skutečný požadavek na miniaturní bioreaktory, které by se používaly ve spojení s buňkami savců pro paralelní kultivaci buněk. Nedávno byly vyvinuty a použity spinové trubice jako nástroj pro vývoj procesů v malém měřítku pro kultivaci savčích buněk. Zdá se, že spinové trubice, které poprvé popsali De Jesus et al., mají oproti spinovým baňkám několik výhod, např. menší objem procesu. Od té doby byly komercializovány společností ExcellGene SA (Valais, Švýcarsko) pod názvem TubeSpin Satellites. Tyto kultivační nádoby se skládají z upravených 50 ml centrifugačních zkumavek umístěných na rotující orbitální třepačce umístěné v inkubátoru. Objemy kultur jsou 5 ml až 35 ml na reaktor a off-line analýza se provádí s použitím celých zkumavek na obětním základě. Tento systém nedisponuje přístrojovým vybavením potřebným k provádění plně charakterizovaných kultivací savčích buněk; je však užitečným nástrojem pro optimalizaci médií a zvyšování produktivity a dává vývoji buněčných kultur vysoce výkonný aspekt, přičemž vývojáři tohoto systému uvádějí schopnost zpracovat 1000 různých kultur týdně. Relativně velký objem a nízká rychlost odpařování zjištěná v tomto zařízení jsou výhodou při práci s pomalu rostoucími savčími buňkami, kde kultivace mohou trvat mnoho dní, nicméně je třeba zdůraznit, že v tomto systému nebyla provedena žádná inženýrská charakterizace míchání a přenosu hmoty, a proto se spinové trubice používají převážně pro screeningové aplikace.

Miniaturní míchané bioreaktorové systémy

Miniaturní míchané bioreaktory (MSBR) založené na konvenčních STR byly vyvinuty jako alternativa k protřepávaným MBR systémům pro počáteční fázi vývoje procesu a charakterizaci buněk. Tato zařízení jsou obvykle věrně modelována podle bioreaktorů v laboratorním měřítku, a proto umožňují větší možnosti monitorování a kontroly než jiné miniaturní bioreaktorové platformy. Obvykle mají střední objem mezi MTP a protřepávacími baňkami a jejich konstrukční materiály se značně liší, používají se Perspex, Pyrex, polymethylmetakrylát (PMMA) a nerezová ocel. Obrázek 2 znázorňuje náš prototyp MSBR o pracovním objemu 18 ml, který je vyroben z nerezové oceli a Pyrexu a vybaven optickými sondami pro měření pH a DOT online. Tato nádoba byla charakterizována z hlediska účinnosti míchání a schopnosti přenosu kyslíku . Bylo prokázáno, že je schopna napodobit konvenční STR při kultivaci buněk s různou reologií, citlivostí na střih a potřebou kyslíku (tj. vláknité bakterie Saccharopolyspora erythraea produkující erytromycin a rekombinantní E. coli produkující plasmidovou DNA, resp. fragment protilátky ). Zařízení mohlo úspěšně pěstovat řadu organismů díky relativně vysokým hodnotám kLa (480 h-1 při 7000 otáčkách za minutu při použití metody dynamického zplyňování) a krátké době míchání (4,8 s při 7000 otáčkách za minutu – více než dvakrát rychleji než 7l nádoba na základě stejného měrného příkonu). Vysoká rychlost přenosu kyslíku podporovala růst rychle dýchajících organismů (E. coli), zatímco účinné míchání umožňovalo nádobě udržovat homogenní podmínky při práci s viskózními fermentačními bujóny – často se vyskytujícími při pěstování vláknitých organismů. Rychlost míchání bylo také možné velmi přísně regulovat, což pomohlo zabránit poškození myceliálních organismů citlivých na smyk nadměrným příkonem. Kromě toho byla měřena spotřeba energie plynem v nádobě, což vedlo k výpočtu výkonového čísla oběžného kola v širokém rozsahu provozních podmínek a umožnilo tak spolehlivě odstupňovat kultivace buněk na základě stejného měrného příkonu . Ačkoli je tento MSBR prototypem, bylo by možné takové zařízení multiplexovat, aby se dosáhlo vyššího výkonu.

Zajištěním míchání a aktivního provzdušňování nádoby se u jiných MSBR v literatuře uvádějí rychlosti přenosu hmoty blízké běžnému STR v laboratorním měřítku. Například Lamping a kol. uvedli hodnoty kLa 360 h-1 při 1 VVM a 3000 otáčkách za minutu pomocí metody dynamického zplyňování v prototypu MSBR podobné konstrukce, jaká je znázorněna na obrázku 2. Kromě toho stejný tým úspěšně modeloval přenos kyslíku v prototypu miniaturního bioreaktoru pomocí analýzy výpočetní dynamiky tekutin (CFD), která byla založena na příslušných technických parametrech rychlostního pole, velikosti bublin, zadržování plynu a rychlosti rozptylu energie uvnitř MBR .

Puskeiler a kol. nedávno uvedli hodnoty kLa přes 700 h-1 (objem 12 ml) a až 1600 h-1 (objem 8 ml) pro MSBR míchaný při 2300 ot/min. Tento systém využívá nového oběžného kola indukujícího plyn, což vede k velmi vysoké schopnosti přenosu kyslíku. V této studii byla k měření kLa použita metoda dynamického odplyňování, ačkoli byly použity nekoalescenční podmínky, což ztěžuje přímé srovnání s hodnotami z médií pro kultivaci buněk nebo koalescenčních kapalin. Ve stejném článku byla popsána schopnost systému udržet kultivaci buněk v krmné dávce, což ilustruje potenciál miniaturních bioreaktorových technologií pro podporu takových průmyslově důležitých strategií. Kromě toho byla prokázána proveditelnost online monitorování a řízení. Zařízení popsané v této zprávě, navržené ve spolupráci s firmou H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Německo), je integrovaná jednotka („bioreaktorový blok“) schopná podporovat až 48 buněčných kultivací současně. Integrovaný systém manipulace s kapalinami umožnil měření pH na lince s frekvencí jedné hodiny dávkováním vzorků o objemu 20 μl do komerčně dostupných MTP obsahujících připevněné pH náplasti. O osm minut později pak stejný systém pro odběr vzorků kapalin upravil pH pomocí 4 M NaOH. I když je použití automatické manipulace s kapalinou pro kontrolu pH elegantním řešením, autoři připouštějí, že může být nepraktické, pokud se používá u citlivých organismů, které vyžadují citlivější úpravu pH. Ve zprávě se však uvádí, že ve spolupráci s průmyslovými partnery se vyvíjí zdokonalený monitorovací systém, který umožní častější monitorování, což může zvýšit počet souběžných fermentací, které je možné účinně monitorovat. V systému bylo měřeno DOT pomocí prototypového senzorového bloku s optickými sondami, i když současně bylo monitorováno pouze 8 reaktorů ze 48 kultivačních nádob . Takové zařízení lze také integrovat se standardním robotickým vybavením k provádění úkolů manipulace s kapalinou, jako je inokulace, krmení a odběr vzorků .

S využitím jiného přístupu vyvinula společnost Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, USA) konstrukci MSBR s více nádobami nazvanou Cellstation® . Tato MBR využívá optickou technologii, která umožňuje on-line monitorování in situ až 12 paralelních kultivací pro pH , DOT a optickou hustotu (OD), a míchání zajišťují dvě lopatková oběžná kola. Každá nádoba má pracovní objem až 35 ml a je připojena ke karuselu, který se otáčí a umožňuje postupné vzorkování a monitorování všech nádob. Systém optických senzorů byl ověřen prokázáním konzistence senzorů pH a DO po dobu 70 hodin v procesu kultivace savčích buněk. Kromě toho Raova výzkumná skupina na Marylandské univerzitě, která má se společností úzké vazby, nedávno zveřejnila podrobnosti o dvou prototypech 24jamkových systémů MSBR, které dále zvyšují propustnost této technologie .

Souběžně s tímto vývojem MSBR představila společnost Dasgip AG (Jülich, Německo) baňku Stirrer-Pro Flask, součást své řady pro kultivaci buněk Fedbatch-Pro® , která se skládá až z 16 kultivačních nádob (pracovní objem 200-275 ml) a nabízí mícháním řízený přenos kyslíku a možnost podávání dávek. pH a DOT lze monitorovat pomocí standardních sterilizovatelných sond a řídit nezávisle pro každou nádobu automatickým přidáváním kyselé/ zásadité kapaliny, resp. změnou rychlosti proudění vzduchu/agitace. Přídavek substrátu lze propojit se spouštěcími body DOT nebo pH, což umožňuje plně automatizované dávkování. Kombinace mechanického míchání (10 – 1000 ot./min.) a přeplňování plynem naznačuje, že tento systém je schopen podporovat rychle rostoucí bakteriální kultury s vysokou hustotou buněk, a proto by byl užitečný při vývoji takových bioprocesů. Použitý pracovní objem je však ve srovnání s většinou ostatních diskutovaných systémů poměrně velký a nastavení je komplikováno přítomností velkého počtu zkumavek a vodičů pro přidávání a měření. Byla také vyvinuta varianta tohoto systému obsahující až 16 protřepávacích baněk vybavených pH sondami, která umožňuje přerušované podávání a paralelní kontrolu pH .

Jako menší alternativu k laboratorním STR schopným paralelního provozu, jako je systém Sixfors® vyvinutý společností Infors AG (Bottmingen, Švýcarsko), vyvinuli a charakterizovali výzkumníci z University College London ve spolupráci s bioreaktorovou společností BioXplore skupiny HEL Group (Barnet, Spojené království) systém MBR se 4 až 16 komorami s plně integrovanou a automatizovanou kontrolou DOT a pH. Ačkoli každá nádoba má maximální pracovní objem 100 ml, čímž se blíží horní hranici technologie MSBR, vývoj samostatného softwaru pro monitorování těchto bioreaktorů je krokem k tomu, aby MBR měly stejný stupeň kontroly a automatizace jako konvenční bioreaktory.

Miniaturní reaktory s bublinkovou kolonou

Bublinkové kolony využívají místo míchání jako prostředek podpory míchání a přenosu hmoty kyslíku pro kultivaci buněk rozprašování plynu. Jako alternativu k míchaným nebo protřepávaným zařízením jsme vyvinuli miniaturní reaktor s bublinkovou kolonou (MBCR), který je založen na MTP s porézními membránami (fritami) působícími jako celá základna každé jednotlivé jamky . Vzduch prostupuje fritou a proudí vzhůru každou jamkou, čímž poskytuje kyslík pro každou rostoucí kulturu. Za předpokladu, že každá frita je vyrobena podle vysoké specifikace a má stejný stupeň pórovitosti, je průtok do každé kolony stejný a lze jej vypočítat. To zabraňuje tomu, aby rozdíly v průtoku vzduchu uměle ovlivňovaly výsledky.

Doig et al. podrobně popsali konstrukci a charakterizaci prototypu MBCR s 12 jamkami, který je schopen podporovat aerobní kultivaci kultur Bacillus subtilis, přičemž každá kolona má pracovní objem 2 ml. byly zaznamenány hodnoty kLa až 220 h-1 při použití metody dynamického zplyňování při povrchové rychlosti plynu 0,02 ms-1. Jednou z výhod tohoto typu zařízení je, že na rozdíl od MTP probíhá provzdušňování přímým rozprašováním. To má za následek zvýšení schopnosti systému přenášet hmotnost kyslíku v porovnání s MTP, protože rozprašování zvětšuje plochu povrchu, která je k dispozici pro přenos hmoty plyn-kapalina, v porovnání s pouhým povrchovým provzdušňováním. Ačkoli některé údaje kLa pro MTP podrobně popsané v tomto přehledu jsou podstatně vyšší než naměřené hodnoty MBCR, je třeba zdůraznit, že mnoho hodnot MTP bylo získáno za poměrně umělých podmínek určených k maximalizaci přenosu kyslíku, zatímco výše uvedené hodnoty kLa pro MBCR by byly reprodukovatelné za podmínek kultivace buněk.

Kromě velké plochy povrchu, která je k dispozici pro přenos kyslíku, znamená absence míchání v MBCR, že příkon, a tedy i přenos kyslíku, je snazší modelovat než v STR, protože je třeba brát v úvahu méně parametrů, přičemž rychlost povrchového plynu a distribuce velikosti bublin jsou klíčovými parametry při rozšiřování/snižování měřítka bublinkových kolon . Kromě toho je zařízení stacionární, na rozdíl od protřepávaného, což umožňuje snadnější instrumentaci, protože míchání většiny systémů MTP musí být zastaveno před měřením v destičkové čtečce. Mechanická jednoduchost spolu s potenciálně vysokým přenosem kyslíku a snadným odběrem vzorků činí MBCR vhodnými pro paralelní kultivaci buněk. Může to být mimo jiné pro účely zlepšování média nebo kmene a pro vývoj procesů v rané fázi. MBCR by také mohly být použity k napodobení a předvídání výkonu velkých reaktorů. V tomto ohledu jsme nedávno prokázali dobrou korelaci rychlosti přenosu kyslíku s objemovou spotřebou energie (P/V) pro miniaturní (2 ml) a laboratorní (100 ml) bublinkové kolony využívající plynové difuzory se stejnou velikostí pórů, která umožňuje předpovídat kLa jako funkci P/V . Ve stejné práci jsme také prokázali srovnatelný výkon kultivace buněk pomocí MBCR oproti STR v laboratorním měřítku na základě stejných hodnot kLa. Tyto výsledky naznačují potenciál MBCR jako zařízení pro zmenšení měřítka. Tento prototyp zařízení MBCR nebyl vybaven přístroji, ačkoli v následné práci jsme toto zařízení vybavili optickými fluorescenčními plaketami a použili je k měření DOT během kultivace buněk. Teplotu bylo možné regulovat propojením zařízení s vodní lázní a cirkulací vody s regulovanou teplotou v uzavřeném prostoru mezi sloupy (viz obrázek 3). Podobné MBCR již dříve vyvinuli jiní; tyto nádoby však používají objemy cca 200 ml, a jsou tedy o dva řády větší než zařízení popsané Doigem a spol. , což omezuje dosažitelný stupeň paralelního provozu.

Jiná miniaturní zařízení

S využitím konceptu integrované senzorové desky vyvinula společnost MicroReactor Technologies (Mountain View, Kalifornie, USA) hybridní systém kultivace buněk založený na protřepávaném 24jamkovém MTP s přepážkou a konfigurací jamek, která umožňuje rovnoměrný přenos tepla po celé desce. Navrhovaný pracovní objem každé jamky se pohybuje od 3 do 5 ml a vzduch se do kapalné fáze přivádí rozprašováním přes sintry umístěné ve spodní části každé jamky, což zvyšuje schopnost přenosu kyslíku ve srovnání s podobně konstruovanými protřepávanými systémy. Toto nedávno komercializované kultivační zařízení (licencované v Evropě společností Applikon Biotechnology AB, Nizozemsko) je vybaveno přístroji používajícími sondy s optickými vlákny, které monitorují DOT a pH online ve všech jamkách současně. Zařízení rovněž umožňuje nezávislé řízení teploty, DOT, pH (pomocí přeplňování plynem) a průtoku vzduchu pro všech 24 jamek. Zařízení překonává jeden ze základních problémů při řešení HT zařízení na bázi MTP – totiž jak umístit přístrojové vybavení do všech jamek obsažených v destičce – tím, že všechny senzorové náplasti připevní ke dnu každé jamky a poté celou destičku umístí na třepací inkubátorovou platformu, která má integrované přístrojové obvody, čímž umožňuje nezávislé monitorování každé jamky. Hlavní využití bude pravděpodobně v raných fázích vývoje procesu (např. výběr kmene a optimalizace média). Zatím nejsou veřejně dostupné žádné údaje o technické charakterizaci míchání a přenosu kyslíku a srovnání kultivační výkonnosti s údaji z bioreaktorů v laboratorním měřítku.

V poslední době došlo k vývoji zaměřenému na zmenšení měřítka MBR na submililitrové objemy procesu. Ačkoli tyto miniaturní systémy nabízejí největší prostor pro použití HT, existuje praktické omezení, jak malé mohou být kultivační objemy. U zařízení, která využívají příliš malý procesní objem, může být neproveditelné provádět kultivace s dostatečným monitorováním a odběrem vzorků. Ačkoli OD, DOT a pH je možné monitorovat online, jiné kritické parametry, jako je koncentrace substrátu a výtěžnost produktu, často monitorovány nejsou; tento problém však může být u některých procesů možné obejít začleněním markerů, jako je zelený fluorescenční protein, do produktu . Při práci s dlouhými procesy kultivace bakterií a savčích buněk se může v tak extrémně malých kultivačních objemech stát významným problémem odpařování; vzhledem k extrémně malému objemu procesu by také bylo technicky náročné přesně kontrolovat pH přidáváním kapaliny. Nicméně tento rozsah provozu představuje radikální pokrok v konstrukci MBR a významně zvyšuje jejich potenciální využití pro HT paralelní kultivaci buněk.

V tomto ohledu Jensenova výzkumná skupina na MIT vyvinula submililitrový prototyp MBR, který byl upraven a rozšířen na multiplexní systém schopný provádět osm instrumentovaných mikrobuněčných kultivací s pracovními objemy 150 μl . Pomocí standardních mikrofabrikačních metod jsou kultivační jamky z PMMA a poly(dimethylsiloxanu) (PDMS) imobilizovány na hliníkové základně obsahující všechny senzorové prvky a přenos kyslíku je umožněn difuzí přes plynopropustnou membránu a magnetická míchadla schopná řídit míchání individuálně pro každý reaktor. DOT, pH a OD lze sledovat online pomocí optických sond. Skupina uvedla, že zařízení dokáže udržet dávkovou kultivaci E. coli, přesto DOT po 2 až 3 hodinách klesl na 0 %, což pravděpodobně způsobilo omezení přístupu kyslíku . To je pravděpodobné vzhledem k tomu, že maximální hodnota kLa naměřená v tomto MBR byla pouze 75 h-1. Nicméně autoři prokázali, že růstové chování bylo srovnatelné s chováním získaným při použití řady větších zařízení pro kultivaci buněk . Stejná výzkumná skupina také podrobně analyzovala genovou expresi E. coli pěstované v 50 μl MBR pomocí DNA microarray . Tato práce představuje skutečný pokrok ve vývoji MBR, protože nejenže ukazuje důkaz principu, ale také umožňuje vysoce paralelní analýzu genové exprese a mohla by být využita k lepšímu pochopení fyziologie buněk během kultivace pomocí přístupu na úrovni systému . Maharbiz a kol. informovali o vývoji zařízení založeného na uspořádání kombinujícím reaktory s mikrobuňkami a křemíkovou mikrofabrikační technologií, které je schopno podporovat kultivaci E. coli v osmi jamkách o objemu 250 μl současně. Podobně jako u reaktoru MIT (popsaného výše) byly jamky umístěny na základní desce obsahující senzory pro měření pH a OD (DOT nebyl měřen, ale autoři uvádějí, že by to bylo proveditelné). Kyslík byl generován elektrochemicky v každé kultuře a míchání zajišťovala kulička z nerezové oceli, která míchala kulturu, rozptylovala kyslík a rozbíjela povrchovou pěnu. Tento výzkumný tým však neposkytl žádné srovnávací údaje ve stolním měřítku, na jejichž základě by bylo možné určit, zda by bylo možné z takového zařízení rozšířit měřítko.

Další komerční systém pro HT provoz vyvinula společnost Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, USA). Toto zařízení pro kultivaci buněk (nazvané SimCell®) je schopno provozovat a nezávisle řídit až 1500 kultur, což umožňuje používat metody plně faktorového experimentálního návrhu pro optimalizaci procesu . Toto zařízení „reaktor na čipu“ je založeno na mikrofluidní konstrukci s membránou propouštějící plyn, která umožňuje přenos kyslíku a míchání je zajištěno otáčením čipů soustavy mikrobioreaktorů v inkubátorech s řízeným prostředím za použití zvlhčeného vzduchu, aby se minimalizovalo odpařování. Tento systém může být vysoce automatizovaný a je integrován s robotem pro přenos destiček z inkubátoru do snímací stanice pro měření pH, DOT a hustoty buněk a s fluidní stanicí, kde lze přidávat média pro provoz s krmnými dávkami a kyseliny/ zásady pro kontrolu pH. Objemy v každém reaktoru se pohybují od cca 300 μl do cca 700 μl v závislosti na aplikaci (mikrobiální nebo savčí buňky) a každý reaktor lze provozovat v režimu dávkování, podávání nebo perfuze. Bylo prokázáno, že zařízení podporuje kultivaci E. coli a kvasinek a poskytuje kinetiku růstu srovnatelnou s kinetikou získanou pomocí konvenčních STR. Společnost také popsala růst buněk CHO bez omezení kyslíku při vysoké hustotě buněk a použila simulace výpočetní dynamiky tekutin (CFD), aby ukázala, jak bylo znovu vytvořeno fyzikální prostředí pozorované ve velkých bioreaktorech se šikmými lopatkami. kLa v systému byla modelována pomocí CFD a odhadnuta na 60 až 500 h-1, což jsou hodnoty podobné hodnotám zjištěným v protřepávacích baňkách a suboptimálních STR.

MBR jako nástroj pro snižování měřítka

Je třeba poznamenat, že ne všechny miniaturní systémy pro kultivaci buněk jsou určeny pro zvyšování/snižování měřítka stávajících bioprocesů; v tomto přehledu bylo zmíněno, jak lze tato zařízení použít pro mnoho aplikací, jako je hodnocení raných stadií rekombinantů/divokých organismů, zlepšování kmenů a vývoj růstových médií. Miniaturní systémy používané v pozdějších fázích vývoje procesu, např. pro optimalizaci provozu a kultivačních podmínek, by však měly být škálovatelné. Z tohoto důvodu je nezbytné, aby byly prozkoumány zavedené metody, které se v průmyslu často používají pro škálování procesů od stolních přístrojů až po výrobní nádoby, aby se zjistilo, zda je lze využít pro škálování z MBR. Mezi tyto osvědčené metody patří škálování na základě výkonu plynů na jednotku objemu, rychlosti hrotu míchadla, konstantního DOT, kapacity přenosu hmoty kyslíku (kLa) nebo doby míchání. Přesto neexistuje přístup „jedna velikost pro všechny“, a proto je třeba zdůraznit, že žádný jednotný základ pro ekvivalenci nelze univerzálně použít pro všechny MBR. Žádný ze systémů podrobně popsaných v tomto přehledu nemohl využít všechny výše popsané zavedené metodiky zvětšování/zmenšování. Například u protřepávaných systémů je ve srovnání s konvenčními STR obtížné dosáhnout konstantní hodnoty DOT, protože absence mechanického míchání (a rozprašování – v případě systémů na bázi MTP) znamená, že kontrola hladin DOT nad kritickou úrovní je v těchto zařízeních technicky velmi náročná. Tato konkrétní vlastnost sama o sobě nepředstavuje problém, pokud kultivované buňky rostou dostatečně pomalu (buď přirozeně, nebo díky použití slabého růstového média a/nebo provozu při teplotě, která neumožňuje maximální rychlost růstu), ale omezuje použití těchto systémů k provádění mnoha procesů s vysokou hustotou buněk zahrnujících rychle rostoucí mikroorganismy s vysokou potřebou kyslíku.

Ukázku toho, které kritérium zmenšení by mělo být použito pro konkrétní bioproces (a tedy i ukázku toho, která miniaturizační platforma je pro tento proces vhodnější), lze získat zkoumáním vlastností buněk a procesních podmínek daného bioprocesu. U rychle rostoucích organismů, jako je E. coli nebo Bacillus subtilis, je obvykle limitujícím faktorem přenos kyslíku, zatímco smykové napětí pravděpodobně nepředstavuje zásadní problém; proto lze zmenšení takové buněčné kultivace navrhnout na základě stejného specifického příkonu nebo na základě stejného kLa. Podmínkou volby stejného kLa je však schopnost přesně odhadnout příkon miniaturního bioreaktoru. Práce provedená na UCL v 10 ml MBR potvrzuje dřívější práci Bujalského a kol., která ukázala, že počet výkonů oběžného kola klesá současně s průměrem nádoby. Proto je důležité nepoužívat pro odhad příkonu v MBR čísla výkonu oběžného kola v konvenčním měřítku, protože by to mohlo vést k omezení přívodu kyslíku rychle reagujícím mikrobům nadhodnocením výkonu přenášeného do systému.

Zvláštní problém představuje růst vláknitých organismů vzhledem k jejich složité morfologii. Fermentační bujóny obsahující takové organismy mají poměrně vysokou viskozitu a vyžadují dodatečný příkon, aby se udrželo odpovídající míchání a přenos hmoty. Kromě toho jsou vláknité organismy mnohem větší než jednobuněčné bakterie a mohou být náchylnější k poškození střihem. Například Heydarian a kol. uvedli, že průměrná délka hyf bakterie Saccharopolyspora erythraea produkující erytromycin přesáhla Kolmogorovovu mikroměřítko turbulence ve standardním bioreaktoru o objemu 7 l ve velkém rozsahu provozních podmínek . V případě S. erythraea bylo prokázáno, že pokud je mycelium nadměrně střiženo, což má za následek příliš krátkou délku hyf, může být ovlivněna tvorba produktu erytromycinu . Z tohoto důvodu lze doporučit, aby se při použití vláknitých organismů zvolila jako základ pro snižování měřítka rychlost špičky. Zatímco mechanismy, kterými se řídí tvorba pelet ve vláknitých kulturách, nejsou dobře známy, Vecht a spol. uvedli korelaci mezi snižováním OTR a zmenšováním střední velikosti pelet u Streptomyces tendae . Došli k závěru, že tvorba pelet v tomto organismu je způsobena především hydrofobními interakcemi řízenými DOT. Vzhledem ke škodlivému vlivu, který může mít tvorba pelet na produkci sekundárních metabolitů u mnoha vláknitých organismů – v důsledku inhibice příjmu kyslíku do středu pelet rostoucí s průměrem pelet – je zřejmé, že pro snížení rozsahu procesů kultivace vláknitých buněk musí MBR udržovat úroveň rozpuštěného kyslíku, která se vyskytuje ve velkém rozsahu procesu, na němž je snížení rozsahu založeno, aby se zachoval výtěžek produktu. Rovnovážný kLa je obtížné použít pro snížení měřítka, protože se obvykle počítá v modelových systémech, které se jen málo podobají skutečným fermentačním bujónům. Kromě toho je kLa ovlivněna změnami koalescence a reologie kultivačního bujónu v průběhu kultivačního procesu, což jsou změny, které se velmi obtížně měří a zohledňují. Klíčové při výběru základu pro zmenšení bioreaktoru je nevystavovat buňky zátěži nad rámec zátěže, která se vyskytuje ve velkém měřítku.

Z miniaturních zařízení diskutovaných v tomto přehledu je zřejmé, že některá se snaží svou geometrií kopírovat bioreaktory ve velkém měřítku. Například většina MSBR a MBCR jsou geometrické faksimile velkorozměrových bioreaktorů. Zachování geometrické podobnosti má výhody pro efektivní porovnání měřítek, protože umožňuje zachovat platnost některých klíčových předpokladů; např. zachování stejného poměru stran pomáhá předpovídat hydrostatický tlak, a tedy rozpustnost kyslíku při různých měřítkách provozu. To poskytuje takovým zařízením výhodu, protože jejich mechanismy pro dosažení přenosu a míchání kyslíku a pro výpočet příkonu mohou být založeny na stejných principech stanovených ve velkém měřítku. Dynamika kapalin bude podobná, i když je důležité poznamenat, že některá bezrozměrná čísla popisující dynamiku kapalin, například Reynoldsovo číslo v míchacích nádobách, mají zřejmě v tak malých měřítkách menší vliv . Zásadnější je otázka, jak účinné mohou být MBR, když dosáhnou tak malých rozměrů, že se jejich vlastnosti proudění a mechanismy přenosu hmoty a míchání liší od těch, které se vyskytují ve velkých bioreaktorech, které se snaží napodobit. MTP jsou v tomto ohledu obzvláště zranitelné, protože nedostatek mechanického míchání znamená, že účinky povrchového napětí jsou důležitější než v MSBR, kde oběžná kola mohou tento účinek snížit a pomoci udržet účinné míchání kapaliny. Kromě toho při použití extrémních podmínek u MTP (pokud jde o frekvenci třepání a objem náplně) hrozí nebezpečí, že veškerá procesní kapalina vytvoří tenký film podél vnitřního povrchu vrtu, čímž se výrazně omezí míchání a zhorší se škodlivý účinek povrchového napětí. Rozdílné režimy proudění v MBR způsobené různými způsoby míchání mohou mít vliv na schopnost těchto systémů reprodukovatelně provádět kultivaci buněk; pokud se podmínky v malém a velkém měřítku liší, pokud jde o míchání a přenos hmoty plyn-kapalina, může to vést k problémům, např. k výběru klonů nevhodných pro produkci nebo k rozdílům v kvalitě produktů, zejména u rekombinantních proteinů. Na druhou stranu práce Michelettiho a kol. naznačuje, že převod z protřepávaných systémů na míchané je proveditelný, pokud jsou pečlivě zvolena kritéria pro rozšíření. Pomocí nedávno zavedené korelace pro předpovědi kLa v MTP se jim podařilo úspěšně škálovat kultivaci E. coli s nadměrnou expresí enzymu transketolázy ze systému mikrobuněk (objem 1 ml) do 1,4 l STR na základě konstantní kLa. Stejná skupina také poskytuje první údaje o uspokojivém rozšíření procesu kultivace savčích buněk pomocí konstantní střední rychlosti rozptylu energie .

Automatizace MBR

Automatizace MBR je klíčem k rozšíření možností HT. Několik nedávno vyvinutých miniaturních systémů využívá jako výchozí bod upravený MTP (např. a Applikon MicroReactor®). Tyto systémy se v současné době jeví jako velmi slibné díky snadné integraci se stávajícími robotickými automatizačními platformami. MTP, na nichž jsou tyto systémy navrženy, jsou založeny na standardním půdorysu, jsou mechanicky jednoduché a samotná standardizace jejich konstrukce je předurčuje k zabudování do automatizovaných robotických platforem, které skutečně přenášejí tyto technologie do oblasti HT a propůjčují jim schopnost provádět stovky buněčných kultivací paralelně při použití půdorysu, který není o mnoho větší než půdorys běžného bioreaktoru v pilotním měřítku. Alternativou je vývoj miniaturního bioreaktorového systému, který je sám o sobě automatizovatelný. Příkladem tohoto přístupu jsou technologie, které vyvinula Weuster-Botzova skupina ve spolupráci s firmami H + P Labortechnik a Bioprocessors Corp. Taková zařízení nabízejí určitý stupeň schopnosti HT a také sofistikovanou vestavěnou robotiku v případě systému SimCell® společnosti Bioprocessors Corp.

Robotická zařízení používaná ve spojení s MBR jsou obvykle vybavena vícenásobnými pipetovacími hlavami namontovanými na ramenech, která se mohou pohybovat ve třech rozměrech po celém pracovním prostoru. Pipetovací hlavy si mohou poradit i s různými geometriemi MBR a samostatná robotická ramena mohou vybírat a umisťovat pomocná zařízení kdekoli v pracovním prostoru. Tato možnost výběru a umístění znamená, že jeden robot může inokulovat, kontrolovat pH, odebírat vzorky a doplňovat MBR, což nabízí skutečně integrované řešení. Kromě toho mohou roboty propojit platformy pro kultivaci buněk s analytickými přístroji (např. systémy HPLC) a provádět komplexní testy, jako je ELISA pro protilátkové produkty s využitím vzorků v reálném čase – testy, které využívají schopnosti robota provést tisíce operací s kapalinami v krátkém časovém úseku. Aseptické podmínky kultivace buněk lze zachovat umístěním robota ve speciálně zkonstruované skříni biologické bezpečnosti

.