A lateral flow strip based on gold nanoparticles to detect 6-monoacetylmorphine in oral fluid

Introductie

Opioïdenmisbruik is de afgelopen jaren dramatisch gestegen en is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Volgens het World Drug Report 2017, gepubliceerd door het Bureau voor Drugs en Criminaliteit van de Verenigde Naties, is het gebruik van opiaten en receptplichtige opioïden misschien niet zo wijdverspreid als cannabis, maar opioïden blijven belangrijke drugs met potentiële schade en gevolgen voor de gezondheid . Daarom is de gemakkelijke en snelle opsporing van opioïden een dringende noodzaak.

Illegaal heroïnemisbruik is een van de meest voorkomende vormen van opioïdenverslaving. Heroïne (diacetylmorfine, diamorfine of Diagesil®) is een halfsynthetisch morfine-derivaat en een krachtig opioïd pijnstillend middel. Het metabolisme van heroïne wordt gevisualiseerd in figuur 1 . Heroïne hydrolyseert snel tot 6-monoacetylmorfine (6-MAM) en uiteindelijk tot morfine. Aangezien heroïne na toediening snel hydrolyseert, worden de metabolieten ervan gewoonlijk gebruikt om het gebruik te bevestigen. Bovendien is 6-MAM de enige specifieke indicator voor recent heroïnegebruik in vergelijking met morfine, en het heeft grote belangstelling gewekt in de onderzoeksgemeenschap.

Er zijn verschillende methoden beschreven om 6-MAM te detecteren, en deze kunnen in de volgende categorieën worden onderverdeeld: (1) chromatografische analyse, waaronder gaschromatografie en hogedrukvloeistofchromatografie ; (2) spectroscopische analyse, zoals Ramen-spectroscopie, infraroodspectroscopie, chemiluminescentie , enz.; (3) capillaire elektroforese ; en (4) immunoassaymethoden (antigeen-antilichaam) . Complexe instrumentatietechnieken leggen een enorme druk op het basisonderzoek naar geneesmiddelen, omdat geavanceerde apparatuur en professionele operators nodig zijn. Het laboratorium is soms gesloten of ver weg. Zelfs politiebureaus kunnen deze complexe en dure apparatuur niet huisvesten. Een politieambtenaar moet echter onmiddellijk oordelen of een verdacht materiaal heroïne bevat of niet en moet snel reageren. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van specifieke, betrouwbare en eenvoudige methoden om illegale drugs in biologische monsters op te sporen. Van de methoden voor snelle detectie zijn op colloïdaal goud nanodeeltje (AuNP) gebaseerde laterale flowstrips (LFS’s) op grote schaal toegepast voor snelle screening vanwege de grootte-afhankelijke en afstandsafhankelijke optische eigenschap van AuNP’s, met het eerste rapport van Mirkin en medewerkers. Het principe van semi-kwantitatieve lateral flow assays is dat de rode kleur van de AuNPs met het blote oog kan worden waargenomen van de antigeen-antilichaam combinatie in enkele minuten . Er zijn verschillende commerciële testkits voor de opsporing van heroïnemisbruik verkrijgbaar, onder meer van de bedrijven NovaBios en Wondfo. De meeste kits voor heroïnescreening meten echter alleen morfine maar niet 6-MAM, omdat 6-MAM en morfine moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn. Morfine kan gemetaboliseerd zijn uit andere drugs of kan zijn voorgeschreven. De 6-MAM is uniek herleidbaar tot heroïne.

Monsters omvatten bloed, plasma, urine, haar, orale vloeistoffen, alsmede in adem, zweet, moedermelk, tanden, enz. De meest gebruikte monsters voor het testen van illegale heroïne zijn bloed, urine en orale vloeistoffen. Van deze monsters is de bloedtest het nauwkeurigst en betrouwbaarst, maar hij is ook invasief. Urineonderzoek is het gemakkelijkst en wordt veel gebruikt voor druggebruikscreening. Orale vloeistoffen worden steeds vaker gebruikt voor tests op de plaats van verzorging – ze zijn gemakkelijk in het openbaar te verzamelen. Orale vloeistoffen zijn echter zeer viskeus en bevatten lage concentraties van het doelwit; daarom wordt voor de meeste tests urine gebruikt voor 6-MAM-tests. Bij de ontwikkeling van orale vloeistoftests zal zich hetzelfde probleem voordoen bij het verzamelen van monsters en het verbeteren van de gevoeligheid. Uit een eerdere studie is gebleken dat 6-MAM vaak in orale vloeistof wordt gedetecteerd. De detectiestandaard van LFSs in orale vloeistof 6-MAM is 4 ng ml-1 . Hier ontwikkelden we een laterale flowtest voor heroïne in orale vloeistofmonsters.

We onderzochten AuNPs als antilichaamlabels in een laterale flowassay voor snelle en gevoelige detectie van 6-MAM via een colorimetrisch signaal. Eerst hebben we het 6-MAM gesynthetiseerd en vervolgens geconjugeerd aan boviene serum albumine (BSA) om het te kunnen coaten op een T-lijn. Bovendien werden, om de moeilijkheden bij de behandeling van monsters van orale vloeistoffen te overwinnen, de types nitrocellulosemembranen (NC), de oplossingsformule van het monsterkussen en het sponsadsorptiekussen gekozen om de beste voorwaarden voor LFS’s voor orale vloeistoffen te zoeken. Tenslotte werd de 6-MAM LFS gevalideerd en werd aangetoond dat deze een uitstekende gevoeligheid en specificiteit heeft.

Experimenteel

2.1. Materialen

De antilichamen tegen 6-MAM werden geleverd door Bioventure (Shanghai). BSA en polyvinylpyrrolidon (PVP) werden gekocht bij Sigma (Barcelona, Spanje). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) en STANDAPOL ES-1 (S7) werden aangekocht bij BASF (Duitsland). Gedestilleerd water (weerstand 18,2 MΩ cm-1) werd gemaakt met een RephiLe PURIST UV Ultrapure water systeem (China). Het Reel-dispersiesysteem was van Doyesgo (China). De Vion IMS Q-Tof massaspectrometer was van Waters (USA). Alle standaardmaterialen zoals 6-MAM en morfine werden verkregen van de National Institutes for Food and Drug Control (China). De microscoop was van Motic AE2000 (Xiamen, China). Alle andere chemische en immunologische reagentia die hier niet zijn gespecificeerd, waren standaard commerciële producten van analytische/reagenskwaliteit.

2.2. De onderdelen van de lateral flow strip

De LFS’s bestaan uit een plastic drager, een spons-adsorberende strip (sponge pad), een sample pad, een geconjugeerd pad, NC-membranen en een absorberende pad. De sponsadsorberende strip is speciaal ontworpen voor orale vloeistofafname en transporteert orale vloeistof snel naar het monsterkussen. Het monsterkussen bevat een buffersysteem en enkele oppervlakteactieve stoffen. De antilichaam-AuNP-conjugaten werden op het conjugaatkussen gespoten om met het monster te reageren en van het kussen los te komen en het NC-membraan binnen te dringen dat gecoat is met 6-MAM-BSA op de T-lijn en geit anti-rabbit antilichamen op de C-lijn. Het absorberende kompres is een filtreerpapier dat zich aan het einde van de strook bevindt; het houdt de capillaire stroom in stand. De LFS hoeft alleen in de mond te worden geplaatst of in een beker met orale vloeistofmonsters te worden geplaatst. Een schematische weergave van de LFS is te zien in figuur 2. Een schematische weergave van de LFS voor 6-MAM-detectie is te zien in figuur 3.

2.3. Synthese van 6-monoacetylmorfine-boviene serumalbumineconjugaat

De 6-MAM werd bereid zoals eerder in onderzoek is beschreven. In het kort, werd morfine eerst geproduceerd door heroïne alkali hydrolyse. Vervolgens werd een N-hydroxysuccinimide (NHS)-estergroep aan het 6-MAM-molecuul toegevoegd om het aan de dragereiwitten te conjugeren (figuur 4). Het geactiveerde 6-MAM werd verzekerd door een Waters® Vion IMS Q-Tof massaspectrometer. Vervolgens werd de synthese uitgevoerd zoals beschreven (figuur 5) met enkele wijzigingen. Eerst werd 80 mg BSA in 6 ml 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,5) tot 0 °C afgekoeld. Vervolgens werd 20 mg geactiveerd 6-MAM in 1 ml watervrije dimethylformamide (DMF) druppelsgewijs toegevoegd bij 0 °C. Het mengsel werd verwarmd tot kamertemperatuur en een nacht lang geroerd. Het resulterende 6-MAM-BSA-conjugaat werd gedialyseerd tegen 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,5) met zes bufferwisselingen (telkens ten minste 6 uur bij 4 °C).

2.4. Bereiding van gouden nanodeeltjes-antilichaamconjugaten

De 20 nm AuNPs werden bereid via een citraatreductiemethode . Hier werd 2 ml van 1% HAuCl4 oplossing onder krachtig roeren toegevoegd aan 100 ml kokend water, waarna onmiddellijk 2 ml van 1% natriumcitraatoplossing werd toegevoegd. Wanneer de oplossing rood kleurde, werd ze nog eens 15 minuten gekookt. De oplossing werd afgekoeld tot kamertemperatuur en bewaard bij 4°C voor verder gebruik.

Na aanpassing van de pH-waarde van de AuNPs oplossing tot 9,0 door 0,1 M K2CO3, werd 30 µg van 6-MAM antilichamen toegevoegd in 10 ml van AuNPs oplossing en geïncubeerd gedurende 30 min. Dit werd gevolgd door 20 µl van 100,0 g l-1 BSA gedurende 15 min om de reactieve plaatsen te blokkeren. De oplossing werd gecentrifugeerd bij 3740g gedurende 15 min, en het supernatant werd opnieuw gecentrifugeerd bij 12 100g gedurende nog eens 30 min. Alle goudneerslagen werden gemengd en de maximale absorptie werd gemeten via UV-zichtbaarheidsspectroscopie. Het werd vervolgens bij 4°C bewaard voor verder gebruik.

Dezelfde methode werd gebruikt om AuNPs te conjugeren met konijn IgG antilichamen. Bij het maken van het conjugaatkussen werden de antilichaamconjugaten verdund tot absorptie vijf met buffer (0,05 M Tris-HCl met 10,0 g l-1 BSA, 0,4% Triton X-100, 5% trehalose, 10% sucrose, pH 8,2). Tenslotte werden 500 µl gemengde AuNP’s-antilichaam conjugaten op een 20 mm2 glasvezel gespoten en vervolgens bij 37°C overnacht gedroogd.

2.5. Bereiding van gecoate nitrocellulosemembranen

Om de lateral flow teststrip te maken, werden 6-MAM-BSA antigenen (0,6 mg ml-1) op de NC-membranen aangebracht als de testlijnen (T-lijn). De controlelijnen (C-lijn) werden gecoat met geiten anti-rabbit polyklonale antilichamen (0,15 mg ml-1). De gecoate NC-membranen werden een nacht gedroogd bij 37°C. Negen commerciële NC-membranen van vier bedrijven werden geëvalueerd: Millipore (HF90, HF135 en HF180), GE-Whatman (FF120HP en AE100), Sartorius (CN95 en CN150) en Pall (Vivid90 en Vivid170).

2.6. Gevoeligheid en specificiteit

De strip is een concurrerende assay, en beide posities hadden 6-MAM strips. Wanneer het monster 6-MAM bevat, bindt het aan het met nanogold gelabelde antilichaam op het geconjugeerde plaatje. Overtollige antilichamen gaan door capillaire werking verder langs de chromatografische richting en binden zich vervolgens aan het 6-MAM-antigeen op de T-lijn. De signaalintensiteit van de T-lijn staat in direct verband met de 6-MAM-concentratie in het monster. Een donkerder kleur wijst op een lagere 6-MAM-concentratie.

Negatieve orale vloeistof werd verzameld bij zes personen en gespiked met 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) voor gevoeligheidsdetectie. Tien veelgebruikte drugs werden gebruikt om de specificiteit van de LFS’s te controleren. Deze drugs waren morfine (MOP, 100 µg ml-1), codeïne (COD, 100 µg ml-1), tetrahydrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), methyleendioxymethamfetamine (MDMA, 100 µg ml-1), ketamine (KET, 100 µg ml-1), methylamfetamine (MET, 100 µg ml-1), cocaïne (COC, 100 µg ml-1), methadon (MTD, 100 µg ml-1), efedrine (EPH, 100 µg ml-1) en pseudo-efedrine (PEPH, 100 µg ml-1).

Resultaten en discussie

3.1. Synthese van 6-monoacetylmorfine-bovine serum albumine conjugaat

NC membranen worden gewoonlijk eerst gecoat met een dragereiwit voorafgaand aan de conjugatie van antilichaam. Linkers worden gebruikt om de structurele specificiteit te behouden. Hier werd eerst een NHS-estergroep toegevoegd aan de 6-MAM-molecule als linker voor het dragereiwit. Dit werd gevalideerd met een Waters® Vion IMS Q-Tof massaspectrometer. We vonden een brede piek in de ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) chromatogrammen van geactiveerde 6-MAM bij 8,8 min met een m/z van 706.27645 (figuur 6) versus een voorspelde m/z van 706.2758. Dit wijst erop dat de linker met succes aan de 6-MAM was gehecht. Het belang van een nauwkeurige synthese spreekt voor zich, omdat alleen de structuur correct is vastgesteld, en dit zou kunnen leiden tot koppeling met 6-MAM-antilichamen.

We hebben geen gradiëntdimethylsulfoxidedialyse gebruikt omdat het product oplosbaar is en het vorige conjugatieprotocol te ingewikkeld is. BSA had verschillende pieken in het UPLC-chromatogram (gegevens niet weergegeven) als gevolg van de verschillende analogen. Dit leidde tot een scala van conjugatieverhoudingen. Daarom waren er verschillende pieken in het UPLC-chromatogram die overeenkwamen met de verschillende conjugatieverhoudingen. De conjugatieresultaten konden beter worden bevestigd via antigeen-antilichaamkoppeling dan via de conjugatieverhouding.

3.2. Soorten selectie van nitrocellulosemembranen

NC-membranen binden eiwitten elektrostatisch via interacties van de sterke dipool van de nitraatester met de sterke dipool van de peptidebindingen van het eiwit. De eigenschappen waaronder capillair debiet, signaalintensiteit en achtergrond werden geëvalueerd omdat zij de uiteindelijke prestaties van de LFS kunnen beïnvloeden. Bovendien is meer aandacht besteed aan de stroomsnelheid omdat deze de eiwitadsorptiecapaciteit en zelfs de gevoeligheid kan beïnvloeden. De stroomsnelheid van een membraan hangt af van de aggregate eigenschappen van de poreuze structuren, zoals poriegrootte, poriegrootteverdeling en porositeit. Een grotere poriegrootte leidt tot zwakkere eiwitadsorptie.

We vergeleken negen NC-membranen (tabel 1). Elke test werd drie keer herhaald, en het gemiddelde resultaat werd genoteerd. De LFS-resultaten werden gemeten in 3 min, en de beste monsterdoorstroomsnelheid was lager dan 20 s cm-1. De signaalintensiteit op de T-lijn moest ook op het normale niveau liggen. Een diepere achtergrondkleur belemmerde de nauwkeurigheid. Het Millipore-membraan HF135 was de beste keuze voor 6-MAM na uitvoerige overweging van de stroomsnelheid van het monster, de signaalintensiteit bij de T-lijn en de achtergrondkleur.

3.3. Het monsterkussen

De oplossing voor de behandeling van het monsterkussen is zeer belangrijk voor de test omdat zij als reactiebuffersysteem dient wanneer de orale vloeistofmonsters het kussen rehydrateren. De oplossing bevat gewoonlijk een buffersysteem met de juiste ionische sterkte en pH-waarde; sommige blokkerende materialen en oppervlakteactieve stoffen kunnen de stroomsnelheid van de orale vloeistof op het membraan versnellen. Het monsterkussen gaat de complexiteit van de matrixeffecten van de orale vloeistof tegen en maakt het compatibel met het NC-membraan. Bovendien zorgt het buffersysteem voor de afgifte van analyten en stabiliseert het de stroomsnelheid omdat de orale vloeistof te viskeus is.

Vier verschillende formules werden in aanmerking genomen. De oplossingsformules zijn vermeld in tabel 2. Uit de resultaten bleek dat buffersysteem 4 met de oppervlakteactieve stof STANDAPOL ES-1 (S7) de beste resultaten opleverde bij een bemonsteringsdebiet van 17 s cm-1, met een normale signaalintensiteit en een witte achtergrond. Oppervlakteactieve stof S7 is een sterke anionogene oppervlakteactieve stof die een sterker wasvermogen biedt dan S17 en S9.

3.4. Opvang van orale vloeistoffen

Oraale vloeistoffen zijn moeilijker op te vangen dan urine door hun hoge viscositeit. Er zijn vele soorten hulpmiddelen voor het opvangen van oraal vocht: wattenstaafjes, sponzen, plastic buisjes en bekertjes. Sommige methoden stimuleren het orale vocht via azijn, mondwater, zuigtabletten, enz. Dergelijke stimulatie kan echter de concentratie van analyten in het mondvocht veranderen en is gecompliceerder en tijdrovender. Uiteindelijk verzamelden we de orale vloeistof rechtstreeks uit de mond met een sponsadsorptiemiddel (ESSENTRA, VK), dat een mengsel is van polymere vezels met een geschikte poriegrootte.

Twee soorten sponsadsorptiemiddelen (K1 en K2) werden op maat ontworpen, en de structuren van beide sponskussens worden getoond in figuur 7. K2 was veel losser en regelmatiger ten opzichte van K1. Beide werden geëvalueerd door de vloeistofverwerking te testen, onder meer door water op het sponskussen te laten vallen, het uiteindelijke LFS in de negatieve kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,0) te brengen en het uiteindelijke LFS in de mond te stoppen. De K2-spons had een twee keer zo snelle stroomsnelheid van het monster (gemiddeld 20 s cm-1) dan de K1-spons voor water, PBS-buffer of echte orale vloeistoffen. Dit is een zeer belangrijk punt voor het testen van orale vloeistoffen. Concluderend kan worden gesteld dat K2 werd gekozen vanwege zijn uitstekende prestaties bij het verwerken van monsters van orale vloeistoffen.

3.5. Gevoeligheid en specificiteit

Kleine moleculen worden meestal gedetecteerd via een competitieve assay in LFS’s. Hier is er geen signaal (rode lijn) in de T-lijn. Dit vertegenwoordigt een concentratie van 6-MAM in het monster die boven de afkapwaarde ligt. De gevoeligheid voor orale vloeistoftests moet veel hoger zijn dan de urinetest, omdat de concentratie van drugmetabolieten in orale vloeistof laag is. Hier hebben we met succes een kwalitatieve LFS voor 6-MAM gemaakt met een gevoeligheid van 4 ng ml-1, wat voldoet aan de eisen voor algemene detectielimieten voor orale vloeistoffen. De resultaten zijn te zien in figuur 8. Bovendien toont figuur 9 de specificiteit ten opzichte van de vaak misbruikte drugs. De 6-MAM LFS was specifiek voor 6-MAM zonder kruisreactie met name met morfine of codeïne.

Conclusie

De 6-MAM is de specifieke metaboliet van heroïne. Wij rapporteren hier een LFA voor 6-MAM via een speciaal conjugaat gekoppeld aan een specifiek antilichaam. Wij maakten een conjugaat dat 6-MAM aan het dragereiwit koppelde via een NHS-estergroep op de C3-positie (figuur 10). Hier identificeerde het antilichaam de acetylgroep van 6-MAM. Dit is een eerste vereiste voor specificiteit voor 6-MAM. Tenslotte hebben wij een zeer gevoelige LFS-test gemaakt zonder kruisreactie met 10 veelgebruikte drugs, waaronder morfine en codeïne. We identificeerden de juiste NC-membranen, sample pad, poriegrootte en sponsadsorptiemiddel om een test te maken die gebruik maakt van orale vloeistoffen op de plaats van verzorging.

Met bovenstaande voordelen zou de 6-MAM LFS voor orale vloeistofmonsters kunnen worden toegepast voor zowel onderzoeks- als industriële doeleinden. Het zou de politie kunnen helpen mankracht en tijd/kosten te besparen bij voorafgaande screening. Orale vloeistoffen zijn handig en minder invasief en zijn geschikt voor verkeersonderzoek. Concluderend is een orale vloeistof LFS voor heroïnemisbruik gericht op 6-MAM een veelbelovend product om gedrogeerd rijden tegen te gaan.

Ethiek

Het gebruik van de heroïnemonsters voor onderzoek stond onder toezicht van het Derde Onderzoeksinstituut van het Chinese Ministerie van Openbare Veiligheid. Alle auteurs verklaren dat zij voldoen aan de ethische normen.

Toegankelijkheid van de gegevens

De gegevens zijn gedeponeerd in de Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Authors’ contributions

L.Z. bedacht deze studie, en X.H en J.Z. hielpen bij het uitvoeren van de experimenten in figuur 4 en 5. F.C. en Y.Z. voerden de studies in figuur 6 uit. J.L. analyseerde de gegevens en schreef het verslag. Alle auteurs gaven hun definitieve goedkeuring voor publicatie.

Belangen

We verklaren dat we geen concurrerende belangen hebben.

Funding

Er is geen financiering ontvangen voor dit artikel.

Disclaimer

Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die hier worden geuit, zijn die van de auteurs.

Voetnoten

Dit artikel is geredigeerd door de Royal Society of Chemistry, inclusief de opdrachtverlening, het peer review proces en redactionele aspecten tot het punt van acceptatie.