A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloïdose is het resultaat van verschillende, verschillend benaderbare ziekten. Het is van vitaal belang de amyloïd afzettingen te subtyperen om de onderliggende ziekte goed te kunnen vaststellen en uiteindelijk te behandelen. Naast de klassieke kleuring met Congo rood zijn verdere procedures zoals immunohistochemische kleuring nodig voor classificatie. Hier wordt een nauwkeuriger benadering voorgesteld waarbij gebruik wordt gemaakt van een Congo rood/immunohistochemische dubbelkleuring, die gemakkelijk in de routinediagnostiek kan worden toegepast. Wijzigingen van de Congo rood kleuringstechniek en de immunohistochemische procedures waren nodig om beide kleuringstechnieken op één objectglaasje te kunnen combineren. De evaluatie werd uitgevoerd met conventionele licht- en fluorescentiemicroscopie. Door de kleuringstijd voor Congo rood te verkorten tot 10 s en door de endogene peroxidase te blokkeren, konden nauwkeurige resultaten worden verkregen voor de evaluatie van de Congo rood/immunohistochemische dubbelkleuring met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Secties van 2 μm in plaats van 4 μm dikte waren superieur voor de evaluatie, aangezien zij de specificiteit van de kleuring verhoogden. De combinatie van Congo rood en immunohistochemie als in situ dubbele kleuring op één objectglaasje is een haalbare benadering voor de diagnose van amyloïdose. Het maakt het mogelijk zich bij de evaluatie van de immunohistochemie te concentreren op de fluorescerende Congo rood-positieve gebieden, waardoor vals-positieve resultaten kunnen worden vermeden. Bovendien verhoogt het de signaal-ruisverhouding van de immunohistochemisch gekleurde secties op conventionele microscopie.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Inleiding

Amyloïdose is de morfologische beschrijving van de afzetting van verkeerd gevouwen eiwitten die kan worden gevonden in veel verschillende weefseltypes . De eiwitten die amyloïd vormen zijn afkomstig van een veelheid van bronnen, variërend van tumoren, zoals plasmacel neoplasma of medullaire schildklier carcinomen, tot chronische infecties, of worden gezien als een gevolg van veroudering. In zeldzame gevallen is amyloïdose het gevolg van genetisch erfelijke eiwitmisvouwingsstoornissen. Het klinisch belang van amyloïdose reikt van incidentele vondsten bij autopsies tot levensbedreigende ziekten. Bij het onderzoek van weefselmonsters is het belangrijk dat pathologen rekening houden met de waarschijnlijkheid van amyloïde afzettingen, aangezien dit de eerste aanwijzing kan zijn voor een nog onbekende ernstige onderliggende ziekte. Hoewel er veelbelovende resultaten zijn geboekt met therapieën die gericht zijn op de amyloïd afzettingen zelf, zijn de behandelmethoden bij amyloïdose nog steeds vooral gericht op de onderliggende aandoening en die kan en moet in de meeste gevallen worden bepaald op basis van amyloïd subtypisatie.

De klassieke histochemische kleuring voor amyloïd is Congo rood, zoals geïntroduceerd door Bennhold in 1922; de typische ‘appelgroene’ birefringentie met behulp van polarisatie werd voor het eerst beschreven in 1927. Om de gevoeligheid en specificiteit van de kleuring met Congo rood te verhogen, zijn verschillende methoden gebruikt, waaronder de beoordeling van met Congo rood gekleurde coupes met fluorescerend licht vanwege de bekende fluorescente eigenschappen van Congo rood . Nog maar kort geleden zijn benaderingen voorgesteld waarbij gebruik wordt gemaakt van een digitaal versterkte hematoxyline-eosine polarisatietechniek voor de detectie van amyloïd, die bijzonder nuttig is voor de identificatie van amyloïd in gevallen waarin weinig weefsel beschikbaar is.

De gouden standaard voor het subtyperen van amyloïd is immunohistochemie, met inbegrip van verschillende gevestigde protocollen ; er zijn echter enkele tekortkomingen, vooral gezien de geringere specificiteit van antilichamen tegen amyloïdogene lichte keten lambda. Een nieuwe aanpak voor de subtypering van vooral zeldzame varianten van amyloïdose is massaspectrometrie ; helaas is deze veelbelovende methode tot dusverre nog niet op grote schaal toegepast vanwege de kosten en de beschikbaarheid; een bijkomend euvel is dat zij duidelijk beperkt is in gevallen waarin weinig weefsel beschikbaar is of waarin de hoeveelheid afgezet amyloïd beperkt is. Een andere recente verwezenlijking is het gebruik van immuno-elektronenmicroscopie van abdominale vetaspiraten voor het subtyperen van amyloïde afzettingen; dit is echter een geavanceerde methode.

Er zijn verschillende eerdere studies geweest die zich hebben geconcentreerd op de combinatie van fluorescentie en immunohistochemie . Hier presenteren we aanvullend bewijs voor de uitvoerbaarheid van een dergelijke aanpak en melden een protocol gemakkelijk te vertalen naar routine, die ons in staat stelde om nauwkeurig amyloïde subtypisatie op formaline-vaste en paraffine-embedded weefsels. Congo rood / immunohistochemie dubbele kleuring maakt het mogelijk om zich te concentreren op de Congo rood-positieve gebieden bij de evaluatie van immunohistochemie en verhoogt de signaal-ruisverhouding van de immunohistochemisch gekleurde secties op conventionele lichtmicroscopische evaluatie, waardoor zowel de specificiteit als de gevoeligheid van de procedure wordt verbeterd, evenals de hoeveelheid weefsel die nodig is voor de diagnostiek wordt verminderd.

Materialen en Methoden

Selectie van Gevallen

Specimens met een bewezen diagnose van amyloïdose uit ons archief werden gebruikt om de nieuwe techniek vast te stellen. Zij zijn vermeld in tabel 1, met inbegrip van de stappen waarvoor het desbetreffende weefsel werd gebruikt.

Congo rood kleuring Benaderingen

Congo rood kleuring werd aanvankelijk uitgevoerd volgens het vastgestelde protocol in ons instituut: formaline-ingevulde en in paraffine ingebedde weefsels worden tot 6 μm dikke coupes gesneden, gedeparaffineerd en gedurende 30 min met Congo rood geverfd – 2.5 g Congo rood (Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland) en 1 g kaliumhydroxide (Merck Millipore) opgelost in 500 ml 80% ethanol; daarna worden de coupes gespoeld met leidingwater voordat ze 4 min. worden tegengekleurd met hematoxyline (Merck Millipore). In een volgende stap, secties worden gedifferentieerd in 0,5% HCl / ethanol-oplossing en opnieuw gespoeld met leidingwater gedurende 10 minuten voordat ze worden gedroogd en gemonteerd.

Voor onze studie, werd het protocol gewijzigd met betrekking tot de Congo rood kleuring tijd om te zien, welke invloed kortere kleuring tijden zou kunnen hebben op de daaropvolgende immunohistochemische kleuring. Secties met een dikte van 2 en 4 urn werden ook getest.

Immunohistochemische kleuring en endogene peroxidase blokkade

De immunohistochemische kleuring voorwaarden voor de verschillende amyloïde subtypes zijn vermeld in tabel 2. Zoals voorgesteld door de fabrikant werden twee verschillende klonen gebruikt voor de detectie van de amyloïdogene lichte ketens kappa en lambda, respectievelijk. De immunohistochemie werd uitgevoerd na de Congo rood-kleuring. In het kort werden de preparaffinebehandelde en met endogene peroxidase geblokkeerde objectglaasjes (zie later) geïncubeerd in normaal paardenserum (voor AA-amyloïdkleuring) of normaal geitenserum (voor alle andere kleuring)/Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (900 μl serum/60 ml TBS) gedurende 30 min. bij kamertemperatuur (beide sera van Vector Lab., Burlingame, Calif, USA) en vervolgens een nacht geïncubeerd met het primaire antilichaam bij 4°C, gespoeld en geïncubeerd met een gebiotinyleerde anti-muis IgG (voor kleuring van amyloïd AA) of gebiotinyleerde anti-rabbit IgG (voor alle andere kleuringprocedures) oplossing (300 μl IgG/900 μl normaal paarden- of geitenserum/60 ml TBS; beide IgG’s van Vector Lab.) gedurende 30 min bij kamertemperatuur; tenslotte werden ze gespoeld en geïncubeerd met een avidine-biotine-peroxidase kit (Vectastain van Vector Lab.) gedurende 30 min en gevisualiseerd met behulp van kant-en-klare 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC; van Dako, Glostrup, Denemarken) als chromogeen (10-20 min onder ogenblikkelijke optische controle) en Meyer’s hematoxyline (van Medite, Dietikon, Zwitserland). AEC kreeg de voorkeur omdat uit eerdere experimenten is gebleken dat de signaal-ruisverhouding bij AEC-visualisatie beter is dan bij diaminobenzidine-visualisatie. Aangezien AEC oplosbaar is in water en alcohol, werden de objectglaasjes bedekt met Medi-Mount (van Medite, Burgdorf, Duitsland) gedurende 30 minuten vóór het afdekken.

Omdat de gebruikelijke behandeling voor endogene peroxidase blokkering van weefsels (3% H2O2 oplossing in 70% ethanol) na voltooiing van de Congo rood kleuring leidde tot verlies van congofilie, werden andere methoden voor endogene peroxidaseblokkering getest, zoals het verplaatsen van deze stap voorafgaand aan de Congo rood kleuring en vervanging van 70% ethanol door gedestilleerd water.

Evaluatie

De met Congo rood/immunohistochemie dubbelgekleurde coupes werden in eerste instantie geëvalueerd met een conventionele lichtmicroscoop om te beoordelen of het respectieve immunohistochemische chromogenproduct werd gevisualiseerd zoals verwacht, slechter of beter in vergelijking met de diagnostische routinekleuring (zonder Congo rood voorkleuring). Vervolgens werd een fluorescentiemicroscoop met een rhodaminefilter (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Duitsland) gebruikt om de fluorescentie van de Congo rood kleurstof te evalueren. Gebieden die een specifieke intensieve fluorescentie vertoonden, werden verder geëvalueerd met lichtmicroscopie om te zien of amyloïde afzettingen ook met immunohistochemie in deze gebieden konden worden gedetecteerd.

Resultaten

Stap 1: Wijzigingen van het Congo Rood Kleuring Protocol

Er werden verschillende kleuringstijden voor de Congo rode kleurstof getest. Dit was nodig omdat het vermogen van antilichamen om antigenen te binden door de procedure voor het verven van Congo rood werd verminderd en volle intensiteit Congo rood gelijktijdige evaluatie bemoeilijkte, aangezien een rood chromogeen (AEC) met een soortgelijke kleur als die van Congo rood voor immunohistochemie werd gebruikt. Wanneer de oorspronkelijke kleuringstijd van 30 min werd toegepast, kon birefringentie worden gedetecteerd voor amyloïde afzettingen met behulp van een gepolariseerd filter op conventionele lichtmicroscopie. Wanneer de kleuring voor Congo rood slechts 5, 10 of 20 s duurde, konden altijd positieve signalen worden gedetecteerd bij gebruik van het rhodaminefilter van een fluorescentiemicroscoop, terwijl de conventionele microscopie slechts af en toe congofilie en birefringentie vertoonde bij gebruik van het gepolariseerde filter (fig. 1). Voor verdere analyse werd de tijd voor de kleuring met Congo rood bij voorkeur teruggebracht tot 10 s om overkleuring te voorkomen; 10 s is gekozen om redenen van uitvoerbaarheid (gemakkelijker gestadig na te leven dan 5 s) in het natte lab.

Stap 2: Wijzigingen van de immunohistochemische protocollen voor de combinatie van Congo rood en immunohistochemische kleuring op een dia

In een eerste stap werd immunohistochemische kleuring uitgevoerd op afzonderlijke coupes om de antigeniciteit van de voor deze studie gebruikte weefsels te bevestigen, die bevredigende kleuring resultaten lieten zien met behulp van de gevestigde routineprotocollen, zoals beschreven in tabel 2.

Bij het combineren van de Congo rood kleuring (Congo rood kleuringstijd van 10 s) met de immunohistochemische kleuring op dezelfde coupes, werd geconstateerd dat de congofilie verdween na het voltooien van de immunohistochemische procedures met behulp van de gebruikelijke behandeling voor endogene peroxidase blokkering van weefsels (3% H2O2 oplossing in 70% ethanol), aangezien de Congo rode kleurstof is uitgewassen. Daarom werd in een derde stap de behandeling voor endogene peroxidaseblokkering gewijzigd. Blokkering van endogene peroxidase volgens de gebruikelijke methode, maar vóór de kleuring met Congo rood, alsmede vervanging van 70% ethanol door gedestilleerd water bij de blokkering van endogene peroxidase na de kleuring met Congo rood, hebben tot bevredigende resultaten geleid, zowel voor de evaluatie van de kleuring met Congo rood als voor de immunohistochemische kleuring. Om zoveel mogelijk bij de gebruikelijke “wet lab”-workflow te blijven, werd de methode waarbij ethanol door gedestilleerd water werd vervangen, verder toegepast. Pogingen om endogene peroxidaseblokkering achterwege te laten, verminderden de signaal/ruisresultaten voor AEC-visualisatie matig (ervan uitgaande dat de niet-geblokkeerde endogene enzymen AEC gebruikten en enerzijds een lichte achtergrondkleuring gaven en anderzijds het ABC-peroxidasecomplex van chromogen beroofden voor een goede visualisatie) en werden daarom niet verder benut. De kwaliteit van de immunohistochemische kleuring na voorafgaande kleuring met Congo rood was gelijk aan die van de immunohistochemische kleuring zonder voorafgaande kleuring met Congo rood; wij hebben dus geconcludeerd dat het uitvoeren van immunohistochemie op secties die gedurende 10 s met Congo rood zijn voorgekleurd, niet leidt tot een verlies van antigeniciteit of tot onspecifieke kleuringresultaten.

Stap 3: Wijzigingen van sectiediktes

Ten slotte onderzochten we de rol van verschillende sectiediktes (2 en 4 μm). In het algemeen waren de specificiteit en de evalueerbaarheid van de immunohistochemische kleuring (signaal-ruisverhouding) beter op de dunnere coupes; bovendien waren er minder artefacten met betrekking tot het loskomen van weefsel van de objectglaasjes tijdens de kleuringprocedures. Alle gevallen vertoonden dezelfde resultaten als verkregen bij de initiële diagnostische subtypering van amyloïd afzettingen.

Voorbeelden van Implementatie van de Beschreven Benadering in Routine Diagnostische Procedures

Figuren 2 en 3 illustreren twee routine gevallen, waarin amyloïd subtypisatie kon worden bereikt met behulp van het nieuwe algoritme voorgesteld in deze studie; door toepassing van de conventionele techniek alleen, geen interpreteerbare resultaten zijn verkregen.

Discussie

Hierbij presenteren en valideren wij een gecombineerde Congo rood/immunohistochemie dubbele kleuring procedure, die het mogelijk maakt zich te concentreren op de Congo rood-positieve gebieden bij de evaluatie van immunohistochemie, waardoor de specificiteit van in situ-gebaseerde amyloïd subtypisatie. Het helpt ook om weefsel te sparen, wat een probleem is omdat biopsiemateriaal steeds beperkter wordt als gevolg van veranderde diagnostische benaderingen met behulp van fijne naaldkernen en biopsie forcipes.

In tegenstelling tot andere voorgestelde nieuwe evaluatietechnieken die zich richten op geavanceerde gedigitaliseerde beeldevaluatie , kan onze benadering gemakkelijk worden opgenomen in routinediagnostiek. Vereisten omvatten slechts het wijzigen van gevestigde Congo rood kleuring, beschikbaar amyloïde immunohistochemie, alsmede een fluorescentie microscoop met een rhodamine filter. Idealiter zouden microscopen moeten worden gebruikt die zijn uitgerust voor zowel fluorescentie- als conventionele lichtmicroscopie, aangezien dit het verificatieproces op dezelfde (fluorescerende) interessegebieden van amyloïdafzetting bij de evaluatie van de immunohistochemie vereenvoudigt door een eenvoudige verwisseling van lichtbron en filter. Twee verschillende microscopen kunnen echter ook worden gebruikt, maar in moeilijke gevallen kan het nemen van een foto van de respectieve gebieden in fluorescentie- en lichtmicroscopie worden gesuggereerd voor een gemakkelijkere evaluatie.

In overeenstemming met eerdere studies konden we aantonen dat Congo rood niet interfereert met immunohistochemie of deze verstoort. Bovendien, in vergelijking met sectie diktes van 4-6 pm gebruikt in de meeste studies tot nu toe , konden we aantonen dat het gebruik van dunnere secties van 2 pm, die gunstig zijn voor immunohistochemie (betere signaal-ruis verhouding, minder onthechting artefacten), kan ook leiden tot bevredigende resultaten met betrekking tot Congo rood kleuring, indien uitgelezen door een fluorescentiemicroscoop.

Er zijn verschillende recente artikelen verschenen waarin het gebruik van fluorescentie voor de evaluatie van amyloïde afzettingen wordt gepropageerd en waarin wordt aangetoond dat fluorescentie superieur is aan gepolariseerde lichtmicroscopie doordat zij zowel specifieker als gevoeliger is. In deze studie hebben wij deze aanpak op verschillende manieren verfijnd en geoptimaliseerd door te werken aan een aangepast protocol met betrekking tot de kleuringstijd, de kleuringprocedures en de sectiedikte. Deze veranderingen hebben het uiteindelijk mogelijk gemaakt om een in situ dubbele kleuring uit te voeren voor zowel gevoelige en specifieke detectie van amyloïde afzettingen als voor subtypisatie van deze afzettingen, wat cruciaal is om de onderliggende ziekte die leidt tot amyloïde afzettingen te onderscheiden. Onze aanpak van dubbele kleuring laat niet alleen toe om amyloïd gevoelig te detecteren door fluorescentie en terzelfdertijd deze afzettingen specifiek te categoriseren, maar ook om materiaal te sparen dat seriële secties vermijdt, waarop de soms minuscule amyloïd afzettingen reeds zouden kunnen weggesneden zijn. Sinds de invoering van deze dubbele kleuring hebben wij deze aanpak al in verschillende gevallen toegepast, waarin met andere methoden geen definitieve diagnose kon worden gesteld. De figuren 2 en 3 illustreren twee van deze gevallen.

Echter, er is wellicht nog ruimte voor verdere vervolmaking. Aangezien immunoalkaline-fosfatase-gebaseerde detectiesystemen die geen endogene peroxidase blokkade nodig hebben momenteel niet gebruikt worden in onze immunohistochemische workflow, kan vervanging van immunoperoxidase-gebaseerde detectiesystemen door eerstgenoemde de resultaten verder verbeteren en de lab workflow slanker maken.

Tot slot presenteren we een geoptimaliseerde en verfijnde aanpak voor Congo rood/immunohistochemie dubbele kleuring. Deze aanpak is gunstig wat betreft specificiteit, kosten en benodigde hoeveelheid weefsel. De vereisten zijn minimaal en zouden een wijdverbreid gebruik mogelijk moeten maken.

Acknowledgements

Thomas Menter wordt ondersteund door de Nuovo-Soldati Cancer Research Foundation, Vaduz, Liechtenstein.

Statement of Ethics

De studie heeft alleen betrekking op archief menselijk materiaal van het Institute of Pathology Basel en werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van Noordwest- en Centraal-Zwitserland (EKNZ 2014-252). Er waren geen dieren bij betrokken.

Disclosure Statement

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.