ABTS
17.4 Fenolen
Oxidatie van het klassieke Lac-substraat ABTS door het laccase van Tetracystis aeria is wijdverbreid bij chlorofycean algen. Zo scheiden soorten van de Moewusinia, waaronder Chlamydomonas moewusii en T. aeria, vermeende “echte” Lac’s uit. Fenolische substraten worden door deze enzymen optimaal geoxideerd bij neutrale tot alkalische pH. De laccase van Tetracystis zet efficiënt andere verbindingen om, zoals bisfenol A, 17α-ethinylestradiol, nonylfenol en triclosan in aanwezigheid van ABTS als redox-mediator, terwijl antraceen, veratrylalcohol en adlerol onveranderd blijven. Mogelijke natuurlijke functies van de enzymen, zoals de synthese van complexe polymeren of ontgiftingsprocessen, kunnen bijdragen tot de overleving van de algen in ongunstige milieus. In verontreinigde oppervlaktewateren zouden Lac-producerende groene algen kunnen bijdragen tot de milieu-afbraak van fenolverontreinigende stoffen.
Putatief Lac (CotA) van Bacillus pumilus MK001 gekloond en tot expressie gebracht in E. coli bleek thermostabiel te zijn met een halfwaardetijd van 60 minuten bij 80°C en potentiële bindingsaffiniteiten te vertonen met ferulinezuur, cafeïnezuur en vanilline.
Fenolen zijn bekende remmers voor cellulase en fermentatieve micro-organismen in bioraffinageprocessen. De toevoeging van Lac verwijdert de fenolische verbindingen en vermindert vervolgens de lag-fase van het fermentatieve micro-organisme. De toepassing van Lac vermindert echter het vrijkomen van glucose tijdens de enzymatische hydrolyse. Het aandeel lignine en de samenstelling van fenolen zijn belangrijke spelers in de remming van cellulase wanneer de enzymatische hydrolyse wordt gecombineerd met Lac ontgifting.
Een interessante toepassing in de milieubiotechnologie is de immobilisatie van Lac om fenolische verontreinigingen te elimineren via oxidatie. Geroosterde silica nanodeeltjes hebben een interessant potentieel als dragermateriaal voor Lac immobilisatie via sorptie-geassisteerde immobilisatie in het perspectief van toepassingen zoals de eliminatie van micro-verontreinigingen in waterige fasen. Immobilisatie van Lac van een Leviathan genus, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus, en T. versicolor op gerookt silica nanodeeltjes, afzonderlijk of in combinatie, geeft een verhoogde activiteit over een pH-bereik tussen 3 en 7. De verschillende Lac’s verschillen in hun pH-optima en substraataffiniteit. Door gebruik te maken van hun verschillen kon een op maat gemaakte nanobiokatalysator worden geformuleerd die in staat is een breder substraatbereik te oxideren dan de opgeloste of afzonderlijk geïmmobiliseerde enzymen. De nanobiokatalysator heeft het potentieel voor biochemische oxidatie in de eliminatie van meerdere doelverontreinigende stoffen . Het is bevestigd dat niet-vocationele nanobiokatalysatoren verkregen door Lac immobilisatie op silica nanodeeltjes een breed substraat spectrum bezitten met betrekking tot de afbraak van recalcitrante verontreinigende stoffen, zoals fenolische EDCs (bisfenol A) .Dit onderstreept het potentieel van gerookt silica nanodeeltjes/laccasamenstellingen voor geavanceerde biologische afvalwaterbehandeling.
Lacs zijn in staat om één-elektron oxidatie van fenolische verbindingen te katalyseren in radicale tussenproducten die vervolgens aan elkaar kunnen koppelen via covalente bindingen. Aangenomen wordt dat deze reacties een belangrijke rol spelen in het bevochtigingsproces en de omzetting van verontreinigingen met fenolische functionaliteiten in het milieu. Door integratie van metaal-HA bindings-evenwichten en kinetische vergelijkingen werd een reactiemodel ontwikkeld dat de omzettingssnelheid van triclosan voorspelt in aanwezigheid van HA en tweewaardige metaalionen waaronder Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, en Zn2+.
Gehydroxyleerde polybroomdifenylethers (OH-PBDE’s) zijn vaak aangetroffen in de mariene biosfeer als opkomende organische contaminanten. De productie van OH-PBDE’s is waarschijnlijk het gevolg van de koppeling van bromofenoxy-radicalen, die ontstaan bij de Lac-gekatalyseerde oxidatie van 2,4-DBP of 2,4,6-TBP. De omzetting van broomfenolen door Lac is pH-afhankelijk en wordt ook beïnvloed door enzymatische activiteit. Gezien de overvloed aan 2,4-DBP en 2,4,6-TBP en de fylogenetische verspreiding van Lac in het milieu, kan de Lac-gekatalyseerde omzetting van broomfenolen mogelijk een belangrijke route zijn voor de natuurlijke biosynthese van OH-PBDE’s.
Phanerochaete chrysosporium behoort tot een groep van lignine-afbrekende schimmels die verschillende oxidoreductieve enzymen afscheiden, waaronder lignine-peroxidase (LiP) en mangaan-peroxidase (MnP). De productie van Lacs in deze schimmel is echter niet volledig aangetoond en blijft controversieel. De coëxpressie van het LacIIIb gen van T. versicolor en het vpl2 gen van Pleurotus eryngii, en ook de endogene genen mnp1 en lipH8 verbeterde de coëxpressie van peroxidases en laccases tot het vijfvoudige in vergelijking met wild-type soorten. Transformant stammen hebben een breed spectrum in fenolische/niet-fenolische biotransformatie en een hoog percentage in synthetische kleurstof ontkleuring in vergelijking met de ouderlijke stam en zijn een gemakkelijke en efficiënte coëxpressie van Lacs en peroxidases in geschikte basidiomycete soorten .
Recentelijk, Lac is toegepast op nanobiotechnologie, dat is een toenemend onderzoeksgebied, en katalyseert elektronenoverdracht reacties zonder extra cofactoren .
Koolstof nanodeeltjes zijn veelbelovende kandidaten voor enzym immobilisatie. Vergeleken met vrije Lac, hebben de geïmmobiliseerde enzymen aanzienlijk verminderde reactiesnelheden. Diffusiebeperking veroorzaakt door de aggregatie van koolstofnanopartikels kan niet genegeerd worden omdat het kan leiden tot langere reactietijden, lage efficiëntie en hoge economische kosten. Bovendien wordt dit probleem verergerd wanneer lage concentraties van milieuverontreinigende stoffen aanwezig zijn.
Bisfenol A (BPA) is een hormoonontregelende chemische stof die alomtegenwoordig is in het milieu vanwege zijn brede industriële gebruik. Extracellulaire Lac van de meest gekweekte paddenstoel ter wereld (d.w.z., witrotschimmel, P. ostreatus) breekt BPA efficiënt af. De blootstelling aan BPA heeft geen schadelijke effecten op deze eetbare paddestoel.
De verwijdering van BPA door Lac in een continue enzymatische membraanreactor beoordeeld in synthetisch en reëel biologisch behandeld afvalwater in een reactorconfiguratie gebaseerd op een geroerde tankreactor gekoppeld aan een keramisch membraan, toonde een bijna volledige verwijdering van BPA aan. Polymerisatie en degradatie zijn waarschijnlijke mechanismen van BPA transformatie door Lac.
Organismen van de phylum Basidiomycota hebben een enorm bioremediëringspotentieel door hun fenoloxidases in de afbraak van fenolen. Lac en tyrosinase komen voornamelijk voor in T. versicolor en Agaricus bisporus, respectievelijk. Er zijn nieuwe veelbelovende wild-type producenten van enzymen opgedoken en er is ook een aantal recombinante stammen geconstrueerd, hoofdzakelijk op basis van gisten of Aspergillus-stammen als gastheer. De constructen maken toepassingen mogelijk voor de afbraak van fenolen, polyfenolen, cresolen, alkylfenolen, naftenolen, bisfenolen, en gehalogeneerde (bis)fenolen. Biologische en fysico-chemische methoden zouden gecombineerd kunnen worden om de processen geschikt te maken voor industrieel gebruik.
Plantperoxidases hebben een groot potentieel nut voor de sanering van met fenol verontreinigd afvalwater. Grootschalig gebruik van deze enzymen voor de ontsmetting van fenol vereist goedkoop, overvloedig en gemakkelijk toegankelijk peroxidase-bevattend materiaal. Aardappelpulp, een afvalproduct van de zetmeelindustrie, bevat grote hoeveelheden actieve peroxidases, en de enzymen uit aardappelpulp behouden hun activiteit bij pH 4-8 en zijn stabiel over een breed temperatuurbereik. De fenolverwijderingsefficiëntie van aardappelpulp is meer dan 95%.
Geïmmobiliseerde Lac op nanoporeuze silica-korrels breken meer dan 90% van 2,4-dinitrofenol af in een korte tijd (12 uur). Het immobilisatieproces verbetert de activiteit en de duurzaamheid van Lac voor de afbraak van de verontreinigende stof. Temperaturen boven 50°C reduceren de enzymactiviteit tot ongeveer 60%. De pH en de mediatorenconcentratie hadden echter geen invloed op de enzymactiviteit. De degradatiekinetiek is in overeenstemming met een Michaelis-Menten vergelijking.
Vochtige exudaten van raaigras (Lolium perenne) kunnen BPA afbreken zowel in afwezigheid als in aanwezigheid van natuurlijk organisch materiaal (NOM). In exudaten met toevoeging van NOM verloopt het afbraakproces langer dan zonder NOM. Peroxidase en Lac activiteiten in exudaten suggereerden een significante betrokkenheid van deze enzymen bij BPA afbraak.
Organofluorine verbindingen zijn belangrijke bouwstenen geworden voor een breed scala van geavanceerde materialen, polymeren, agrochemicaliën, en farmaceutische producten. Het concept voor de introductie van de trifluormethylgroep in onbeschermde fenolen door gebruik te maken van een biokatalysator (Lac), tBuOOH, en ofwel het Langlois-reagens ofwel het zinksulfonaat van Baran werd verwezenlijkt. De methode berust op de recombinatie van twee radicale species, namelijk het fenolradicaal-kation dat rechtstreeks door Lac wordt gegenereerd en het CF3-radicaal. De Lac-gekatalyseerde trifluormethylering verloopt onder milde omstandigheden en breekt trifluormethylgesubstitueerde fenolen af die niet beschikbaar waren met klassieke methoden.
Lac-producerende zoetwaterascomycet Phoma sp. stam UHH 5-1-03 heeft potentieel voor praktische verwijdering van microverontreinigingen. Bisfenol A (BPA), carbamazepine (CBZ), 17α-ethinylestradiol (EE2), diclofenac (DF), sulfamethoxazol (SMX), technisch nonylfenol (t-NP), en triclosan (TCS) zijn substraten met de rangorde: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. De verkregen metabolieten wijzen op hydroxylerings-, cycliserings- en decarboxyleringsreacties, alsook op oxidatieve koppelingen die typisch zijn voor Lac-reacties. De waarnemingen suggereren sterk dat het extracellulaire Lac van Phoma sp. grotendeels bijdraagt tot de biotransformatie door schimmels.
Er is meer aandacht besteed aan nanobiokatalyse. Lac reversibel geïmmobiliseerd op Cu(ΙΙ)- en Mn(ΙΙ)-gechelateerde magnetische microsferen was succesvol in het verwijderen van BPA uit water. In vergelijking met vrije Lac, zijn de thermische en opslagstabiliteiten van geïmmobiliseerd Lac aanzienlijk verbeterd. Meer dan 85% van BPA werd verwijderd onder optimale omstandigheden.
Het gebruik van enzymen in oplossing voor waterbehandeling heeft echter beperkingen van niet-herbruikbaarheid, korte enzymlevensduur, en hoge kosten van eenmalig gebruik. Chen et al. ontwikkelden een nieuw type biokatalysator door schimmel Lac te immobiliseren op het oppervlak van gistcellen met behulp van synthetische biologie technieken. De biokatalysator wordt surface display Lac (SDL) genoemd en kan met hoge stabiliteit worden hergebruikt, aangezien hij 74% van zijn aanvankelijke activiteit behield na acht herhaalde batchreacties. De doeltreffendheid van SDL en het bewijs van concept bij de behandeling van verontreinigende stoffen die aanleiding geven tot opkomende bezorgdheid werden aangetoond met bisfenol A en sulfamethoxazole.