ADAR

C Enzyme-Substrate Recognition

Er is weinig bekend over hoe ADARs interageren met hun specifieke substraten en hoe de RNA bindingsdomeinen en het katalytische domein samenwerken tijdens de editing reactie. In tegenstelling tot de C-to-U RNA editing machinerie die een primair sequentie motief dicht bij de editing site gebruikt als kritische determinant voor substraat herkenning (Niswender, 1998), hebben de ADAR enzymen geen duidelijke intrinsieke sequentie specificiteit. In feite zullen zowel ADAR1 als ADAR2, wanneer zij volledig dubbelstrengs RNA moleculen aangeboden krijgen, tot 50-60% van alle adenosines in de sequentie bijna promiscu deamineren (Nishikura, 2010). De aanwezigheid van lussen, mismatches en uitstulpingen in de structuur van een RNA-substraat verhoogt echter de siteselectiviteit en, zoals bij sommige fysiologische ADAR-doelen het geval is, lijkt de ingewikkelde RNA-vouwing van zo’n substraat de toegang voor binding aan het RNA en de productieve katalyse vaak te beperken tot één enkel adenosine (Nishikura, 2010). Daarom is het mogelijk dat het grootste deel van de doelwit-specificiteit van A-to-I editing zich in de driedimensionale vouwing van het substraat bevindt. Recente op NMR gebaseerde structurele studies van ADAR RNA-bindende eiwitdomeinen in complex met minimale RNA-substraten geven echter aan dat individuele dsRNA-bindende domeinen ook betrokken kunnen zijn bij sequentiespecifieke contacten die kunnen bijdragen aan selectiviteit voor bepaalde RNA-doelen boven andere (Stefl et al, 2006, 2011).

Een andere eigenschap van ADAR’s die implicaties kan hebben voor substraatherkenning en -interactie is het besef dat voor productieve en hoog-actieve deaminatie de ADAR-eiwitten een dimeer vormen op het substraat (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potentieel kunnen zich zowel homo- als heterodimeren tussen ADAR-eiwitten vormen (Chilibeck et al., 2006) en vormen zij dus een andere regulatielaag die de substraatspecifieke herkenning en de RNA-editingactiviteit beïnvloedt. Aangezien er tot op heden geen bewerkingsdoelwit bekend is voor ADAR3 en dit eiwit geen enzymatische activiteit vertoont in standaard deaminase testen (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), is zijn rol gesuggereerd van regulerende aard te zijn via heterodimerisatie met de andere ADARs.

Verband met de vorming van ADAR dimers voor algemene bewerkingsactiviteit is de waarneming dat bepaalde RNA bewerkingsgebeurtenissen die binnen hetzelfde substraat plaatsvinden, positieve of negatieve koppeling vertonen. Bijvoorbeeld, adenosines direct naast elkaar of die zich aan dezelfde kant van de RNA duplex structuur (ongeveer 11 nt afstand binnen A-vorm RNA) vertonen vaak koppeling in de editing door ADARs waarschijnlijk als gevolg van hun nabijheid tot de katalytische site van het enzym in de ruimte (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

Ondanks deze inzichten, is het momenteel nog steeds niet mogelijk om een RNA editing site op basis van RNA primaire sequentie te voorspellen. Dit is vooral te wijten aan de complexe aard van RNA tertiaire structuren en hun dynamische gedrag. Zelfs wanneer men bedenkt dat dsRNA bindende domeinen kunnen bepaalde primaire sequentie motieven discrimineren over anderen, kunnen kleine veranderingen in de omringende primaire sequentie of secundaire en tertiaire structuur moduleren of zelfs overschrijven de sequentie-specifieke contacten. Als gevolg daarvan hebben pogingen om zoekalgoritmen te ontwikkelen die verschillende moleculaire kenmerken combineren (waaronder waarschijnlijkheid van basenparen, sequentieomgeving, sequentiebehoud) waarvan bekend is dat ze de waarschijnlijkheid van bewerking of de activiteit beïnvloeden, om potentiële bewerkingsplaatsen te voorspellen, geresulteerd in lange lijsten van kandidaat-posities in mRNA’s, maar slechts weinig nieuwe, plaats-selectieve modificatielocaties op hoog niveau zijn gevalideerd als bonafide in vivo doelwitten (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie en Maas, 2009). De dichotomie tussen de detectie van duizenden waarschijnlijke editing sites op basis van moleculaire kenmerken in pre-mRNAs en de schaarste van recoding sites op hoog niveau suggereert dat ofwel de voorspellingsalgoritmen lijden aan een hoog vals-positief percentage en de meeste van deze kandidaat posities niet worden bewerkt door ADARs, ofwel de experimentele detectie van RNA editing is het probleem en voor veel echte editing sites worden de verkeerde weefsels getest (cel-type specifieke editing) of ze worden getest op het verkeerde tijdstip (gereguleerde editing). Een andere mogelijkheid is dat de in vivo editing niveaus van de meeste sites zo klein zijn dat de huidige detectiemethoden niet gevoelig genoeg zijn om editing aan te tonen of te weerleggen.